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INTRODUZIONE
T helper 17 (TH17) cell, un CD4 unico+ Sottoinsieme di cellule T originariamente caratterizzato dalla produzione di interleuchina-17A (IL-17A) (1–3), è stata dimostrata come cellula patogena in una varietà di malattie autoimmuni tra cui la psoriasi, la sclerosi multipla, l'artrite reumatoide e la malattia infiammatoria intestinale (4–6). Gli anticorpi monoclonali (mAb) mirati a IL-17A sono stati approvati per il trattamento della psoriasi umana, dell'artrite psoriasica e della spondilite anchilosante (7, 8). L'asse IL-23 / IL-17 è criticamente coinvolto nella patogenesi della psoriasi, una malattia autoinfiammatoria caratterizzata da eritematoso, acantosi, parakeratosi e massiccia infiltrazione cutanea dei leucociti (9). Nella psoriasi, si ritiene che l'IL-23 derivi principalmente dalle cellule dendritiche (DC) che si infiltrano nella pelle, che è essenziale per indurre la produzione di IL-17A in vari tipi di cellule immunitarie, tra cui la TH17, cellule linfoidi innate del gruppo 3, γδ T (ILC3) (10–12). L'IL-17A agisce principalmente sui cheratinociti cutanei per indurre la produzione di varie citochine proinfiammatorie, chemochine e peptidi antimicrobici, che a loro volta hanno portato al reclutamento di neutrofili, macrofagi e altre cellule immunitarie e causano una risposta infiammatoria persistente nella pelle (13, 14).
La famiglia di citochine IL-17 comprende sei membri (da IL-17A a IL-17F) e la famiglia di recettori di IL-17 contiene cinque membri, tra cui IL-17RA e IL-17RE (15), in cui IL-17RA è considerato il recettore comune che si complessa con altri recettori della famiglia IL-17R per trasmettere segnali per citochine della famiglia IL-17. Ad oggi, il complesso dimero IL-17RA / IL-17RC è riconosciuto come l'unico recettore noto per l'eterodimero IL-17A, IL-17F e IL-17A / F basato su precedenti studi molecolari, biochimici e funzionali (16, 17). IL-17RD (noto anche come Sef), originariamente clonato da zebrafish durante lo sviluppo dell'embrione di zebrafish (18), è l'unico recettore orfano senza alcun ligando noto all'interno della famiglia IL-17R. L'IL-17RD dei mammiferi è principalmente espresso da cellule epiteliali, endoteliali e muscolari lisce, ma a malapena dai leucociti (15, 19). Quando sovraespresso, è stato riportato che IL-17RD forma un complesso con IL-17RA (20). Un recente studio lo ha dimostrato Il17rd deficit ha alterato il reclutamento di neutrofili dipendenti da IL-17 nel polmone, suggerendo un ruolo positivo di IL-17RD nella regolazione della segnalazione di IL-17A. Tuttavia, lo stesso rapporto ha anche indicato un ruolo negativo di IL-17RD nel mediare la segnalazione di IL-17A perché Il17rd-macrofagi carenti e fibroblasti embrionali di topo (MEF) hanno mostrato un'attivazione aumentata del fattore nucleare κB (NF-κB) su stimolazione IL-17A (19). Altri hanno riferito che IL-17RD potrebbe sopprimere l'attivazione di NF-κB indotta da IL-1 nelle cellule HeLa, 293T e U373 (21) o aumentare l'attività trascrizionale di NF-κB indotta dal fattore di necrosi tumorale – α (TNF-α) nelle cellule HK-2 (22). Nonostante questi risultati, l'esatto ligando e le funzioni biologiche dell'IL-17RD rimangono ancora sfuggenti.
In questo studio, nell'IL-17–si nota che l'infiammazione della pelle simile alla psoriasi dipendente Il17rc la delezione non ha abolito completamente l'infiammazione cutanea simile alla psoriasi indotta da imiquimod (IMQ), in contrasto con i topi IL-17A / F a doppio knockout (DKO). Abbiamo scoperto che IL-17RD, che era altamente espresso nei cheratinociti di topo e umani e che si legava selettivamente a IL-17A ma non a IL-17F o IL-17A / F, era richiesto anche per la patologia cutanea indotta da IMQ. Inoltre, i nostri dati hanno mostrato che IL-17RC e IL-17RD regolavano in modo differenziato le vie di segnalazione dell'IL-17A e l'espressione genica a valle nei cheratinociti, tra cui CXCL1, CCL20, e Il23a espressione e la loro carenza di composti hanno completamente compromesso le vie di segnalazione dipendenti da IL-17 e hanno causato la totale resistenza alle infiammazioni della pelle indotte dall'IMQ. I nostri dati evidenziano il ruolo di IL-17RD nella mediazione della segnalazione di IL-17A, che è importante nella patogenesi dell'infiammazione cutanea simile alla psoriasi.
RISULTATI
Il17rc deficit non abolisce completamente l'infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ
Sebbene il targeting di IL-17A o IL-17RA sia efficace nel trattamento della psoriasi, il ruolo di IL-17RC nelle malattie mediate da IL-17A non è stato esplorato. Qui, abbiamo generato il file Il17rc topi knockout (KO) con una delezione di 44 coppie di basi nell'esone 5 mediante la tecnologia CRISPR-cas9 per esaminare il suo ruolo nell'infiammazione guidata da IL-17A. Il17rc I topi KO sono nati normalmente e completamente carenti nell'espressione di IL-17RC (fig. S1A). È stata indotta l'infiammazione cutanea simile alla psoriasi indotta da IMQ Il17rccarente (Il17rc– / –) topi insieme a wild-type (WT) abbinato all'età e Il17a / f Controlli DKO. Dopo il trattamento con IMQ per 5 giorni, i topi WT hanno sviluppato un'infiammazione cutanea tipica della psoriasi che era quasi assente in Il17a / f Topi DKO (Fig. 1A). Però, Il17rc I topi KO hanno ancora sviluppato disturbi infiammatori cutanei parziali, inclusi livelli intermedi di spessore epidermico (Fig. 1A) e infiltrazione cutanea di neutrofili (Fig. 1, B e C) e cellule T γδ (Fig. 1D), rispetto a WT e Il17a / f Topi DKO. In linea con questo, l'espressione di geni correlati alla psoriasi, tra cui CXCL1, Ccl20 e Cxcl5, S100A8, S100A9e la molecola di adesione ICAM1 è stato significativamente ridotto in Il17rc Topi KO rispetto ai topi WT ma notevolmente più alti che in Il17a / f Topi DKO (Fig. 1E). Insieme, questi risultati suggeriscono che IL-17A può segnalare attraverso un recettore alternativo diverso dal complesso IL-17RA / IL-17RC nell'infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ.
WT, Il17a e Il17f DKO e Il17rc Topi KO (n = 10) sono stati sottoposti a infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ ed eutanizzati insieme ai topi WT non trattati 5 giorni dopo l'induzione della malattia. (UN) Colorazione rappresentativa H&E delle sezioni della pelle (10 ×) e dati statistici. (B per D) Le frequenze dei leucociti (B), dei neutrofili (C) e delle cellule T γδ (D) nel derma. (E) Il livello relativo di mRNA di geni selezionati dalla pelle totale. I risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. I dati sono stati mostrati come media ± SEM. P i valori sono stati determinati da spaiati t test o ANOVA a senso unico, seguito dal test post hoc di Tukey. *P <0,05 rispetto al gruppo indicato.
IL-17RD funziona come recettore dell'IL-17A nei cheratinociti di topo
Per determinare se IL-17A potrebbe segnalare attraverso i recettori alternativi, abbiamo testato l'interazione del topo IL-17A (mIL-17A) con IL-17RA murino, IL-17RC e IL-17RD sovraespresso in cellule 293T. mIL-17A potrebbe anche legare mIL-17RD, oltre a mIL-17RA e mIL-17RC. Al contrario, nessuna delle altre citochine della famiglia IL-17 ha mostrato un legame significativo con mIL-17RD (Fig. 2A e Fig. S2, A e B).
(UN) Il legame delle citochine della famiglia IL-17 marcate con His (da IL-17A a IL-17F) alle cellule 293T che esprimono IL-17RD. (B) L'interazione tra IL-17RA / IL-17RD e IL-17-RD / IL-17RD rilevata da BiFC. (C) Il legame di IL-17A con IL-17RA / IL-17RD o IL-17-RD / IL-17RD che esprime le cellule 293T. FITC, isotiocianato di fluoresceina. (D) Il legame delle citochine della famiglia IL-17 al dimero IL-17RA / IL-17RD o IL-17-RD / IL-17RD. (E) L'interazione tra IL-17RA / IL-17RD e IL-17-RD / IL-17RD rilevata mediante immunoprecipitazione. IP, immunoprecipitazione; IB, immunoblot. (F) L'interazione tra mIL-17RA e mIL-17RD nei cheratinociti primari di topo. (sol) La colocalizzazione di mIL-17RA e mIL-17RD nei cheratinociti di topo primari. (Da A a G) I risultati mostrati sono dati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. DAPI, 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindolo; PE, ficoeritrina. (H) I livelli relativi di mRNA di geni selezionati da cheratinociti di topo primari stimolati con diverse citochine (media ± SEM). Tutti i risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. P i valori sono stati determinati da spaiati t test. *P <0,05 rispetto al gruppo indicato.
Inoltre, nella complementazione della fluorescenza bimolecolare (BiFC), abbiamo sovraespresso mIL-17RA, mIL-17RC e / o mIL-17RD come proteine di fusione con N-terminale (YFPN) o YFP C (YFPN) di proteina fluorescente gialla ( YFPC) nelle cellule 293T, rispettivamente, e ha scoperto che i segnali fluorescenti gialli erano chiaramente rilevati nelle cellule che coesistevano YFPN-RA e YFPC-RD o YFPN-RD e YFPC-RD ma non nelle cellule che coesistevano YFPC-RD e YFPN-RC, suggerendo interazioni tra mIL-17RA e mIL-17RD o mIL-17RD – mIL-17RD interazioni omotipiche (Fig. 2B). mIL-17A preferibilmente legato alle cellule alte YFP che esprimono i dimeri mIL-17RA / mIL-17RD o mIL-17RD / mIL-17RD (Fig. 2C), che non è stato osservato per altre citochine della famiglia IL-17, tra cui mIL-17F ( Fig. 2D). Inoltre, mIL-17RA o mIL-17RD marcato con emoagglutinina (HA), ma non mIL-17RC, potrebbe essere coimmunoprecipitato da un anticorpo contro mIL-17RD marcato a bandiera in cellule 293T (Fig. 2E), suggerendo la presenza di mIL- Complessi dimeri 17RA / mIL-17RD e mIL-17RD / mIL-17RD nel sistema di sovraespressione, supportando ulteriormente IL-17RD come potenziale recettore per IL-17A.
Per testare l'interazione del recettore in condizioni fisiologiche, abbiamo valutato il legame di mIL-17RD con mIL-17RA nei cheratinociti primari. mIL-17RD potrebbe essere facilmente coimmunoprecipitato con mIL-17RA con o senza trattamento mIL-17A, suggerendo che la formazione di eterodimeri mIL-17RA / mIL-17RD era indipendente dal ligando (Fig. 2F). Il risultato è stato ulteriormente confermato dalla colocalizzazione di mIL-17RA e mIL-17RD nei cheratinociti primari di topo secondo i test di microscopia confocale (Fig. 2G). Inoltre, usando i metodi di reticolazione e immunoprecipitazione, abbiamo trovato eterodimeri mIL-17RA / mIL-17RD ma non omodimeri mIL-17RD / mIL-17RD come la forma predominante del complesso recettoriale contenente IL-17RD nei cheratinociti primari di topo (fig. S2C).
Per valutare se mIL-17RD potrebbe regolare funzionalmente la segnalazione IL-17A, WT o Il17rd I cheratinociti di topo primari KO sono stati stimolati con mIL-17A, mIL-17C o mIL-25 e quindi sono stati valutati per le espressioni geniche proinfiammatorie correlate alla psoriasi. mIL-17A-indotta CXCL1, Cxcl2, S100A9, e CCL20 l'espressione è stata inibita dall'assenza di Il17rd, mentre l'espressione genica dipendente da IL-17C– o IL-25 non è stata influenzata, suggerendo un ruolo selettivo per IL-17RD nella mediazione della segnalazione a valle di IL-17A (Fig. 2H e fig. S2D).
IL-17RD funziona come recettore per IL-17A nei cheratinociti umani
Per convalidare la rilevanza umana dei nostri dati, abbiamo sovraespresso IL-17RD umano (hIL-17RD) in cellule 293T. Simile ai risultati nel sistema murino, hIL-17A legato hIL-17RD (Fig. 3A), che potrebbe anche essere facilmente coimmunoprecipitato con hIL-17RA in cellule HaCaT e cheratinociti umani primari e colocalizzare con hIL-17RA (Fig. 3, Da B a D) anche senza stimolazione con hIL-17A (Fig. 3C), suggerendo ancora una interazione indipendente dal ligando tra hIL-17RA e hIL-17RD (Fig. 3C).
(UN) Il legame tra hIL-17 marcato con biotina e cellule 293T che esprimono hIL-17RD. (B) L'interazione tra hIL-17RA e hIL-17RD nella linea cellulare dei cheratinociti umani (HaCaT) dopo stimolazione con hIL-17A. (C) L'interazione tra hIL-17RA e hIL-17RD nei cheratinociti umani primari. (D) Colocalizzazione di hIL-17RA e hIL-17RD nei cheratinociti di topo primari. (E) Il livello relativo di mRNA di geni selezionati da WT o IL17RD cheratinociti umani primari knockdown (KD) stimolati con hIL-17A (significa ± SEM). (F) Il livello di mRNA di IL-17RC e IL-17RD nei pazienti con psoriasi (significa ± SEM). (sol) Il livello proteico di IL-17RD nei pazienti con psoriasi (significa ± SEM). GAPDH, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. (Da A a F) Tutti i risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. P i valori sono stati determinati da spaiati t test. (Dalla A alla G) P <0,05 rispetto al gruppo indicato e ****P <0,0001 rispetto ai pazienti normali.
Per esaminare se IL-17RD è anche coinvolto nella segnalazione hIL-17A, l'essere umano IL17RD espressione è stata abbattuta nei cheratinociti umani primari da lentivirus di RNA (shRNA) mediato da forcina per capelli e l'efficienza del knockdown è stata testata dalla macchia occidentale (fig. S1, B e C). Simile ai risultati del topo, anche l'espressione genica indotta da hIL-17A è stata ridotta di IL17RD knockdown (Fig. 3E), incluso CXCL1, CXCL2, CCL20, e S100A8, noto per essere coinvolto nel progresso patologico della psoriasi, suggerendo un ruolo conservato di IL-17RD tra uomo e topo.
L'IL-17RD è necessario per l'infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ
Per comprendere il ruolo in vivo di IL-17RD, abbiamo sottoposto il Il17rdcarente (Il17rd– / –) topi alle infiammazioni della pelle indotte da IMQ. Simile a Il17rc Topi KO, i cambiamenti patologici indotti dall'IMQ erano diminuiti ma ancora evidenti Il17rd Topi KO confrontati con topi WT e controlli non trattati (Fig. 4A e fig. S3A). I neutrofili e le cellule T γδ erano entrambi ridotti nella cute lesionata Il17rd Topi KO contro WT (Fig. 4, da B a D), suggerendo una riduzione della risposta infiammatoria in situ nei topi KO. Tuttavia, non è stata rilevata alcuna differenza negli ILC3 cutanei (Fig. 4E). Nel linfonodo drenante della pelle (dLN), Il17rd I topi KO hanno mostrato una popolazione γδ T leggermente aumentata, mentre il CD4+ La frequenza delle cellule T è rimasta sostanzialmente normale (fig. S3B).
WT e Il17rd I topi KO sono stati sottoposti a infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ ed eutanasia il giorno 5 dopo l'induzione della malattia insieme ai topi non trattati (n = 10). (UN) Sezioni rappresentative della pelle colorante H&E (10 ×) e dati statistici. (B per C) Le frequenze e il numero assoluto di cellule dei leucociti (B) e dei neutrofili (C) nel derma. (D per E) Le frequenze delle cellule T γδ (D) e ILC3s (E) nel derma. (F) Il livello relativo di mRNA di geni selezionati dalla pelle totale. Tutti i risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. I dati sono stati mostrati come media ± SEM. P i valori sono stati determinati da spaiati t test o ANOVA a senso unico, seguito dal test post hoc di Tukey. *P <0,05 rispetto a WT e #P <0,05 rispetto a non trattato.
Abbiamo anche analizzato l'espressione di mRNA di chemochine e citochine proinfiammatorie nel tessuto cutaneo totale da Il17rd Topi KO o WT dopo il trattamento IMQ. L'espressione di CXCL1 e CCL20, sono state ridotte due chemiochine responsabili del reclutamento di neutrofili e linfociti (Fig. 4F), nonché i peptidi antimicrobici S100A8 e S100A9, chemochina CXCL5e molecola di adesione ICAM1 (Fig. 4F). È evidente che i fenotipi sono presenti Il17rd KO, caratterizzato da una ridotta acantosi, infiltrazione cutanea dei leucociti e espressione dei geni correlati alla psoriasi, è apparso più debole di quello Il17rc KO (fig. S3A).
Per valutare ulteriormente la funzione di IL-17RD, abbiamo adottato un modello di applicazione IMQ cronica (23), in cui IMQ è stato dipinto sulle orecchie dei topi per 15 giorni. Coerenza con il modello a breve termine, Il17rd KO ha ridotto significativamente l'infiammazione dell'orecchio come giudicato dallo spessore in Il17rd Topi KO rispetto ai topi WT (fig. S3C). Insieme, questi risultati suggeriscono un ruolo importante e necessario dell'IL-17RD nella risposta infiammatoria della pelle dipendente dall'IL-17A.
L'espressione di IL-17RD nei cheratinociti è importante per l'infiammazione della pelle simile alla psoriasi in vivo
Per comprendere i meccanismi con cui IL-17RD funziona nell'infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ, abbiamo esaminato l'espressione di IL-17RD in diversi compartimenti cellulari della pelle. Il Il17rd L'mRNA è stato appena rilevato nei leucociti derivati dalla pelle, ma era altamente espresso nei cheratinociti nei topi sani (Fig. 5A), in particolare l'isoforma a lunghezza intera (accessione GenBank n. BC138629.1) ma non nella versione breve riportata da Rong et al. (24) (Accesso GenBank n. AF494209.1). Nell'infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ, il trattamento IMQ è sovraregolato Il17rd trascrizione in CD45– ma non in CD45+ cellule (Fig. 5A). Coerentemente, la proteina IL-17RD è stata espressa da quasi tutte le cellule nucleate nell'epidermide (compresi strato basale ed epitelio squamoso stratificato), che sono in gran parte composte da cheratinociti, e ulteriormente aumentate dopo il trattamento IMQ come determinato dall'immunofluorescenza (fig. S4A).
(UN) Espressione di IL-17RD nel tessuto cutaneo dei topi WT (n = 4). Sinistra: livello relativo di mRNA di Il17rd nella pelle totale e diversi tipi di cellule dalla pelle allo stato stazionario. N / A, non applicabile. A destra: livello relativo di mRNA di Il17rd dalla pelle totale, CD45– celle e CD45+ cellule della pelle di topi WT trattate con o senza IMQ per 5 giorni (n = 5). *P <0,05 rispetto alla pelle totale e #P <0,05 rispetto al gruppo indicato. (B per D) Le frequenze di leucociti ((B), in alto), neutrofili ((B), in basso), cellule T γδ (C) e ILC3s (D) nel derma dei topi chimerici (n = 6). n.s., non significativo. (E) Il livello relativo di mRNA di geni selezionati dalla pelle totale dei topi chimerici. I risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. I dati sono stati mostrati come media ± SEM. P i valori sono stati determinati da spaiati t test o ANOVA a senso unico, seguito dal test post hoc di Tukey. *P <0,05 rispetto al gruppo indicato.
Per determinare ulteriormente la fonte e la funzione di IL-17RD, abbiamo stabilito un modello di infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ usando Il17rd topi chimerici del midollo osseo (fig. S4B). Di conseguenza, il deficit di IL-17RD nelle cellule non ematopoietiche (topi da WT a KO e da KO a KO) ha mostrato una ridotta infiammazione della pelle simile alla psoriasi rispetto ai topi chimerici WT che hanno ricevuto WT o Il17rd Midollo osseo KO, caratterizzato da una ridotta infiltrazione cutanea di leucociti e neutrofili totali (Fig. 5B). Coerentemente con i topi KO germinali, le cellule T γδ, ma non con gli ILC3, erano significativamente ridotti nella pelle lesionale dei topi chimerici con deplezione non ematopoietica di IL-17RD (topi WT a KO e KO a KO) rispetto ai topi chimerici WT (Fig. 5 , C e D). Nei dLN cutanei, sono stati osservati topi privi di IL-17RD nelle cellule non ematopoietiche (da WT a KO e da KO a KO) con frequenze T γδ leggermente aumentate rispetto ai topi da WT a WT e da KO a WT, mentre le frequenze di CD4+ Le cellule T erano comparabili tra i gruppi (fig. S4C). In linea con questo, l'espressione dei geni proinfiammatori associati alla psoriasi è stata ridotta anche nei topi chimerici con deplezione non ematopoietica di IL-17RD (Fig. 5E). Considerando che Il17rd deficit ridotto in modo significativo l'espressione genica proinfiammatoria indotta da IL-17 nei cheratinociti, questi dati insieme indicano un ruolo essenziale dell'IL-17RD derivato dai cheratinociti nelle infiammazioni della pelle dipendenti dall'IL-17A.
Contrariamente ai risultati dei modelli murini, i recettori della famiglia IL-17, in particolare quei recettori specifici per citochine, tra cui IL-17RC (per IL-17A), IL-17RE (per IL-17C) e IL-17RB (per IL-25), così come IL-17RD, erano tutti notevolmente diminuiti rispetto ai controlli sani e solo il recettore comune, IL-17RA, era aumentato nei pazienti umani con psoriasi (25), che è stato confermato anche dai nostri studi (Fig. 3, F e G). È possibile che un'espressione ridotta di IL-17RD e IL-17RC possa essere causata dalla regolazione del feedback negativo della segnalazione persistente di IL-17A durante l'infiammazione cronica, mentre il livello di espressione basso ma non zero di questi recettori è ancora funzionale.
Il17rd la carenza ha un effetto globale sull'espressione genica mediata da IL-17A nei cheratinociti
Per comprendere la funzione generale di IL-17RD nella segnalazione di IL-17A, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) con WT e Il17rd Cheratinociti di topo primari KO dopo il trattamento di IL-17AIl17rd geni espressi in modo differenziato elencati nel file di dati S1) insieme al controllo WT non trattato. In totale, 1170 geni up-regolati dell'IL-17A, di cui 315 (26,9%) sono stati ridotti Il17rd Cheratinociti KO, mentre solo 11 sono stati ulteriormente sovraregolati di conseguenza Il17rd carenza (> cambiamento di 2 volte, P <0,05). IL-17A ha inibito 1296 geni, tra cui 689 geni erano up-regolati e 8 erano down-regolati a causa di Il17rd carenza (> cambiamento di 2 volte, P <0,05). Questo risultato supporta saldamente IL-17RD come recettore funzionale per IL-17A.
Per comprendere ulteriormente la funzione di IL-17RD, abbiamo eseguito l'analisi del percorso KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Tra i primi 15 percorsi up-regolati di IL-17A (P <0,001), molti erano associati alla proliferazione cellulare (ciclo cellulare, replicazione del DNA) e segnalazione proinfiammatoria (via di segnalazione IL-17, interazione del recettore citochine-citochine e via di segnalazione TNF) e otto dipendevano da IL-17RD, incluso IL- 17 via di segnalazione, via di segnalazione TNF e interazione del recettore citochine-citochine. Nonostante i modelli di regolazione genica altamente coerenti, Il17rd carenza non ha ridotto l'espressione genica dipendente dall'IL-17A a livelli basali come nelle cellule non stimolate (Fig. 6C), sostenendo nuovamente IL-17RD come importante recettore dell'IL-17A nei cheratinociti.
(UN) Le percentuali di geni correlati a IL-17RD tra tutti i geni regolati da IL-17A. (B) Analisi dei percorsi del KEGG dei percorsi correlati a IL-17RD (contrassegnati da “*”) tra i percorsi verso l'alto e verso il basso regolati da IL-17A. (C) Verificare il livello di mRNA dei geni selezionati da WT e Il17rd Cheratinociti di topo primari KO mediante qPCR (significa ± SEM). PPAR, recettore attivato dal proliferatore del perossisoma; AGE-RAGE, prodotti finali di glicazione avanzata e loro recettore. P i valori sono stati determinati dall'ANOVA a senso unico, seguito dal test post hoc di Tukey. #P <0,05 rispetto al WT non trattato e *P <0,05 rispetto al WT trattato con IL-17A.
Sia IL-17RC che IL-17RD regolano la segnalazione di IL-17A nei cheratinociti
Il nostro studio di cui sopra ha mostrato che IL-17RC e IL-17RD erano reciprocamente importanti nella risposta infiammatoria della pelle simile alla psoriasi IL-17-dipendente. Per comprendere la base delle loro funzioni differenziali, determiniamo la loro affinità di legame con mIL-17A mediante studi di legame di saturazione usando proteine di fusione purificate mIL-17RC – hIg o mIL-17RD – hIg. IL-17A legato a IL-17RD con un'affinità circa 20 volte inferiore rispetto a IL-17RC, con concentrazione mediana effettiva (EC50) di 2,57 e 0,126 nM, rispettivamente (Fig. 7A), che possono rappresentare i fenotipi relativamente più deboli in Il17rd KO di Il17rc Topi KO nel modello di infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ.
(UN) Il legame di saturazione di IL-17RC – ecd e IL-17RD – ecd a IL-17A (significa ± SEM). CBS, soluzione salina tamponata con citrato; OD, densità ottica. (B) Fosforilazione di p38, IκB, Erk e JNK nei cheratinociti di topo primari coltivati con IL-17A per diversi punti temporali. I risultati mostrati sono dati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (C) Heatmap di dati RPKM normalizzati da WT, Il17rc KO e Il17rd Cheratinociti KO trattati con IL-17A. I principali percorsi arricchiti di ciascun cluster sono stati elencati a parte. HTLV-I, virus della leucemia a cellule T umane I. (D) Diagramma di Venn che mostra i numeri e la sovrapposizione dei geni espressi in modo differenziato (rispetto al WT trattato con IL-17A) tra i quattro confronti. (E) I percorsi che sono comunemente down-regolati da Il17rc e Il17rd KO.
In linea con gli studi di cui sopra, Il17rc / Il17rd I cheratinociti DKO erano completamente difettosi nell'attivazione indotta da IL-17A di NF-κB, chinasi proteiche attivate dal mitogeno p38 (p38), chinasi regolate dal segnale extracellulare (ERK) e chinasi N-terminale N-terminale (JNK), mentre Il17rc I cheratinociti KO hanno mostrato una riduzione dell'attivazione di NF-κB e hanno abolito la fosforilazione di p38 e ERK e JNK in risposta a IL-17A (Fig. 7B e Fig. S6). Come un confronto, Il17rd la carenza ha portato a un difetto relativamente più lieve nella segnalazione di NF-κB ed ERK ma ha abolito l'attivazione di p38 e JNK dopo il trattamento con IL-17A (Fig. 7B).
Per comprendere ulteriormente le funzioni distinte e ridondanti di IL-17RC e IL-17RD nella segnalazione di IL-17A, abbiamo condotto l'analisi RNA-seq su WT stimolato da IL-17A, Il17rc KO e Il17rd KO cheratinociti di topo primari e confrontati (Fig. 7C). Insieme, Il17rc e Il17rd carenza ha portato all'espressione disregolata di 1813 geni se confrontata con cheratinociti WT dopo stimolazione con IL-17A (variazione> 2 volte, q <0,05). I geni espressi in modo differenziato nel 1813 furono divisi in sei diversi cluster da K– significa clustering: cluster 1, up-regolato in entrambi Il17rc e Il17rd KO; cluster 2, down-regolato in entrambi Il17rc e Il17rd KO; cluster 3, up-regolato solo in Il17rc KO; cluster 4, up-regolato solo in Il17rd KO; cluster 5, down-regolato solo in Il17rc KO; e cluster 6, down-regolato solo in Il17rd KO. L'analisi del pathway di KEGG è stata eseguita su geni espressi in modo differenziale in ciascun cluster e sono stati identificati i percorsi arricchiti superiori di ciascun cluster (Fig. 7C). In particolare, i geni espressi in modo differenziato sono regolati verso il basso in entrambi Il17rc e Il17rd Le KO (cluster 2) erano principalmente associate all'interazione dei recettori citochine-citochine e al percorso di segnalazione di IL-17A, suggerendo funzioni sovrapposte di IL-17RC e IL-17RD nella mediazione della segnalazione di IL-17A. I geni nel cluster 5 (geni unici regolati positivamente dall'IL-17RC) erano specificamente associati alla via di segnalazione della protein chinasi attivata dal mitogeno, e i geni nel cluster 6 (geni unici regolati positivamente dall'IL-17RD) erano correlati al metabolismo del colesterolo, suggerendo funzioni uniche di IL-17RC e IL-17RD oltre al loro ruolo comune nella regolazione della segnalazione di IL-17A.
Il diagramma di Venn è stato utilizzato per analizzare il numero di geni sovrapposti espressi in modo differenziale (confrontando con il WT trattato con IL-17A) in Il17rc KO up-regolato, Il17rc KO down-regolato, Il17rd KO up-regolato, e Il17rd KO gruppi down-regolati (Fig. 7D). Oltre il 50% dei geni era sovrapposto tra i due KO, suggerendo che la maggior parte dei geni era comunemente regolata da IL-17RC e IL-17RD. È evidente che la maggior parte dei geni sovrapposti erano comunemente up-regolati (524 geni) o down-regolati (254 geni) in entrambi Il17rc e Il17rd Cellule KO. Abbiamo scoperto che solo 16 geni erano up-regolati in un KO ma down-regolati nell'altro. Questo risultato indica fortemente le funzioni sovrapposte di IL-17RC e IL-17RD.
L'analisi del pathway KEGG è stata eseguita sui geni espressi in modo differenziale (254 geni) comunemente down-regolati in entrambi Il17rc e Il17rd Cellule KO. Di conseguenza, le prime 10 vie erano principalmente associate a funzioni proinfiammatorie, tra cui via di segnalazione IL-17A, via di segnalazione TNF, via di segnalazione chemiochine e vie di interazione del recettore citochine-citochine (Fig. 7E). Abbiamo ulteriormente verificato l'espressione di alcuni geni strettamente correlati allo sviluppo della psoriasi mediante reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (RT-qPCR). L'espressione di Il23a, CXCL1, Cxcl2, e CCL20 è stato influenzato da entrambi Il17rc e Il17rd carenza (figg. S6 e S7). Tuttavia, l'espressione delle citochine della famiglia IL-1 Il1f6 e Il1f8 era regolato in modo univoco da IL-17RC. Nel frattempo, IL-17RD sembrava essere più importante per l'espressione dei geni di risposta epidermica correlati alla psoriasi TGFA e Csf3 (fig. S6). Inoltre, abbiamo anche testato i ruoli di IL-17RC e IL-17RD nella regolazione della segnalazione di IL-17A / F o IL-17F. L'espressione genica mediata da IL-17A / F– e IL-17F era difettosa solo in Il17rc ma no Il17rd Cheratinociti KO (fig. S8, A e B), che indicano che IL-17RD è selettivamente richiesto per IL-17A ma non per IL-17A / F o IL-17F.
IL-17A regola l'espressione di IL-23 nei cheratinociti
Le cellule mieloidi sono generalmente considerate la principale fonte di IL-23 nella risposta infiammatoria. Tuttavia, IL-23 può anche essere espresso dai cheratinociti nei pazienti umani con psoriasi (26) ed è importante per l'infiammazione cronica della pelle in un modello murino di psoriasi (27). In questo studio, abbiamo scoperto che IL-17A ha indotto direttamente l'espressione di mRNA di Il23a e IL12B che codificano le due subunità IL-23 (Fig. 8A) e il livello proteico di IL-23 nei cheratinociti (fig. S9A), dipendente sia da IL-17RC che da IL-17RD. Al contrario, la subunità specifica per IL-12 Il12a non è stato aumentato (Fig. 8A). D'altra parte, IL-1α, IL-1β e TNF-α non potevano indurre o aumentare ulteriormente l'espressione di IL-23, da solo o in combinazione con IL-17A. Questi dati suggeriscono insieme un ruolo specifico e selettivo di IL-17A nell'indurre l'espressione di IL-23 (Fig. 8B). Coerentemente, indotto da IL-17A Il23a l'espressione era Atto 1 dipendente e potrebbe essere bloccato dagli inibitori NF-κB o ERK (fig. S9, B e C).
I cheratinociti del topo primario sono stati coltivati e stimolati con IL-17A (UN) o citochine indicate (B) in vitro. Il livello relativo di mRNA di Il23a, Il12a, e IL12B è stato rilevato da qPCR. *P <0,05 rispetto a WT non trattato e #P <0,05 rispetto al WT trattato con IL-17A. (C) Colorazione di immunofluorescenza di IL-23 nelle sezioni cutanee di WT, Il17rd KO, Il17rc KO e Il17a e Il17f Topi DKO trattati con IMQ. MFI, intensità di fluorescenza mediana. (D per F) Colorazione rappresentativa H&E delle sezioni cutanee (D), frequenza delle cellule T γδ (E) e livello relativo di mRNA di Il23 dalla pelle totale (F) in Il23 topi chimerici. *P <0,05 rispetto al gruppo indicato. EM, matrice extracellulare. (sol e H) Il relativo Il23 livello di mRNA (G) e numero assoluto (H) di cheratinociti, cellule di Langerhans, DC cutanee e macrofagi nella cute di WT e Il17rd Topi KO. (io) Il livello relativo di mRNA di Il23a dalla pelle totale. I risultati sono stati ripetuti tre volte con risultati coerenti. I dati sono stati mostrati come media ± SEM. P i valori sono stati determinati da spaiati t test o ANOVA a senso unico, seguito dal test post hoc di Tukey. *P <0,05 rispetto a WT e #P <0,05 rispetto a non trattato.
Nel modello di infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ, l'espressione di IL-23 è stata osservata sia nell'epidermide che nel derma nei topi WT sulla base della colorazione con immunofluorescenza (Fig. 8C). Tuttavia, l'espressione di IL-23 nell'epidermide era significativamente ridotta in Il17rd KO o Il17rc KO topi ed era quasi assente nel Il17a / f Topi DKO (Fig. 8C), supportando nuovamente un ruolo critico e selettivo dell'IL-17A nella regolazione dell'IL-23 derivata dai cheratinociti in contesti in vivo.
Nel modello di infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ, si pensava che IL-23 derivasse principalmente da DC e macrofagi cutanei (11). Per esplorare l'importanza funzionale dell'IL-23 espressa dai cheratinociti, abbiamo stabilito un modello di infiammazione della pelle simile alla psoriasi indotta da IMQ usando Il23a Topi chimerici del midollo osseo KO. Abbiamo scoperto che i topi chimerici che ricevevano midollo osseo WT avevano una psoriasi più grave rispetto a quelli che ricevevano midollo osseo WT KO, caratterizzato da acantosi grave (Fig. 8D), aumento delle frequenze di infiltrazione cutanea CD45+ cellule (fig. S10A) e γδ cellule T (fig. 8E), ed elevate Il23a Espressione di mRNA (Fig. 8F), suggerendo che IL-23 derivato da cellule ematopoietiche era davvero importante per la progressione della psoriasi. Differenze significative sono state osservate anche tra topi riceventi WT e KO che ricevono midollo osseo WT in termini di frequenza delle cellule T γδ e Il23a livello di mRNA (Fig. 8, E e F), suggerendo che IL-23 derivato da cellule radio-resistenti è importante anche nello sviluppo di una completa infiammazione cutanea simile alla psoriasi.
Per esaminare se IL-17RD regola anche la produzione di IL-23 in diversi tipi di cellule, abbiamo isolato vari tipi di cellule dal WT trattato con IMQ e Il17rd KO topi e li ha analizzati per Il23 espressione. Il17rd carenza non ha influenzato la trascrizione di Il23a nelle cellule di Langerhans, DC cutanee e macrofagi o loro numeri (Fig. 8, G e H). In contrasto, Il17rd deficiency not only reduced the level of keratinocyte-derived IL-23 but also the number of keratinocytes (Fig. 8, G and H), possibly because of diminished acanthosis in Il17rd mice. Consistent with the immunofluorescence staining data, Il17rd deficiency caused an overall reduction of Il23a mRNA expression in the total lesional skin (Fig. 8I). These data together suggest that Il17rd–dependent IL-23 expression in nonhematopoietic cells, specifically keratinocytes, represents a significant source of IL-23 in skin inflammations.
In line with the role of IL-23, Il17rd deficiency reduced the frequencies of IL-17+ γδ T and ILC3 cells compared with WT control mice (fig. S10B), as well as Il17a mRNA level in the lesional skin (fig. S10C), but did not affect Il17c, Il25, e Il17f expressions (fig. S10C). Our findings thus demonstrate an IL-17A–dependent expression of IL-23 in keratinocytes, which could serve as an additional positive feed-forward loop in sustaining the well-known IL-23 → IL-17 axis in psoriasis-like skin inflammation.
DISCUSSION
In this study, we identified the orphan receptor IL-17RD as a functional receptor for IL-17A. In the IMQ-induced psoriasis-like skin inflammation, IL-17A signals through both IL-17RC and IL-17RD to activate downstream proinflammatory gene expression, and deficiency in either IL-17RC or IL-17RD resulted in partially defective IL-17A signaling in keratinocytes and partial resistance to the IMQ-induced psoriasis-like skin inflammation, whereas deficiency in both IL-17RC and IL-17RD caused complete loss of IL-17A signaling.
To date, the IL-17RA/IL-17RC complex has been widely known as the only receptor for IL-17A, IL-17F, and IL-17A/F heterodimer (28, 29). Recent studies suggest that IL-17RD could affect IL-17A signaling or gene expressions in MEFs according to reporter assays (20) and in bone marrow–derived macrophages and U373 cells through shRNA knockdown experiments (19). It is also reported that IL-17RD could interact with IL-17RA in MEFs and NIH3T3 cells and with TRAF6, an adaptor protein essential for IL-17 signaling, under overexpression system (20). Despite these findings, IL-17RD has not been proposed as an alternative receptor for IL-17A due to lack of evidences of direct interaction between IL-17A and IL-17RD, as well as the function of IL-17RD in IL-17A–dependent physiological process. In this study, we showed that IL-17A could physically interact with IL-17RD in both purified protein forms and in cell-based system. In addition, IL-17RD could form heterodimer with IL-17RA based on coimmunoprecipitation, BiFC, and confocal microscopy studies not only in 293T cells under overexpressed levels but also in both mouse and human primary keratinocytes under endogenous expression level. Il17rd deficiency dampened IL-17A downstream signaling, particularly p38 and JNK activation, and reduced a significant portion (26.9%; 315 versus 1170 genes) of IL-17A–induced proinflammatory gene expression in keratinocytes, including a large number of genes involved in psoriasis or psoriasis-like skin inflammation, such as Cxcl1, Ccl20, e S100a9, key inflammatory mediators in psoriasis. IL-17RD has an even more pronounced effect on IL-17A–inhibited gene expression, among which 53.1% (689 versus 1296 genes) were dependent on IL-17RD. Consistent with these findings, Il17rd deficiency partially ameliorated IMQ-induced IL-17A–dependent psoriasis-like skin inflammation. Thus, our molecular, cellular, and functional studies together established IL-17RD as a functional receptor for IL-17A, at least in keratinocytes.
In this study, we also did a side-by-side comparison between IL-17RC and IL-17RD in their function and signaling. In contrast to IL-17RC, our data show that IL-17RD exclusively binds IL-17A, but not IL-17F or IL-17A/F, and that Il17rd deficiency does not affect IL-17F– or IL-17A/F–mediated gene expression. IL-17F is also indicated in the pathogenesis of psoriasis (30), which may be one of the reasons why the phenotypes of Il17rc deficiency were stronger than Il17rd deficiency in IMQ-induced psoriasis-like skin inflammation. Another reason could be caused by its weaker binding affinity with IL-17A than IL-17RC (~20-fold less), which is also reflected by the fact that Il17rc deficiency largely abolished IL-17A–induced activation of p38, JNK, NF-κB, and ERK signaling in keratinocytes, whereas Il17rd deficiency mainly impaired p38 and JNK activation but barely affected NF-κB and ERK signaling pathways. The identification of IL-17RD as a selective receptor for IL-17A could be useful in developing more specific therapeutic strategies against IL-17A–dependent inflammatory diseases, although its function in tissues other than skin needs further elucidation. Transcriptome analysis suggests that the functions of IL-17RC and IL-17RD were largely overlapped, particularly in regulating genes involved in proinflammatory responses. It is unclear why both receptors are required in the same cell type for IL-17A signaling. Considering the overlapping functions between IL-17RC and IL-17RD, it is possible that one receptor could compensate for the loss of the other receptor and may even enhance certain aspects of IL-17A signaling under certain conditions, which may explain the controversial results in the literature on IL-17RD functions. Among the few uniquely regulated genes, IL-17RC specifically regulates cell cycle–related genes, whereas IL-17RD selectively regulates cholesterol metabolism-related genes. It has been reported that cholesterol depletion significantly reduced the expression of IL-17A–induced Ccl20, Il8, e S100a7 expression in keratinocytes, which was also dependent on IL-17RD.
The IL-23/IL-17 axis has been identified as the major pathogenic driver in development of psoriasis (7, 11). Consistent with a recent study that keratinocyte-derived IL-23 is important in the pathogenesis of psoriasis (27), our study showed that nonhematopoietic cell–derived IL-23 constituted a significant portion of total skin IL-23 pool and was required for the full development of psoriasis-like skin inflammation. Moreover, our studies find that IL-17A could directly stimulate IL-23 expression in keratinocyte via both the IL-17RC and IL-17RD receptors. Previous studies have shown DCs and macrophages as an important source role of IL-23 in psoriasis-like skin inflammation, which was also confirmed in our mix bone marrow chimera studies. It is possible that the hematopoietic source of IL-23 plays a crucial role in initiating the differentiation or activation of IL-17A–producing cells, whereas the local keratinocyte-derived IL-23 is important in sustaining the IL-23/IL-17 axis in chronic skin inflammatory diseases.
In summary, our work has demonstrated IL-17RD as a functional receptor for IL-17A in vitro and in vivo. Although its role in other IL-17A–related inflammation need to be further explored, our study reveals the complexity of receptor/ligand interaction in the IL-17 family. Further investigation might benefit developing more specific targeting strategy in treatment of IL-17–related immune diseases.
MATERIALS AND METHODS
Study design
The objective of this study was to explore the role of the orphan receptor IL-17RD in psoriasis-like skin inflammation. The sample size (n = 10) was determined by power analysis (power, 0.83), the sex of the mice (female only) was determined according to previous studies, and the endpoint (5 days) was determined according to our own kinetic studies. The mice were randomly assigned to different groups, and repeat experiments were carried out by two to three times. The investigators were not blinded when conducting or analyzing the experiments, and no data were excluded.
Mice
Il17rd−/− (31) e Il23a−/− mice were obtained from the Mutant Mouse Regional Resource Center (National Institutes of Health). Il17rc−/− mice were generated by CRISPR-Cas9 as described (see the Supplementary Materials) (32). Il17a (29) e Il17f DKO (Il17a−/−Il17f−/−) mice (see the Supplementary Materials) were produced in our laboratory. Mice used in this study were all on C57BL/6 background and housed in the specific pathogen–free animal facility at Tsinghua University. Protocols of animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at Tsinghua University.
Psoriasis mouse model
IMQ-induced psoriasis-like skin inflammation was induced in 6- to 8-week-old mice (C57BL/6 background) by a daily topical dose of 62.5 mg of IMQ cream (5%) (Aldara, 3 M Pharmaceuticals) on the shaved back skin for five consecutive days (11). For chronic IMQ application model, 6- to 8-week-old mice (C57BL/6 background) were treated with 10 mg of IMQ cream on the ear for 15 days. The ear thickness was measured daily. The mice were then euthanized at day 16 for histology analysis (hematoxylin and eosin (H&E) staining).
Skin cell preparation and flow cytometry
Skin cells were prepared according to previous studies with minor modifications (11). Briefly, the epidermis and dermis were separated using dispase (25 U/ml in phosphate-buffered saline (PBS); 37°C for 90 min). For keratinocytes sorting, the epidermis was further digested by 0.05% trypsin (37°C for 15 min). For flow cytometry analysis, the epidermis was discarded, and the dermal cells were separated by collagenase and hyaluronidase digestion (10 mM Hepes, collagenase IV (300 U/ml), hyaluronidase (100 U/ml), and deoxyribonuclease (200 U/ml) in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM); 37°C, 45 min). For intracellular IL-17 staining, cells were stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate/ionomycin for 4 hours in the presence of GolgiPlug (BD Biosciences). Isolated cells were first stained with different cell surface markers (CD45 for leukocytes; CD45+, Gr-1+, and CD11b+ for neutrophils; CD45+, CD3+, and γδ T cell receptor (TCR+) for γδ T cells; CD45+, CD3−, and CD90+ for ILC3; CD45+, major histocompatibility complex II (MHCII+), and langerin+ for Langerhans cells; CD45+ and CD49f+ for keratinocytes; CD11c+ and MHCII+ for DCs; and CD11b+, Ly6C+, and F4/80+ for macrophages). The cells were then fixed, permeabilized, and used for intracellular staining of IL-17 or retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptor γ (RORγt) (for ILC3). The relevant isotype control mAbs were also used. Samples were analyzed using Fortessa (BD Biosciences) and FlowJo software (TreeStar).
Histology and immunofluorescence staining
Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections (~5 μm in thickness) mounted on glass slides were used for histology studies. The H&E staining was performed as previously described (33). The thickness of epidermis was calculated on the basis of the total area versus the length of epidermis or dermis, as previously described (23, 34). For immunofluorescence, frozen sections of mouse skin were stained with antimouse IL-23 (BioLegend) or antimouse IL-17RD (Abcam) primary antibody, followed by Alexa Fluor 488–conjugated secondary antibody. The fluorescence image was taken with confocal microscope (Nikon) and analyzed by ImageJ software.
Primary keratinocyte culture and analysis
The primary epidermal keratinocytes were separated from neonatal C57BL/6 mice using dispase (25 U/ml in PBS) digestion overnight at 4°C, followed by 10 min (0.05%) trypsin-EDTA digestion at 37°C (11). The primary keratinocytes were cultured with 154CF medium and Human Keratinocyte Growth Supplement (HKGS) kit (Invitrogen) and stimulated with different cytokines for 4 hours or indicated time points at following doses: IL-17A (100 ng/ml; PeproTech), IL-17C (100 ng/ml; R&D Systems), IL-25 (1600 ng/ml; BioLegend), IL-17F (1000 ng/ml; PeproTech), IL-1α (10 ng/ml; PeproTech), IL-1β (10 ng/ml; PeproTech), and TNF-α (30 ng/ml; R&D Systems). For IL-23 intracellular staining, GolgiPlug (BD Biosciences) was added to the culture system 4 hours before the test. The antibodies against mouse p-p38 (Cell Signaling Technology), total p38 (Cell Signaling Technology), p-IκB (Santa Cruz Biotechnology), total IκB (Santa Cruz Biotechnology), p-Erk (Cell Signaling Technology), total Erk (Cell Signaling Technology), p-JNK (Cell Signaling Technology), and total JNK (Cell Signaling Technology) were used for Western blot analysis.
Primary human keratinocytes (neonatal human epidermal keratinocyte) were originally from Invitrogen. Cells within three passages were cultured with EpiLife medium plus EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) (Invitrogen), followed by the stimulation of hIL-17A (100 ng/ml; PeproTech) for 4 hours.
Expression of His-tagged IL-17 family cytokines and binding to IL-17RD
DNA sequence encoding His-tagged Il17a–Il17f genes were cloned into the pVRC vector. IL-17A-His to IL-17F-His expression vector was transfected into 293F cells, and the secreted His-tagged protein was purified with a nickel-charged affinity resin (Ni-NTA) (Qiagen). For the detection of binding, 293T cells were transfected with full length of IL-17RD or empty vector (pcDNA3.1). Forty-eight hours after transfection, His-tagged protein was incubated with the transfected cells (37°C for 1 hour), followed by staining with phycoerythrin-conjugated anti–His mAb (37°C for 30 min). The relevant isotype control mAbs were also used. Samples were analyzed using BD Fortessa (BD Biosciences) and FlowJo software (TreeStar).
Bimolecular fluorescence complementation
BiFC assays were prepared according to previous studies with minor modifications (35, 36). Briefly, the sequences encoding the YPFN or YFPC were fused after the coding regions for Il17ra, Il17rc, o Il17rd to make YFPN-RA, YFPN-RC, YFPN-RD, YFPC-RA, YFPC-RC, and YFPC-RD fusion proteins. HEK293T cells were transfected with indicated combinations of plasmids for 48 hours, and the fluorescence emissions of transfected cells were assessed by flow cytometry. For cytokine-binding assays, the plasmid encoding hCD2 was cotransfected for the indication of transfected cells, and the binding of IL-17A was performed by incubating transfected cells with His-tagged IL-17A (37°C for 1 hour), followed by incubation with antihuman CD2 and anti-His mAbs (37°C for 30 min). The samples were analyzed using BD Fortessa (BD Biosciences) and FlowJo software (TreeStar).
Immunoprecipitation
HEK293T cells were cultured in DMEM medium with 10% fetal bovine serum, and 10 μg of Flag-tagged IL-17RD plasmid (pcDNA3.1) was cotransfected with 10 μg of HA-tagged IL-17RA, HA-tagged IL-17RC, or HA-tagged IL-17RD plasmids using Lipofectamine 2000. Cells were harvested 48 hours after transfection and lysed with radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (pH 7.4) (CW2334S, CWBIO) containing the protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific). Ten milligrams of total protein was used for immunoprecipitation with mouse anti-Flag antibody (clone 3C6, Easybio), and the precipitated protein complex was used for immunoblotting with antibodies against HA-tag (clone 2B11, Easybio). For HaCaT, primary mouse keratinocytes and primary human keratinocytes cells were first stimulated with or without hIL-17A or mIL-17A (100 ng/ml) for 4 hours and then lysed with RIPA buffer (pH 7.4) containing the protease inhibitor cocktail. Fifteen milligrams of total protein was used for immunoprecipitation with anti–hIL-17RA (R&D Systems) or anti–mIL-17RA (R&D Systems), or the corresponded isotype control mAbs, and the precipitated protein complex was used for immunoblotting with antibodies against hIL-17RD or mIL-17RD (R&D Systems).
RNA extraction and RT-qPCR
Total RNAs were extracted by the RNAprep Pure Kit (DP431, Tiangen Biotech) from total skin samples or cultured keratinocytes, and complementary DNAs were synthesized by M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase (Invitrogen). RT-qPCR was performed with appropriate primers and analyzed using a Bio-Rad system. The expression of target genes was normalized to the expression of housekeeping gene Actb. The primers used for RT-qPCR are listed in table S1.
Patients with psoriasis
Skin samples for RNA isolation and Western blot analysis were obtained from patients with psoriasis (lesional skin) or normal patients with a 2-mm punch biopsy. Sample acquisitions, including skin biopsies, were approved by the Ethics Committee of Shanghai Tenth People’s Hospital and performed in accordance with the Declaration of Helsinki Principles. Informed consent was obtained for all procedures.
IL17RD knockdown
Four shRNA fragments targeting human IL17RD coding sequence were designed and cloned into lentiviral vector pLKO.1-EGFP (enhanced green fluorescent protein). The pLKO.1–hIL-17RD–shRNA lentiviral plasmid and the helper plasmids were cotransfected into the 293T cells to package lentivirus, and the pLKO.1-scramble shRNA plasmid was used as negative control. The infected cells were then sorted on the basis of GFP expression. The knockdown efficiency was tested by Western blot. The cells with maximum knockdown efficiency (targeting sequence of sh#1: 5′-GCAATTACCACCCTTTCTTCT-3′) were used in subsequent studies.
Cell sorting
Skin cells from epidermis and dermis were prepared as described above (11) and stained with different cell surface markers (CD45+, Gr-1+, and CD11b+ for neutrophils; CD45+, CD3+, and γδ TCR+ for γδ T cells; CD45+, MHCII+, and langerin+ for Langerhans cells; CD45− and CD49f+ for keratinocytes; CD11c+ and MHCII+ for DCs; and CD11b+, Ly6C+, and F4/80+ for macrophages). Neutrophils, γδ T cells, Langerhans cells, keratinocytes, DCs, and macrophages from the skin were sorted by BD FACSAria III Cell Sorter (BD Biosciences).
Bone marrow chimera mice
The WT and KO recipient mice (Il17rd KO or Il23 KO) were first lethally irradiated (500 Rads, ×2) and then reconstituted with 5 × 106 bone marrow cells isolated from either WT or KO donor mice. The recipient mice were subjected to IMQ-induced psoriasis-like skin inflammations 8 weeks after bone marrow reconstitution and analyzed as described above.
Enzyme-linked immunosorbent assay
Keratinocytes (5 × 104 cells per well) were seeded in triplicate onto 24-well plates in 0.4-ml complete 154CF medium and allowed to adhere overnight. The cells were subsequently washed and incubated with 154CF medium without supplements for 24 hours. The cells were washed again and incubated with IL-17A (100 ng/ml) for 24 hour. The concentrations of CXCL1 and CCL20 of the culture supernatants were measured using ELISA kit (Boster Biological Technology).
Saturation binding assay
Binding of mIL-17A to mIL-17RC–ecd-Fc and IL-17RD–ecd-Fc was determined by indirect sandwich ELISA. ELISA plates were coated with goat antihuman IgG-Fc (10 μg/ml). IL-17RC–ecd-Fc (30 ng/ml) or IL-17RD–ecd-Fc (24.2 ng/ml) was added to plates and incubated for 4 hours, followed by serial dilutions of biotinylated IL-17A for 2 hours at room temperature. ELISA was developed with poly–horseradish peroxidase streptavidin (Pierce Biotechnology) and tetramethylbenzidine substrate (Invitrogen).
RNA sequencing
Keratinocyte from neonatal WT, Il17rd KO, and Il17rc KO mice were cultured and stimulated with IL-17A (100 ng/ml; PeproTech) for 8 hours. Total RNAs were isolated with the RNAprep Pure Kit (DP431), and the RNA-seq library was prepared by the Beijing Genomics Institute. Sequence reads were obtained using BGISEQ-500 (Illumina) and successfully mapped to mouse genome. Reads counts were normalized on the basis of reads per kilobase per million mapped reads (RPKM), fold changes were calculated for all possible comparisons, and a twofold cutoff was used to select genes with expression changes.
Statistical analysis
The data were analyzed by Graph Prism 6.0 software, and the statistics were analyzed by unpaired Student’s t test or one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey’s post hoc test. All quantitative data are shown as means ± SEM. P values less than 0.05 were considered significant.
Acknowledgments: We thank M. Xu for help in psoriasis model, Q. Wu and X. Wei for animal husbandry, the Immunology Institute Core Facility for cell sorting, and the Dong Laboratory for support and discussion. Funding: This work was supported by grants from National Natural Science Foundation of China (31570884 to X.W. and 31630022 to C.D.), National Key Research and Development Program of China (2016YFC0906200 to C.D.), and Beijing Natural Science foundation (5172017 to X.W.). Author contributions: Y. Su and C.D. designed the project. Y. Su and J.H. performed the experiments. Y. Su, C.D., and X.W. analyzed the data. H.L. and X.Z. analyzed the bioinformatics data. Y. Su, X.W., and C.D. prepared the manuscript. Y.L. revised the manuscript and designed the study, while W.W., Y. Shi, and Y.L performed the experiments for human samples. X.O.Y. generated Il17a e Il17f DKO mice. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: The RNA-seq data have been deposited to the Gene Expression Omnibus with accession no. GSE129176. All other data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the Supplementary Materials.
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