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La marijuana suscita tutti i tipi di sentimenti attraverso lo spettro delle persone con cui parli ed è un argomento circondato da molte controversie.

Probabilmente lo conosci con questo nome, ma è anche conosciuto come Mary Jane, pentola, erba, erba, reefer, ganja e molti altri soprannomi. Quello che molti di noi sanno della sostanza è che ti rende “alto”, eppure ci sono così tante sfaccettature in questa pianta che non hanno nulla a che fare con gli effetti che alterano la mente per cui è così famoso.

In particolare, sto parlando di olio di CBD, cannabidiolo.

Il cannabidiolo (CBD) “è uno degli oltre 100 composti chimici noti come cannabinoidi presenti nella pianta di cannabis o marijuana, Cannabis sativa.“Questo olio è stato anche usato ed è noto per essere incredibilmente efficace nel porre rimedio a disturbi comuni, in particolare la gestione del dolore.

La cosa importante da sapere sull'olio di CBD – un fatto che è molto sbagliato – è che, a seconda del marchio acquistato, in genere non contiene qualsiasi tetraidrocannabinolo (THC), che è il “principale cannabinoide psicoattivo presente nella cannabis e provoca la sensazione di diventare” alto “che è spesso associato alla marijuana”.

In poche parole, “il CBD non è psicoattivo”.

Dalla gestione del dolore cronico al sollievo dall'ansia, l'olio di CBD sta rapidamente “guadagnando slancio nel mondo della salute e del benessere”.

Stai cercando di cimentarti in alcuni prodotti CBD? Se stai cercando olio di CBD puro al 100%, devi prima visitare una città che non ha limitato la vendita di marijuana ricreativa: Colorado, California, Oregon, Washington, Nevada, Illinois, Michigan, Massachusets, Vermont, Alaska e Maine – e quindi dovrai trovare un dispensario affidabile.

Fino a quel momento, prova un prodotto a base di canapa! Qual è la differenza?

Quando si tratta di abbattere le differenze botaniche tra CBD e canapa, stiamo osservando “due tipi di cannabis: piante di canapa e piante medicinali”. Mentre la pianta di canapa viene coltivata per la fibra e l'olio di semi, la varietà di farmaci viene generalmente coltivata per i componenti “inebrianti ricchi di THC (componenti) e ricchi di CBD non inebrianti”.

Sebbene l'olio di canapa non contenga gli stessi potenti componenti dell'olio di CBD, ha ancora un “profilo ricco di sostanze nutritive, acidi grassi e utili composti bioattivi”, che lo rende utile per alcuni problemi di salute tra cui disturbi della pelle, come l'acne, eczema, psoriasi e dermatite: salute del cuore, salute del cervello, sollievo dal dolore e tensione muscolare.

1. Devan Vegan Olio di canapa Vitamine

Vitamine dell'olio di canapa Deva / Amazon.com

Queste vitamine all'olio di canapa vegane Deva non sono solo certificate dalla Vegan Society senza scopo di lucro, ma sono anche biologiche, al 100% prive di animali, e provengono da un processo spremuto a freddo e non raffinato – garantendo la più alta qualità, la canapa più fresca olio! Questo prodotto fornisce al tuo corpo un'alta concentrazione di acidi grassi, in particolare acido alfa linoleico, acido linoleico e acido oleico – antiossidanti, vitamine e fitosteroli. Queste vitamine all'olio di canapa sono senza latte e senza grano! Una bottiglia da 90 conteggi costa $ 12,99.

2. Olio di canapa GreenIVe

GreenIVe Hemp Oil / Amazon.com

Questo Olio di canapa GreenIVe fonti il ​​loro olio di canapa da agricoltura biologica in un processo spremuto a freddo. Un cucchiaio di questo olio di canapa contiene otto grammi di omega-6 vegani e 2,5 grammi di acidi grassi omega-3 vegani, insieme al 10 percento dell'apporto giornaliero di vitamina E e un'intera dose di clorofilla e antiossidanti. A causa delle qualità superfood dell'olio di canapa, questo prodotto cerca di ridurre il dolore, lo stress e l'ansia. Questo prodotto ha zero riempitivi o ingredienti artificiali! Una bottiglia da 16 once costa $ 19,99.

Bonnell Poe dice: “Avere dolore cronico. Questo funziona quando compro la prossima volta proverò un sapore ma metterlo sotto la lingua non è male lol. Adoro questo prodotto già sentirsi meglio non così depresso e dormire Meglio quindi Grazie mille Bonnell Poe. ”

3. Mary Ruth Estratto di olio di canapa puro biologico con menta piperita

Mary Ruth Estratto di olio di canapa puro biologico con menta piperita / Amazon.com

Mary Ruth è uno di quei marchi di fiducia preferiti dai vegani per integratori, tinture, estratti e ora olio di canapa! Questa è Mary Ruth Estratto di olio di canapa puro biologico con menta piperita è stato sviluppato per essere “estremamente benefico per i recettori che moderano l'omeostasi del corpo, regolando tutto dal sonno alla funzione cognitiva all'infiammazione”. Questo prodotto è ricco di acidi grassi omega-3 e omega-6 per aiutare a curare lievi dolori, dolori e infiammazioni, nonché aumentare la flessibilità e l'aiuto nella salute delle articolazioni e ridurre l'ansia, nonché aumentare il sonno riposante! Un doppio pacchetto di bottiglie da 1 oncia costa $ 39,95.

Laura Shooter afferma: “Ho deciso di provare il prodotto di canapa pura per una serie di motivi: per aiutare con un po 'di dolore cronico alla spalla, aiutarmi a dormire e aiutare nella mia routine di cura della pelle. L'ho preso per via orale (non l'ho ancora provato per via topica) e ho trovato il gusto della menta piperita abbastanza piacevole. Lo condividerò con mio marito che ha avuto qualche mal di schiena e problemi a dormire poiché penso che fornirà un po 'di sollievo durante la notte. Ho anche in programma di avere mia figlia, che ha la pelle molto sensibile e sblocchi ricorrenti, provarla per via topica per vedere se aiuta l'infiammazione che sperimenta sulla fronte e sul mento. Ho dormito meravigliosamente la scorsa notte e mi sono svegliato questa mattina senza dolore alla spalla e sentendomi riposato. Continueremo a utilizzare per determinare eventuali benefici a lungo termine. Finora non ho avuto effetti collaterali prendendo una volta al giorno “.

4. Crema intensiva vegana quotidiana alla canapa con olii essenziali

Crema intensiva vegana quotidiana alla canapa con oli essenziali / Amazon.com

Questa crema intensiva vegana quotidiana alla canapa con oli essenziali è il prodotto perfetto per dolori e dolori, nonché per la pelle secca e irritata! Questa miscela è composta da canapa organica per aiutare con dolori muscolari, mal di schiena cronici e ansia. Questo prodotto è composto da estratti di canapa biologica di alta qualità per curare, lenire e fornire cure omeopatiche al corpo. Inoltre, la pelle aumenterà l'idratazione e diventerà sempre più liscia come la seta. Un barattolo da 1,7 once costa $ 22,99.

Il cliente Amazon dice “Questo prodotto è uno dei miei preferiti. Apprezzo che abbia lo 0% di THC. Ma la qualità è spettacolare. Ha un forte odore di erbe / menta piperita. ma non c'è una sensazione calda e gelida. Consiglio vivamente di indossarlo con un guanto. Solo così non ti strofini gli occhi più tardi. Ho la fibromialgia e questo è uno dei miei trattamenti antidolorifici. “

5. The Merry Hempsters Vegan Certified Hot Hemp Muscle Rub

Merry Hempsters Vegan certificato Hot Hemp Muscle Rub / Amazon.com

Lo sfregamento muscolare di canapa calda certificato Merry Hempsters Vegan è specificamente progettato come balsamo analgesico ad azione rapida che lenisce delicatamente i muscoli e le articolazioni doloranti. Questo sfregamento muscolare completamente naturale è miscelato con canfora e cristalli di mentolo organico per un immediato sollievo dal dolore e una riduzione dell'infiammazione. Perfetto per muscoli doloranti, sforzi, sforzi eccessivi, articolazioni infiammate o congestione! Questo prodotto è un prodotto vegano certificato! Un tubo da 0,6 once costa $ 4,95.

M&J E. dice “L'ho comprato per mio marito, perché è molto attivo e ha molti dolori e dolori. Entrambi amiamo questa roba! Ho comprato il riscaldamento e il raffreddamento ed entrambi sono fantastici a modo loro. Non potrebbe essere più felice. Sono contento di aver trovato una buona alternativa ai prodotti chimici acquistati in negozio. “

6. Hempz Idratante corpo olio di semi di canapa vegan originale

Hempz Idratante corpo olio di semi di canapa vegan originale / Amazon.com

Questo Hempz Idratante corpo olio di semi di canapa vegan originale è una miscela di olio di canapa ricco di acidi grassi omega-6 e omega-3, vitamine A, C, E, burro di karité, ginseng e fragranze naturali di fiori e banane. Questa lozione promette di lenire l'infiammazione, calmare la dermatite atopica, aumentare l'idratazione della pelle, ridurre il rossore, nutrire, proteggere e lavorare per rimediare a secchezza invernale, desquamazione o secchezza di mani e piedi. Hempz non usa sostanze chimiche aggressive e promette un prodotto vegano! Una bottiglia da 17 once fluide costa $ 11,19.

Moyer dice “Ho usato questa roba anni fa e ho dimenticato quanto mi piaceva. È senza dubbio la migliore lozione idratante che c'è per l'abbronzatura. Ho l'eczema, quindi devo essere cauto con lozioni. Soprattutto quelli profumati. Anche con questo detto e questo profumato, funziona bene. Ha completamente chiarito le mie aree irregolari. Oh e odori delizia !!!! ”

7. Olio di semi di canapa vegano biologico con priorità al benessere e lozione di burro di semi di mango

Olio di semi di canapa vegano biologico con priorità al benessere e lozione al burro di semi di mango / Amazon.com

Cerchi qualcosa di un po 'più lussuoso, pur guarendo anche un corpo dolorante? Questa lozione biologica con olio di semi di canapa vegana con priorità al benessere e lozione al burro di semi di mango può essere la combinazione perfetta di entrambi i mondi per te! Questo prodotto è al 100% vegano, senza glutine, privo di crudeltà, contiene zero tossine, contiene solo ingredienti completamente naturali e biologici ed è ottimo per tutti i tipi di pelle. Benessere prioritario promette che questo prodotto nutrirà la tua pelle – con vitamine A, D ed E – riducendo anche l'infiammazione e tendendo a dolori e dolori. Una bottiglia da 8 once costa $ 19,95.

Sarah dice “Ho lottato contro l'acne da quando avevo circa 13/14 anni. Sono andato da più dermatologi, ho provato tutto nel libro e non sono mai riuscito a trovare qualcosa per cancellare la mia acne. Alla fine ho trovato un detergente per il viso che ha funzionato, ma stavo lottando per trovare una crema idratante adatta alla mia pelle. Mi sono imbattuto in questo online e l'ho verificato. Ho letto tutte le recensioni e tutto il resto … avanti e indietro, avanti e indietro. È un po 'caro ma ho deciso di provarlo e non comprerò mai più un'altra crema idratante! È fantastico e mi ha aiutato drasticamente a cancellare le mie cicatrici da acne! 5 stelle, senza dubbio. Comprerà ancora e ancora e ancora!

8. Cultivax Pure Extract Olio di canapa vegan-friendly

Cultivax Pure Extract Olio di canapa vegan-friendly / Amazon.com

Questo olio di canapa Vegan-friendly a base di estratto di Cultivax offre un olio di canapa ad alta potenza e di alta qualità che utilizza solo olio di canapa naturale, biologico, non OGM e ultra-purificato. Questo estratto è un eccellente antidolorifico, antistress, antidolorifico e ha anche dimostrato di aiutare a migliorare la chiarezza mentale e la funzione cerebrale. Caricato con acidi grassi e vitamine, questo estratto è perfetto per la miscelazione con frullati, frullati o anche semplicemente preso crudo in bocca! Una bottiglia di oncia da 1 fluido costa $ 9,99.

Eric J. dice “Questi oli di canapa per dormire sono medici. Ho sofferto di insonnia per tutta la mia vita di recente il vicino ha fatto rumore per tutta la notte in modo permanente incasinato il mio programma di sonno e reso insonnia super permanentemente permanente in qualche modo il mio corpo non può dire la vera fatica che ho che mi impedisce di ottenere il sonno necessario con questo, ha costretto il mio corpo a sentire che è il vero livello di affaticamento che dorme molto di più ora che ottengo il mio sonno obsoleto, mi sento come se stesse risolvendo i miei gravi problemi di sonno. Pensato che fosse impossibile, sono incerto su quanto bene funzioni per dormire naturalmente. Questo è letteralmente incredibile olio di canapa d'amore !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ”

9. Novel Trees Natural Vegan Tintura di olio di semi di canapa premium

Nuovi alberi Vegan naturale Tintura di olio di semi di canapa premium / Amazon.com

Questo romanzo di alberi naturali vegan Tintura di olio di semi di canapa premium fornisce una potente fonte di antiossidanti che aumenteranno il tuo sistema immunitario. Inoltre, questa tintura aiuterà anche ad alleviare l'infiammazione cronica, riequilibrando gli ormoni, rigenerando la pelle, favorendo l'eczema, e ha anche dimostrato di abbassare il colesterolo! Questo prodotto è vegano, crudo, puro, biologico al 100% e verde! Una bottiglia da 250 milligrammi costa $ 19,99.

Becky Evans dice “Io e mio marito abbiamo usato questo olio al posto dei farmaci da prescrizione, il nostro medico voleva che lo provassimo. Funziona molto bene, ma circa la metà del tempo non ha sapore di menta piperita! Odio il gusto senza la menta piperita! ”

10. Spray attivo biologico vegano quotidiano alla canapa con oli essenziali

Alla ricerca del perfetto antidolorifico post allenamento? Questo Spray attivo biologico vegano quotidiano alla canapa con oli essenziali è stato progettato specificamente per quegli individui attivi! Questo prodotto utilizza una miscela di olio di canapa di alta qualità con mentolo rinfrescante per alleviare il dolore muscolare, il mal di schiena cronico e aiuta anche ad alleviare l'ansia. Con una formula ad asciugatura rapida, puoi calmare istantaneamente ed essere sulla buona strada! Una bottiglia di oncia a 2 fluidi costa $ 22,99.

Madison dice “Soffro di artrite ai piedi a causa di anni di corsa. Questo è l'unico prodotto che mi dà un sollievo immediato! ”

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SUD SAN FRANCISCO, California., 27 febbraio 2020 / PRNewswire / – Rigel Pharmaceuticals, Inc. (Nasdaq: RIGL) ha riportato oggi i risultati finanziari per il quarto trimestre e l'esercizio chiuso 31 dicembre 2019, comprese le vendite di TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) compresse, per il trattamento di adulti con trombocitopenia immune cronica (ITP) che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento.

“Stiamo entrando nel 2020 con un chiaro piano per promuovere il valore per gli azionisti di Rigel”, ha affermato Raul Rodriguez, Presidente e CEO di Rigel. “Vediamo opportunità sostanziali per TAVALISSE di soddisfare le esigenze dei pazienti nel crescente mercato ITP cronico degli adulti, in particolare come terapia di prima linea. L'utilizzo in questi pazienti meno refrattari continua a crescere con il supporto della formazione medica continua e della generazione di dati. Per ampliare la gamma delle indicazioni di TAVALISSE, stiamo conducendo una sperimentazione di Fase 3 in caldo AIHA e prevediamo di completare l'arruolamento dei pazienti a metà anno. Inoltre, siamo estremamente entusiasti del potenziale dei nostri candidati nella fase iniziale e stiamo attualmente esplorando opportunità di partnership che consentirebbero a Rigel di realizzare quasi -term value partecipando significativamente anche al rialzo di questi programmi. ”

Aggiornamento aziendale
Al 61st Incontro annuale ed esposizione dell'American Society of Hematology (ASH) a Dicembre 2019, la società ha presentato analisi dei dati post-hoc dal suo programma clinico di Fase 3 di TAVALISSE in pazienti adulti con ITP cronica. In questa analisi, 32 pazienti hanno ricevuto fostamatinib come terapia di seconda linea, di cui il 78% (25/32) ha raggiunto una conta piastrinica ≥1 di ≥50.000 / µL (senza terapia di salvataggio). Gli eventi avversi sono stati gestibili e coerenti con quelli precedentemente segnalati con fostamatinib. Questi dati evidenziano il potenziale beneficio derivante dall'uso di TAVALISSE nelle prime linee di terapia.

Nel Febbraio 2020, Rigel ha ricevuto a $ 20,0 milioni pagamento dal suo partner collaborativo Grifols, S.A. (Grifols). Il pagamento è composto da $ 17,5 milioni per l'approvazione da parte della Commissione europea della domanda di autorizzazione all'immissione in commercio di fostamatinib per il trattamento della trombocitopenia immunitaria cronica in pazienti adulti refrattari ad altri trattamenti e $ 2,5 milioni pagamento di royalty anticipato credibile in base ai termini dell'accordo di collaborazione. Fostamatinib sarà commercializzato in Europa con il marchio TAVLESSE ™ (fostamatinib). Grifols prevede di lanciare il prodotto nel secondo trimestre del 2020.

Sono in corso le iscrizioni allo studio cardine di Fase 3 di Rigel in AIHA caldo, AVANTI (Ricerca di Fostamatinib nella malattia AIHA dell'anticorpo caldo). Ad oggi sono stati randomizzati in totale 34 pazienti. Il processo rimane sulla buona strada per completare le iscrizioni a metà del 2020.

Nel Febbraio 2020, Il partner di Rigel Kissei Pharmaceuticals Co., Ltd. (Kissei) ha ottenuto la designazione di farmaco orfano dal Ministero giapponese per la salute, il lavoro e il benessere per R788 (fostamatinib) nella porpora trombocitopenica idiopatica cronica.

Aggiornamento finanziario
Per il quarto trimestre del 2019, Rigel ha registrato una perdita netta di $ 17,2 milioni, o $ 0.10 per azione, rispetto al reddito netto di $ 3,2 milionio $ 0,02 per azione, nello stesso periodo del 2018.

Nel quarto trimestre del 2019, i ricavi totali sono stati 15,4 milioni di dollari, consiste in $ 13,8 milioni nelle vendite nette dei prodotti e $ 1,6 milioni nelle entrate contrattuali da collaborazioni. Vendite nette del prodotto di $ 13,8 milioni aumentato del 90% rispetto a $ 7,3 milioni nel quarto trimestre del 2018. Questo aumento riflette la base in espansione di pazienti e prescrittori per TAVALISSE e il tasso di persistenza crescente per le ricariche al mese 4, che è di circa il 54%.

Entrate contrattuali da collaborazioni di $ 1,6 milioni per il quarto trimestre chiuso 31 dicembre 2019 è costituito da a $ 1,5 milioni commissione guadagnata a seguito di una modifica della licenza e dell'accordo di collaborazione con Aclaris Therapeutics, Inc. (Aclaris) in Ottobre 2019, nonché i ricavi differiti derivanti dalla collaborazione di Rigel con Grifols relativi alle prestazioni di determinati servizi di ricerca e sviluppo.

Rigel ha riportato costi e spese totali di $ 32,7 milioni nel quarto trimestre del 2019, rispetto a $ 35,3 milioni per lo stesso periodo nel 2018. La riduzione dei costi e delle spese è principalmente dovuta alla riduzione delle spese relative al personale e ai vari costi di terze parti.

Per tutto l'anno finito 31 dicembre 2019, Rigel ha riportato una perdita netta di $ 66,9 milioni, o $ 0.40 per azione, rispetto a una perdita netta di $ 70,5 milioni, o $ 0.44 per azione, per lo stesso periodo del 2018.

Rigel ha registrato un fatturato totale di $ 59,3 milioni per l'anno conclusosi 31 dicembre 2019, consiste in $ 43,8 milioni nelle vendite nette dei prodotti e 15,5 milioni di dollari nei ricavi relativi agli accordi di collaborazione di Rigel con Grifols, Kissei, Aclaris e Impact Biomedicines, Inc.

Totale costi e spese per l'esercizio chiuso 31 dicembre 2019, erano $ 128,4 milioni, rispetto a $ 117,2 milioni, per lo stesso periodo del 2018. L'aumento dei costi e delle spese totali è dovuto principalmente agli aumenti dei costi di terze parti relativi allo studio cardine di Fase 3 in corso di Rigel in caldo AIHA, costi relativi al personale, commercializzazione in corso di TAVALISSE negli adulti ITP cronico e costi di ricerca e sviluppo relativi allo studio di fase 1 nel PIR.

Come di 31 dicembre 2019, Rigel disponeva di liquidità, mezzi equivalenti e investimenti a breve termine di $ 98,1 milioni, rispetto a $ 128,5 milioni come di 31 dicembre 2018. Rigel aveva precedentemente annunciato che in Settembre 2019, siamo entrati in a $ 60,0 milioni finanziamento a termine con MidCap Financial. Alla chiusura, $ 10,0 milioni è stato finanziato a Rigel in una tranche iniziale. La struttura offre anche a Rigel la possibilità di accedere ad un ulteriore $ 50,0 milioni, di cui $ 40,0 milioni è soggetto al raggiungimento di determinate condizioni abituali.

Chiamata in conferenza e webcast con le diapositive Oggi a 16:30 ora orientale
Rigel terrà una teleconferenza in diretta e un webcast oggi a 16:30 ora orientale (13:30 Pacific Time).

I partecipanti possono accedere alla teleconferenza in diretta componendo il numero (877) 407-3088 (domestico) o (201) 389-0927 (internazionale). La teleconferenza e le diapositive di accompagnamento saranno inoltre trasmesse in diretta via web e sarà possibile accedervi dalla sezione Investor Relations del sito Web della società all'indirizzo www.rigel.com. Il webcast verrà archiviato e disponibile per la riproduzione dopo la chiamata tramite il sito Web di Rigel.

Informazioni su ITP
Nei pazienti con ITP (trombocitopenia immunitaria), il sistema immunitario attacca e distrugge le piastrine del sangue, che svolgono un ruolo attivo nella coagulazione e nella guarigione del sangue. I sintomi più comuni di ITP sono lividi e sanguinamento eccessivi. Le persone che soffrono di ITP cronica possono vivere con un aumentato rischio di eventi emorragici gravi che possono causare gravi complicazioni mediche o persino la morte. Le attuali terapie per ITP includono steroidi, stimolatori della produzione di piastrine nel sangue (TPO-RA) e splenectomia. Tuttavia, non tutti i pazienti rispondono alle terapie esistenti. Di conseguenza, rimane una significativa necessità medica di ulteriori opzioni di trattamento per i pazienti con ITP.

Informazioni su AIHA
L'anemia emolitica autoimmune (AIHA) è un raro, grave disturbo del sangue in cui il sistema immunitario produce anticorpi che provocano la distruzione dei globuli rossi del corpo. L'AIHA colpisce circa 45.000 pazienti adulti negli Stati Uniti e può essere una malattia grave e debilitante. Ad oggi, non esistono terapie mirate alla malattia approvate per AIHA, nonostante il bisogno medico insoddisfatto che esiste per questi pazienti. L'anticorpo caldo AIHA (wAIHA), la forma più comune di AIHA, è caratterizzato dalla presenza di anticorpi che reagiscono con la superficie dei globuli rossi a temperatura corporea.

Circa R8351
Il candidato in fase di sperimentazione, R835, è un inibitore disponibile, potente e selettivo per via orale di IRAK1 e IRAK4 che ha dimostrato preclinicamente di bloccare la produzione di citochine infiammatorie in risposta al recettore a pedaggio (TLR) e al recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) segnalazione familiare. TLR e IL-1R svolgono un ruolo critico nella risposta immunitaria innata e la disregolazione di questi percorsi può portare a una varietà di condizioni patologiche infiammatorie. Il trattamento R835 dimostra il miglioramento dei sintomi clinici in più modelli di roditori di malattia infiammatoria tra cui psoriasi, artrite, lupus, sclerosi multipla e gotta. La sicurezza e l'efficacia di R835 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Circa R5521
Il candidato in fase di sperimentazione, R552, è un inibitore disponibile, potente e selettivo disponibile per via orale della proteina chinasi recettoriale (RIP1). Si ritiene che RIP1 svolga un ruolo critico nella necroptosi. La necroptosi è una forma di morte cellulare regolata in cui la rottura delle cellule porta alla dispersione del loro contenuto interno, che induce risposte immunitarie e migliora l'infiammazione. In studi preclinici, R552 ha prevenuto l'infiammazione delle articolazioni e della pelle in un modello murino mediato da RIP1 di infiammazione e danno tissutale. La sicurezza e l'efficacia di R552 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Informazioni su TAVALISSE
Indicazione

TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) è indicato per il trattamento della trombocitopenia in pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica (ITP) che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento.

Informazioni importanti sulla sicurezza
Avvertenze e precauzioni

  • L'ipertensione può verificarsi con il trattamento TAVALISSE. I pazienti con ipertensione preesistente possono essere più sensibili agli effetti ipertesi. Monitorare la pressione sanguigna ogni 2 settimane fino a che non sia stabile, quindi mensilmente e regolare o avviare la terapia antiipertensiva per il mantenimento del controllo della pressione arteriosa durante la terapia. Se l'aumento della pressione sanguigna persiste, può essere necessaria l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • Con TAVALISSE possono verificarsi test elevati di funzionalità epatica (LFT), principalmente ALT e AST. Monitorare mensilmente le LFT durante il trattamento. Se ALT o AST aumentano a> 3 volte il limite superiore del normale, gestire l'epatotossicità usando l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • La diarrea si è verificata nel 31% dei pazienti e la diarrea grave si è verificata nell'1% dei pazienti trattati con TAVALISSE. Monitorare i pazienti per lo sviluppo di diarrea e gestirli utilizzando misure di terapia di supporto subito dopo l'insorgenza dei sintomi. Se la diarrea diventa grave (≥ 3 ° grado), interrompere, ridurre la dose o interrompere TAVALISSE.
  • La neutropenia si è verificata nel 6% dei pazienti trattati con TAVALISSE; neutropenia febbrile si è verificata nell'1% dei pazienti. Monitorare mensilmente l'ANC e l'infezione durante il trattamento. Gestire la tossicità con l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • TAVALISSE può causare danni al feto quando somministrato a donne in gravidanza. Consiglia alle donne in gravidanza il potenziale rischio per un feto. Consigliare alle donne in età fertile di usare misure contraccettive efficaci durante il trattamento e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose. Verificare lo stato di gravidanza prima di iniziare TAVALISSE. Non è noto se TAVALISSE o il suo metabolita siano presenti nel latte materno. A causa della possibilità di gravi reazioni avverse in un bambino allattato al seno, consiglia a una donna che allatta di non allattare durante il trattamento con TAVALISSE e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose.

Interazioni farmacologiche

  • L'uso concomitante di TAVALISSE con potenti inibitori del CYP3A4 aumenta l'esposizione al principale metabolita attivo di TAVALISSE (R406), che può aumentare il rischio di reazioni avverse. Monitorare le tossicità che potrebbero richiedere una riduzione della dose di TAVALISSE.
  • Non è raccomandato l'uso di TAVALISSE con potenti induttori del CYP3A4, poiché l'uso concomitante riduce l'esposizione a R406.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di alcuni farmaci per substrato del CYP3A4 e può richiedere una riduzione della dose del farmaco per substrato del CYP3A4.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di farmaci substrato BCRP (ad es. Rosuvastatina) e farmaci substrato P-glicoproteina (P-gp) (ad esempio digossina), che possono richiedere una riduzione della dose del farmaco substrato BCRP e P-gp.

Reazioni avverse

  • Gravi reazioni avverse da farmaco negli studi in doppio cieco dell'ITP sono state neutropenia febbrile, diarrea, polmonite e crisi ipertensiva, verificatesi nell'1% dei pazienti con TAVALISSE. Inoltre, si sono verificate gravi reazioni avverse tra cui dispnea e ipertensione (entrambe al 2%), neutropenia, artralgia, dolore toracico, diarrea, vertigini, nefrolitiasi, dolore alle estremità, mal di denti, sincope e ipossia (tutto l'1%).
  • Reazioni avverse comuni (≥5% e più comuni rispetto al placebo) di FIT-1 e FIT-2 incluse: diarrea, ipertensione, nausea, vertigini, aumento di ALT e AST, infezione respiratoria, eruzione cutanea, dolore addominale, affaticamento, dolore toracico e neutropenia.

Si prega di consultare www.TAVALISSE.com per informazioni complete sulla prescrizione.

Per segnalare gli effetti collaterali dei farmaci da prescrizione alla FDA, visitare www.fda.gov/medwatch o chiamare il numero 1-800-FDA-1088 (800-332-1088).

TAVALISSE è un marchio di fabbrica di Rigel Pharmaceuticals, Inc.

Rigel Rigel (www.rigel.com)
Rigel Pharmaceuticals, Inc., è una società di biotecnologie dedicata alla scoperta, allo sviluppo e alla fornitura di nuovi farmaci a piccole molecole che migliorano significativamente la vita dei pazienti con disturbi immunitari ed ematologici, cancro e malattie rare. La ricerca pionieristica di Rigel si concentra su percorsi di segnalazione che sono fondamentali per i meccanismi delle malattie. Il primo prodotto approvato dalla FDA dell'azienda è TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate), l'unico inibitore della tirosina chinasi (SYK) della milza orale, per il trattamento di pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento. Il prodotto è stato approvato dalla Commissione europea per il trattamento della trombocitopenia immune cronica in pazienti adulti refrattari ad altri trattamenti e sarà commercializzato in Europa sotto il nome di TAVLESSE ™ (fostamatinib).

I programmi clinici di Rigel includono uno studio di fase 3 su fostamatinib nell'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA); uno studio di fase 1 recentemente completato di R8351, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della chinasi (IRAK) associato al recettore dell'interleuchina; e uno studio di fase 1 in corso su R5521, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della proteina chinasi (RIP) che interagisce con i recettori. Inoltre, Rigel ha prodotto candidati nello sviluppo clinico con i partner Aclaris Therapeutics, AstraZeneca, BerGenBio ASA e Daiichi Sankyo.

1Il prodotto per questo uso o indicazione è sperimentale e non è stato dimostrato sicuro o efficace da alcuna autorità di regolamentazione.

Dichiarazioni previsionali
Questa versione contiene dichiarazioni previsionali relative, tra l'altro, al successo commerciale di TAVALISSE negli Stati Uniti .; la commercializzazione di TAVLESSE in Europa e i relativi tempi; La capacità di Rigel di far crescere l'utilizzo di TAVALISSE nella terapia precoce; l'utilità di fostamatinib nell'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA); La capacità di Rigel di completare l'iscrizione alla sperimentazione clinica di fase 3 per AIHA e i relativi tempi; La capacità di Rigel di sviluppare ulteriormente i suoi candidati per i prodotti in fase clinica; e gli sforzi di partnership di Rigel. Qualsiasi affermazione contenuta nel presente comunicato stampa che non sia affermazione di fatti storici può essere considerata una dichiarazione previsionale. Parole come “potenziale”, “può”, “si aspetta” ed espressioni simili intendono identificare queste affermazioni lungimiranti. Queste dichiarazioni previsionali si basano sulle aspettative attuali di Rigel e implicano intrinsecamente rischi e incertezze significativi. I risultati effettivi e la tempistica degli eventi potrebbero differire materialmente da quelli previsti in tali dichiarazioni previsionali a seguito di tali rischi e incertezze, che includono, senza limitazione, i rischi e le incertezze associati alla commercializzazione e alla commercializzazione di TAVALISSE; rischi che FDA, EMA o altre autorità di regolamentazione possano prendere decisioni avverse in merito a fostamatinib; rischi che gli studi clinici TAVALISSE potrebbero non essere in grado di prevedere i risultati del mondo reale o dei risultati negli studi clinici successivi; rischi che TAVALISSE possa avere effetti collaterali indesiderati, reazioni avverse o incidenti di uso improprio; la disponibilità di risorse per sviluppare i candidati al prodotto Rigel; concorrenza sul mercato; nonché altri rischi dettagliati di volta in volta nelle relazioni di Rigel depositate presso la Securities and Exchange Commission, inclusa la relazione trimestrale sul modulo 10-Q per il periodo chiuso 30 settembre 2019. Rigel non si assume alcun obbligo di aggiornare le dichiarazioni previsionali e declina espressamente qualsiasi obbligo o impegno a rilasciare pubblicamente eventuali aggiornamenti o revisioni a dichiarazioni previsionali contenute nel presente documento.

Contatto IR: David Burke
Telefono: 650.624.1232
E-mail: dburke@rigel.com

RIGEL PHARMACEUTICALS, INC.

DICHIARAZIONI DI OPERAZIONI

(in migliaia, ad eccezione degli importi per azione)

Tre mesi terminati il ​​31 dicembre

Anno chiuso al 31 dicembre

2019

2018

2019

2018

(Non certificato)

ricavi:

Vendite di prodotti, al netto

$ 13.829

$ 7.295

$ 43.772

$ 13.947

Entrate contrattuali derivanti da collaborazioni

1.571

30.562

15.516

30.562

Entrate totali

15.400

37.857

59.288

44.509

Costi e spese:

Costo delle vendite del prodotto

178

188

906

287

Ricerca e sviluppo (vedi nota A)

14.247

13.767

52.885

46.903

Vendita, generale e amministrativa (vedi nota A)

18.312

21.370

74.588

70.002

Totale costi e spese

32.737

35.325

128.379

117.192

Proventi (perdite) da operazioni

(17.337)

2.532

(69.091)

(72.683)

Interessi attivi

464

696

2.532

2.203

Interessi passivi

(327)

(335)

Utile (perdita) netto

$ (17.200)

$ 3,228

$ (66,894)

$ (70,480)

Utile (perdita) netto per azione, base e diluito

$ (0,10)

$ 0,02

$ (0,40)

$ (0,44)

Media ponderata delle azioni utilizzate nel calcolo dell'utile (perdita) netto per azione

Di base

167.619

166.680

167.400

160.529

diluito

167.619

167.617

167.400

160.529

Nota A

Spese di compensazione basate su azioni incluse in:

Vendita, generale e amministrativa

$ 934

$ 1.470

6.453 $

$ 5.383

Ricerca e sviluppo

477

587

2.662

2.321

$ 1.411

$ 2,057

$ 9.115

$ 7,704

DATI DI BILANCIO DI SINTESI

(in migliaia)

31 dicembre

2019

2018

Cassa, disponibilità liquide e investimenti a breve termine

$ 98.078

$ 128.537

Totale attivo

147.569

139.109

Patrimonio netto

53.815

109.877

Cision Visualizza contenuti originali per scaricare contenuti multimediali: http: //www.prnewswire.com/news-releases/rigel-reports-fourth-quarter-and-full-year-2019-financial-results-and-provides-business-update-301012875 .html

FONTE Rigel Pharmaceuticals, Inc.

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Il rapporto sul mercato globale della consegna di droghe topiche di dermatologia globale mostra l'idea di un'analisi di alto livello dei principali segmenti di mercato e l'identificazione delle opportunità. Questo rapporto di mercato realizza un'analisi completa dei profili dei principali attori del mercato che fornisce un panorama competitivo. L'analisi del mercato e la segmentazione del mercato sono state condotte in termini di mercati, ambito geografico, anni considerati per lo studio, valuta e prezzi, metodologia di ricerca, interviste primarie con i principali opinion leader, griglia di posizione di mercato DBMR, matrice di sfida di mercato DBMR, fonti secondarie, e ipotesi. Il rapporto mostra importanti sviluppi del prodotto e tiene traccia delle recenti acquisizioni, fusioni e ricerche nel settore da parte dei principali attori.

Il mercato globale della consegna di farmaci per dermatologia Rx globale dovrebbe raggiungere 40.646,26 milioni di USD entro il 2026 da 29.475,18 milioni di USD nel 2018, crescendo a un CAGR del 4,2% nel periodo di previsione dal 2019 al 2026.

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Analisi competitiva:

Alcuni dei principali attori che operano in questo mercato sono Galderma Laboratories, LP, Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc., Pfizer Inc., LEO Pharma A / S, GlaxoSmithKline plc., ALLERGAN, Bayer AG, 3M, Bausch Health Companies Inc., The Lubrizol Corporation, Cipla Inc., Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. tra gli altri.

I farmaci topici svolgono un ruolo importante nella terapia delle malattie dermatologiche. I farmaci per dermatologia topica incorniciano una grande percentuale di prodotti nel mercato dei farmaci. Questi prodotti sono fabbricati attraverso processi di produzione specializzati come riempimento di volume preciso, miscelazione su larga scala, riscaldamento e imballaggio.

La somministrazione topica di farmaci può essere effettuata nel corpo attraverso percorsi oftalmici, rettali, vaginali e cutanei come vie topiche. Nel settore della dermatologia, la pelle svolge un ruolo importante nella somministrazione di farmaci topici per il trattamento delle malattie della pelle nei pazienti. I preparati topici vengono applicati sulla pelle per effetti superficiali, locali o sistemici. Le formulazioni topiche includono ingredienti terapeuticamente attivi che aiutano a trattare le malattie della pelle nei pazienti.

Il rilascio topico di farmaci è uno dei modi più efficaci di rilascio di farmaci in quanto fornisce risultati terapeutici ottimali. A poco a poco, il sistema topico di consegna dei farmaci è diventato sempre più importante nell'industria farmaceutica. La risposta farmacologica, sia l'effetto terapeutico desiderato sia l'effetto indesiderato indesiderato di un farmaco dipendono dalla concentrazione del farmaco nel luogo di azione, che a sua volta dipende dalla forma di dosaggio e dall'entità dell'assorbimento del farmaco nel sito di azione. Nel settore della dermatologia, molecola di farmaco applicata sulla pelle che penetra principalmente attraverso il percorso intercellulare tortuoso e continuo. Questi prodotti sono disponibili in diverse forme come unguenti, creme, lozioni, gel e altri che hanno la capacità di essere assorbiti nel corpo e mostrano rispettivamente la risposta positiva nella guarigione della ferita.

Mercato globale di consegna di farmaci topici dermatologici per tipo di prodotto (semisolido, liquido, solido), applicazione (infezioni della pelle, dermatite, antiaging, acne, iperpigmentazione, rosacea, cancro della pelle, psoriasi, onicomicosi, altri), categoria (marchiato, generico ), Geografia (Nord America, Europa, Asia-Pacifico, Sud America, Medio Oriente e Africa) – Tendenze e previsioni del settore fino al 2026

Segmentazione: Mercato globale della consegna di farmaci per dermatologia Rx globale

Il mercato globale della consegna di farmaci topici dermatologici Rx è segmentato in base al tipo di prodotto, all'applicazione e alla categoria.

  • Sulla base del tipo di prodotto, il mercato è segmentato in solido, liquido e semisolido. Il solido è sottosegmentato in polvere e altri. Il liquido viene suddiviso in soluzione, emulsione, sospensione, lozione e altri. Semisolid è sottosegmentato in creme, gel, unguenti, pasta, altri.
    • Nel dicembre 2016, Pfizer Inc. ha ricevuto l'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) statunitense per il prodotto chiamato EUCRISATM (crisaborole) unguento al 2%. È un nuovo inibitore topico non steroideo della fosfodieterasi-4 (PDE-4). È usato per il trattamento della dermatite atopica da lieve a moderata (AD). Con questo lancio del prodotto l'azienda ha costruito un patrimonio nel settore dell'infiammazione e dell'immunologia.
  • Sulla base dell'applicazione, il mercato è segmentato in acne, dermatite, psoriasi, infezioni della pelle, antiaging, cancro della pelle, iperpigmentazione, onicomicosi, rosacea, altri.
    • Nel marzo 2017, Galderma Laboratories, L.P., produttori del marchio Cetaphil hanno lanciato sette nuovi prodotti per la cura della pelle del viso. Con questo lancio dei prodotti il ​​portafoglio Cetaphil dell'azienda è aumentato. La società ha ora un'ampia gamma di soluzioni specializzate per i pazienti con problemi di pelle, tra cui idratazione e altri.
  • Sulla base della categoria, il mercato è segmentato in generico e marchiato.
    • Nel febbraio 2016, Allergan plc ha ricevuto un'approvazione per il suo prodotto ACZONE (dapsone) Gel, 7,5% dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti. Questo prodotto è un nuovo trattamento topico di prescrizione che è utile per il trattamento dell'acne nei pazienti di età pari o superiore a 12 anni. Il prodotto ha aiutato il paziente a trattare facilmente l'acne che alla fine ha contribuito ad aumentare le entrate.

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Recenti sviluppi:

  • Nell'aprile 2016, Allergan plc ha acquisito Topokine Therapeutics, Inc. con un pagamento anticipato di 85,8 milioni di USD ed è stato idoneo a ricevere pietre miliari potenziali di sviluppo e commercializzazione fino a 260,0 milioni di USD.
  • Nel febbraio 2019, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. ha concluso un accordo di licenza e distribuzione esclusiva per la formulazione topica di onicomicosi nella Repubblica popolare cinese. Secondo l'accordo Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., ha fornito il diritto esclusivo per lo sviluppo e la commercializzazione del Prodotto in RPC e questo ha portato a un'elevata generazione di entrate.
  • Nell'aprile 2019, The Lubrizol Corporation ha lanciato il suo nuovissimo modificatore di reologia 2 in 1 multifunzionale, polimero Carbopol Style 2.0. Il prodotto ha i benefici per la cura della pelle come l'aspetto liscio lucido, le texture uniche e altro. Con questo lancio è aumentato il portafoglio di prodotti dell'azienda che ha comportato una maggiore generazione di entrate.
  • Nell'agosto 2018, Cipla INC. Ha ricevuto l'approvazione finale per la nuova domanda abbreviata di farmaci (ANDA) per Diclofenac Sodium Topical Gel, 1% dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti (US FDA). Per questo motivo l'azienda ha aumentato il proprio portafoglio di prodotti e una forte posizione sul mercato, specialmente nel campo della dermatologia.
  • Nel novembre 2010, 3M ha rilanciato la linea Cavilon Professional Skin Care. Questo prodotto ha aiutato a prevenire danni alla pelle da umidità, attrito e traumi adesivi. Il portafoglio di prodotti dell'azienda è aumentato per quanto riguarda la dermatologia archiviata e quindi le entrate sanitarie.

Opportunità:

BASSA PENETRAZIONE BIOLOGICA:

I biologici sono i farmaci che sono fatti da proteine ​​animali o umane che hanno la capacità di trattare rispettivamente le malattie. Hanno la capacità di trattare il numero di malattie come la psoriasi, l'artrite psoriasica, altri tipi di artrite e malattie infiammatorie intestinali. A causa della bassa attività dei farmaci biologici nel trattamento di eventuali malattie del derma, i farmaci topici stanno superando il mercato a fini terapeutici e quindi la sua domanda è in aumento sul mercato.

AUMENTO DEL CONCORSO CHE GUIDA AD ALTI INVESTIMENTI IN R&S PER INNOVARE NUOVI PRODOTTI:

La malattia della pelle negli ultimi tempi è una delle principali malattie tra le persone per le quali sono disponibili trattamenti. Uno dei trattamenti avanzati è il sistema topico di rilascio del farmaco in cui la pelle svolge un ruolo importante poiché il farmaco viene applicato sulla pelle che ha la capacità di trattare le aree colpite. Numero di aziende ha preso l'iniziativa nel fornire alta qualità di prodotti o farmaci per il trattamento delle malattie della pelle. Ciò comporta il processo di innovazione nella ricerca farmaceutica. L'aumento del numero di malattie richiede un trattamento adeguato per il quale i farmaci topici svolgono attualmente un ruolo importante. Di conseguenza, molte aziende hanno aumentato le proprie strutture di ricerca e sviluppo al fine di fornire i farmaci che saranno ritenuti un fattore importante per guidare il mercato in futuro.

AUMENTO DI FUSIONI E ACQUISIZIONI:

Le industrie farmaceutiche probabilmente subiscono la maggior parte delle attività di fusione e acquisizione (M&A) rispetto a qualsiasi altra industria che coinvolge il numero di operazioni e la spesa in denaro. Questa attività è necessaria a causa dell'aumento dello sviluppo di un nuovo farmaco nell'industria farmaceutica. Ad esempio, a luglio 2018, Leo Pharma ha acquisito un'unità globale di dermatologia su prescrizione di Bayer AG (Germania) a un prezzo non divulgato. Lo scopo di questa acquisizione era di espandere il loro prodotto nei farmaci per la pelle. Leo Pharma sviluppa ulteriormente l'attività di dermatologia su prescrizione con questa acquisizione. L'aumento delle acquisizioni e delle fusioni aiuta le aziende a rafforzare i propri ricavi insieme a strutture di ricerca e sviluppo e produzione e questo ultimo aiuto nella crescita di un particolare mercato.

MERCATO EMERGENTE:

L'elevata accessibilità per i pazienti sta portando a maggiori investimenti da parte del settore privato. Molte aziende si stanno concentrando sull'intraprendere sviluppi strategici per aumentare la loro presenza nelle economie emergenti. Insieme a questo, l'invecchiamento della popolazione e l'aumento del reddito disponibile contribuiranno alla crescita del mercato. Il mercato di consegna di farmaci topici ha una grande opportunità in quanto questa piattaforma ha nuovi elementi che sono stati incorporati per il trattamento di malattie della pelle e delle mucose. Le condizioni della pelle stanno aumentando in tutto il mondo, che alla fine richiede un trattamento. Aumentare la consapevolezza delle malattie della pelle è anche un fattore che sta aiutando il mercato a crescere in futuro.

sfide:

EFFETTI COLLATERALI:

L'effetto collaterale dei farmaci si verifica nell'uomo a causa dell'uso a lungo termine dei farmaci. Ci sono alcuni effetti collaterali che possono verificarsi nel corpo del paziente dopo aver consumato farmaci topici. Ad esempio, il consumo a lungo termine di corticosteroidi può causare difetti alla nascita nel feto. I farmaci topici possono fornire un trattamento migliore ma a parte questo anche il prodotto ha effetti collaterali. Ciò accade a causa dell'uso eccessivo di trattamenti topici che aumentano il rischio di effetti collaterali sia cutanei che sistemici e quindi ostacolano la crescita del mercato.

RICHIAMO DEL PRODOTTO:

Negli ultimi anni, il numero di richiami di prodotti nel mercato topico della consegna di droghe è aumentato enormemente. Questi richiami di prodotti possono verificarsi a causa di inadempienza della conformità, come difetti di progettazione o di fabbricazione che possono essere negoziati con la sicurezza, l'efficacia e la purezza del farmaco o dei dispositivi di consegna del farmaco da parte di un'azienda produttrice di farmaci. Ad esempio, a luglio 2016, GlaxoSmithKline (Regno Unito) ha annunciato il richiamo dell'unguento Bactroban e della crema Bactroban a causa della presenza di contaminazione durante la produzione; queste formulazioni sono state usate localmente per le infezioni della pelle. Inoltre, a giugno 2016, il cerotto per emicrania di Teva Phamaceutical chiamato Zecuity è stato ricordato per aver riportato gravi ustioni e potenziali cicatrici permanenti. Il richiamo dei prodotti influisce sui ricavi dell'azienda e, in definitiva, sul mercato particolare.

Nota: se hai esigenze particolari, faccelo sapere e ti offriremo il rapporto come desideri.

Informazioni sulla ricerca di mercato di Data Bridge:

Data Bridge Market Research si è affermata come una società di ricerca e consulenza di mercato non convenzionale e neoterica con un livello di resilienza senza precedenti e approcci integrati. Siamo determinati a scoprire le migliori opportunità di mercato e promuovere informazioni efficienti per far prosperare il tuo business sul mercato. Data Bridge si impegna a fornire soluzioni adeguate alle complesse sfide aziendali e avvia un processo decisionale senza sforzo.

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L'ulcera di Buruli, una malattia infettiva tropicale trascurata, è causata da Mycobacterium ulcerans. Senza trattamento, le sue lesioni possono progredire fino a ulcere cutanee croniche, ma nel 5% dei casi si osserva una guarigione spontanea, il che suggerisce la possibile istituzione di una strategia ospite per contrastare gli effetti di M. ulcerans. Riveliamo qui una firma umorale locale specifica della pelle del processo di guarigione spontanea, associata a un aumento delle cellule produttrici di anticorpi e al riconoscimento specifico del miocolattone da parte della sottoclasse di immunoglobuline IgG2a di topo. Dimostriamo la produzione di anticorpi specifici per la pelle che neutralizzano l'attività immunomodulatoria della tossina del micolattone e confermiamo il ruolo dei macchinari dell'ospite umano nell'innescare risposte immunitarie locali efficaci mediante il rilevamento di anticorpi anti-micolattone nei pazienti con ulcera di Buruli. Le nostre scoperte aprono la strada a sostanziali progressi sia nella diagnosi che nel trattamento dell'ulcera di Buruli in conformità con le sfide più recenti emesse dall'Organizzazione mondiale della sanità.

INTRODUZIONE

Ulcera di Buruli, una malattia tropicale trascurata causata da Mycobacterium ulcerans, è la terza malattia micobatterica più comune al mondo dopo la tubercolosi e la lebbra (1). Questa malattia infettiva cronica è caratterizzata dalla distruzione del tessuto cutaneo, che porta allo sviluppo di grandi lesioni ulcerative. Questa distruzione dei tessuti è causata da una tossina lipidica unica chiamata mycolactone, prodotta da M. ulcerans. Il micolattone è citotossico ad alte dosi, ma, a dosi più basse, modula il dolore e le risposte immunitarie, facilitando la colonizzazione dell'ospite (26). Nonostante questa secrezione di tossina, gli approcci sperimentali, supportati da osservazioni nei pazienti umani, hanno rivelato che la modulazione della risposta immunitaria da parte del micolattone è locale e regionale piuttosto che sistemica (7, 8). Inoltre, la risposta umorale sistemica a M. ulcerans l'infezione è debole (8), e M. ulcerans è scarsamente riconosciuto dagli anticorpi circolanti (9). Le analisi istologiche dei tessuti dei pazienti hanno dimostrato che le lesioni dell'ulcera di Buruli sono circondate da una massiccia infiltrazione infiammatoria dei leucociti (10). Questa infiltrazione locale è stata caratterizzata nei topi e ha dimostrato di essere costituita principalmente da fagociti (principalmente macrofagi e neutrofili) e linfociti (8). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la risposta immunitaria non può controllare lo sviluppo della lesione, nonostante il reclutamento di diversi attori principali del sistema immunitario. Questo fallimento dell'immunità dell'ospite è una conseguenza della strategia utilizzata da M. ulcerans per sfuggire al sistema immunitario.

I precedenti studi sopra descritti sono stati eseguiti durante le fasi preulcerative e ulcerative. Nessuno studio ha mai preso in considerazione questi processi immunitari durante la fase di guarigione spontanea. L'ulcera di Buruli può essere trattata con antibiotici nelle prime fasi. Tuttavia, nonostante il significativo miglioramento dei trattamenti, circa il 10-15% dei pazienti con ulcera di Buruli diventa invalido permanente secondo l'Organizzazione mondiale della sanità (1114). Inoltre, le lesioni non trattate possono diffondersi agli arti interi e progredire verso ulcere cutanee croniche (11). Tuttavia, in assenza di cure mediche, la guarigione spontanea si verifica nel 5% dei casi, come recentemente riportato in Africa e confermato dalla guarigione spontanea di pazienti australiani non trattati con M. ulcerans infezioni (15, 16), suggerendo la possibile istituzione di una strategia per contrastare gli effetti di M. ulcerans nell'host. Questa osservazione rivela un ruolo dell'ospite nel controllo dello sviluppo della lesione. Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi attorno ai siti di M. ulcerans infezione, suggerendo una risposta adattativa locale specifica (10, 17). Le cellule B producono immunoglobulina (Ig) e costituiscono il braccio umorale del sistema immunitario. Questi linfociti hanno ruoli sia proinfiammatori che soppressivi nella fisiopatologia dei disturbi infiammatori della pelle (18). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule B associate alla pelle sono diverse dalle cellule linfonodali B (19). Questa specifica risposta umorale locale può migliorare la difesa e l'immunità locali nel contesto delle malattie infiammatorie croniche della pelle (20). Tuttavia, la risposta umorale locale mediata da anticorpi, per quanto ne sappiamo, non è mai stata studiata nel corso di M. ulcerans infezione, compresa la fase di guarigione spontanea. Utilizzando il nostro modello di topo originale che riproduce le caratteristiche chiave della malattia umana (inclusa la guarigione spontanea dopo la fase ulcerosa, come precedentemente descritto da Marion et al. (8)), abbiamo studiato il ruolo potenziale degli anticorpi locali naturali, riconoscendo il micolattone prodotto da M. ulcerans. I nostri risultati confermano la presenza di questi anticorpi nell'uomo.

RISULTATI

Produzione di Igs cutanee durante M. ulcerans infezione

Abbiamo studiato la risposta umorale locale durante M. ulcerans infezione, incluso il processo di guarigione spontanea, valutando l'espressione del gene Ig attraverso analisi dei livelli di mRNA nei campioni di tessuto cutaneo. Il modello del mouse FVB / N (che mostra la guarigione spontanea) è stato confrontato con il mouse C57BL / 6 (che non mostra tale guarigione). I livelli relativi di mRNA per IgM, IgA e IgG sono rimasti stabili in entrambi i modelli durante le prime fasi dell'infezione (fig. S2). Tuttavia, i livelli di mRNA per tutti e tre gli isotipi Ig sono aumentati significativamente nei topi FVB / N nella fase ulcerosa (giorno 45), raggiungendo un picco durante la fase di guarigione (giorno 75). I livelli di mRNA che codificano questi tre isotipi erano significativamente più alti (P <0,05 per IgM e IgG e P <0,01 per IgA, Mann-Whitney U test) nei topi FVB / N nella fase di guarigione rispetto ai topi C57BL / 6 nella fase necrotica. Abbiamo caratterizzato i profili di Ig dei tessuti infetti stimando le concentrazioni di IgM, IgA e IgG mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Coerentemente con i dati di mRNA, i livelli totali di Ig sono aumentati nei tessuti cutanei dei topi FVB / N durante M. ulcerans infezione (Fig. 1, da A a C). Tuttavia, nonostante l'assenza di chiari cambiamenti nei livelli locali di mRNA Ig nei topi C57BL / 6, abbiamo osservato un aumento della concentrazione di Ig nei tessuti durante M. ulcerans infezione in questi topi (Fig. 1, da A a C). Sono state rilevate differenze nelle concentrazioni di IgM e IgG tra i due ceppi di topo. I livelli di IgG nei topi FVB / N erano due volte quelli nei topi C57BL / 6 (P <0,01, Mann-Whitney U test) sia durante il rossore che nelle fasi ulcerative ed erano 1,6 volte più alti (P <0,05, Mann-Whitney U test) durante il processo di guarigione rispetto allo stadio necrotico, mentre i livelli di IgM erano più alti nei topi C57BL / 6 dallo stadio ulcerativo (2,7 volte più alti; P <0,01, Mann-Whitney U test) fino alla necrosi (7,8 volte superiore; P <0,01, Mann-Whitney U test). Queste differenze, evidenti fin dalle prime fasi, potrebbero riflettere alti livelli di Ig in circolazione. Tuttavia, non sono state rilevate differenze significative nei livelli di queste Ig tra i campioni di siero dei due ceppi di topo durante le prime fasi dell'infezione (Fig. 1, da D a F). Nonostante l'assenza di cambiamenti sistemici rilevabili, le Ig possono accumularsi nei tessuti durante l'infiammazione (come recentemente descritto (21)), potenzialmente tenendo conto delle differenze osservate tra RNA e livelli proteici. Infine, il corso di M. ulcerans l'infezione è associata a una risposta umorale locale, con i seguenti profili di Ig: IgM> IgG> IgA nei topi C57BL / 6 e IgG> IgM> IgA nei topi FVB / N. Sembra quindi che ci sia una specifica firma di immunità umorale del processo di guarigione, in cui prevale l'IgG.

Fig. 1 Quantificazione di IgM, IgA e IgG nei tessuti cutanei nel sito di inoculazione e nel siero.

Cinetica della produzione di Ig, dopo inoculazione con vitale M. ulcerans bacilli, valutata da ELISA quantitativa. (UN per C) Campioni di tessuto cutaneo (n = 5 per ciascun ceppo), per i quali sono state normalizzate le concentrazioni proteiche e (D per F) campioni di siero (n = 5 per ogni ceppo). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 e **P <0,01 (confronto della titolazione di Ig nei topi FVB / N e C57BL / 6 in ogni stadio della malattia; Mann Whitney U test).

Riconoscimento di M. ulcerans lisato da anticorpi IgG locali

Come tutti i micobatteri, M. ulcerans ha un vasto repertorio antigenico (lipoarabinomannano (LAM), proteine ​​di membrana superficiale e vescicole extracellulari) che può innescare la produzione di anticorpi specifici da parte dell'ospite (22). Abbiamo quindi studiato la specificità della produzione locale di Ig, valutandone la capacità di riconoscere M. ulcerans lisato a cellule intere in ELISA. Le IgG erano l'unico isotipo di Ig in grado di legarsi M. ulcerans componenti di lisato (fig. S3A). Questo riconoscimento è diventato più forte con successive fasi di infezione nei topi FVB / N e C57BL / 6 ed è stato massimo durante le fasi di guarigione e necrosi (P <0,01, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi valutato la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti (fig. S3B). Alti livelli di IgG1 che si legano a M. ulcerans componenti di lisato sono stati osservati in entrambi i modelli di topo. Il legame con IgG1 è stato rilevato all'inizio nella fase di arrossamento nei topi FVB / N e successivamente nella fase di edema nei topi C57BL / 6 (P <0,01 per la differenza tra i due modelli di topo nella fase di arrossamento, Mann-Whitney U test). Al contrario, IgG3 ha riconosciuto M. ulcerans componenti di lisato molto debolmente ma allo stesso modo nei due ceppi di topo. La principale differenza tra i topi FVB / N e C57BL / 6 riguardava le sottoclassi di IgG2a / b. IgG2a riconosciuta M. ulcerans componenti in tutte le fasi dell'infezione (dallo stadio ulcerativo a quello di guarigione) nei topi FVB / N ma sembra essere assente nei topi C57BL / 6. L'ultima sottoclasse, IgG2b, riconosciuta M. ulcerans lisare significativamente più fortemente nei topi C57BL / 6, dallo stadio ulcerativo a quello necrotico, rispetto ai topi FVB / N in stadi equivalenti (P <0,05, Mann-Whitney U test). In conclusione, le risposte umorali locali differivano tra i topi FVB / N (modello di guarigione) e i topi C57BL / 6 (nessuna guarigione spontanea). Questa differenza riguardava principalmente due sottoclassi di Ig specifiche: (i) IgG2a, prodotta solo nel modello di guarigione, e (ii) IgG2b, che riconosceva M. ulcerans componenti fortemente solo nel modello C57BL / 6. Questi risultati suggeriscono un ruolo potenziale per IgG2a nel controllo M. ulcerans infezione nel modello di guarigione FVB / N.

Riconoscimento del mycolactone da parte di anticorpi cutanei locali

La capacità dei topi FVB / N di guarire spontaneamente dopo M. ulcerans l'infezione potrebbe essere spiegata, in parte, dalla produzione di anticorpi che riconoscono la tossina batterica, il micolattone. Abbiamo studiato la specificità di questi anticorpi locali per il micolattone nei tessuti della pelle eseguendo ELISA (Fig. 2). Le IgM prodotte localmente in entrambi i ceppi di topo non sono state in grado di riconoscere il miocolattone. IgA, che è noto per proteggere i tessuti (cioè le cellule epiteliali) dalle tossine batteriche (23), legato il micolattone a bassi livelli solo durante lo stadio ulcerativo nei topi FVB / N. Come osservato per M. ulcerans lisato, IgG ha riconosciuto il micolattone ad alti livelli in entrambi i modelli di topo durante l'infezione. Livelli significativamente più alti di riconoscimento del miocolattone da parte delle IgG sono stati osservati nei topi C57BL / 6 nella fase necrotica rispetto ai topi FVB / N nella fase di guarigione (P <0,05, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi analizzato i sottotipi di IgG in ogni fase dell'infezione. Dallo stadio dell'edema allo stadio ulcerativo, IgG1 sembrava essere una sottoclasse in grado di legare il micolattone a livelli più alti nei topi FVB / N rispetto a C57BL / 6, mentre IgG2b sembrava riconoscere il micolattone a livelli più alti e dalle fasi precedenti esclusivamente in C57BL / 6 topi (P <0,01 per IgG1 in FVB / N rispetto a topi C57BL / 6 e P <0,01 per IgG2b nello stadio ulcerativo nei topi C57BL / 6 rispetto ai topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Durante l'ultima fase dell'infezione (necrosi contro guarigione), sono state fatte le stesse osservazioniP <0,05 contro topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Il profilo legante il miocolattone di IgG3 era simile in entrambi i modelli di topo. Infine, per quanto riguarda il riconoscimento di M. ulcerans lisato, la principale differenza riguardava la sottoclasse di IgG2a, che sembrava essere specifica per topi FVB / N. Questa sottoclasse ha legato la tossina dallo stadio ulcerativo allo stadio di guarigione. La mancanza del rilevamento di IgG2a nei test eseguiti su topi C57BL / 6 può essere spiegata da una mutazione del gene IgG2a in questi topi (24). Abbiamo eseguito saggi in un altro modello di topo che non mostravano guarigione spontanea (topi BALB / c), in cui il gene IgG2a è presente e funzionale, per escludere la possibilità di esclusione di un fenotipo specifico del ceppo e confermare l'importanza di questa proteina nella guarigione processo e nel legame con il miocolattone. L'anticorpo IgG2a prodotto dai topi BALB / c non ha riconosciuto il miocolattone (vedere fig. S4). Insieme, questi risultati rivelano l'esistenza di diversi profili di riconoscimento del miocolattone tra i modelli murini di guarigione e infezione necrotica. IgG2b sembra essere una sottoclasse specifica in grado di riconoscere M. ulcerans tossina nei topi C57BL / 6, ma non è in grado di controllare efficacemente l'infezione. Al contrario, IgG2a era specifica per il modello di guarigione spontanea (topi FVB / N) e può essere coinvolta nel controllo di M. ulcerans infezione associata a guarigione spontanea.

Fig.2 Rilevazione del legame IgG cutaneo al micolattone mediante ELISA quantitativo.

Ogni pozzetto di una piastra ELISA MaxiSorp è stato rivestito con 3 ng di micolattone e le concentrazioni di Ig dei campioni di tessuto cutaneo sono state normalizzate prima della loro aggiunta alla piastra. Gli anticorpi che si legano al micolattone sulla piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP). (UN) Rilevazione di IgG, IgM e IgA e (B) IgG1, IgG2a, IgG3 e IgG2b che riconoscono il micolattone nel tessuto cutaneo da topi FVB / N e C57BL / 6 in varie fasi dell'infezione (sano, arrossamento, ulcera, necrosi o guarigione) (n = Da 3 a 5 topi per ceppo di topo). Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,1. Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,5, **P <0,01 (Mann-Whitney U test).

Neutralizzazione del micolattone da parte degli anticorpi presenti nella pelle

Abbiamo studiato la capacità di questi anticorpi di riconoscere e neutralizzare il miocolattone, valutando la loro capacità di neutralizzare le proprietà immunomodulanti della tossina. È noto che il micolattone inibisce la produzione di citochine infiammatorie legandosi al translocon Sec61 (25). Abbiamo basato il nostro test di neutralizzazione su questo effetto e quindi incubato i linfociti T stimolati (modello cellulare che produce citochine qui usato come strumento di lettura) con solo il miocolattone o con il miocolattone precedentemente incubato con IgG purificato dalla pelle di topi FVB / N e C57BL / 6 e quindi confrontato la produzione di interleuchina-2 (IL-2) e interferone-γ (IFN-γ) dopo 6 ore. Il contatto tra le cellule T e la tossina ha notevolmente ridotto i livelli di produzione di IL-2 e IFN-γ rispetto al controllo positivo (solo cellule T stimolate) in entrambi i modelli di topo (Fig. 3). Al contrario, la produzione di queste due citochine era simile al controllo positivo per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate dalla pelle di topi FVB / N ma non per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate da Topi C57BL / 6. Pertanto, le IgG prodotte nella pelle dei topi FVB / N durante la fase di guarigione possono neutralizzare la M. ulcerans tossina. Questa neutralizzazione può essere coinvolta nel processo di guarigione.

Fig. 3 Neutralizzazione del micolattone da Ig cutanea da topi FVB / N infetti da M. ulcerans.

CD4+ i linfociti sono stati stimolati con phorbol 12-miristate 13-acetate / ionomicina. Il micolattone è stato usato ad una concentrazione di 4 ng / ml. Igs purificate dalla pelle di (UN) Topi FVB / N o (B) C57BL / 6 topi infetti da M. ulcerans sono stati usati con un rapporto di 10 molecole di Ig per molecola di micolattone. Sinistra: quantificazione IL-2; a destra: quantificazione IFN-γ. I dati mostrati corrispondono a un esperimento eseguito in triplicato (significa ± SD). *P <0,05 e **P <0,01 (Student's t test).

Emersione locale di cellule produttrici di anticorpi durante M. ulcerans infezione

Sulla base dell'ipotesi di una risposta immunitaria umorale locale stabilita durante la guarigione spontanea, abbiamo valutato la rilevanza fisiologica di questo processo studiando la presenza di cellule B che producono anticorpi in vivo. Abbiamo usato la colorazione a quattro colori per analizzare le popolazioni di cellule B da topi FVB / N e identificato tre popolazioni: (P1) cellule con un CD45+, CD19+, B220+ fenotipo corrispondente alle cellule B; (P2) CD45+, CD19+, B220int cellule corrispondenti ai plasmablasti; e (P3) CD45+, CD19, B220int, CD138+ cellule, corrispondenti ai marcatori murini dell'ultimo stadio della maturazione delle cellule B, cellule del plasma (26). La frequenza delle cellule linfoidi (CD45+) aumentato di 37 volte rispetto al controllo della pelle durante il processo di guarigione spontanea (Fig. 4A). Di conseguenza, il numero totale di cellule B è aumentato, ma le proporzioni dei vari sottoinsiemi sono rimaste costanti. L'unica modifica osservata è stata un aumento della proporzione di cellule linfoidi totali rappresentate dal sottogruppo di plasmacellule, che è aumentato dallo 0,04 allo 0,63% (corrispondente ad un aumento di 43-19,732 plasmacellule / g di pelle) durante i primi passi del processo di guarigione spontanea (giorno 55), mentre tale aumento non è stato osservato nella pelle non infetta (controllo), come mostrato in Fig. 4C. La presenza di questo sottotipo di cellula B specifica è stata confermata dall'analisi istologica (Fig. 4B). La proporzione di cellule B simili a B1 (CD45+, CD19+, B220int, CD43+), un sottoinsieme specifico che ha dimostrato di produrre anticorpi specificamente nella pelle (27), aumentato durante la guarigione spontanea, raggiungendo lo 0,07% delle cellule linfoidi totali (vedi fig. S5). La proporzione di queste cellule produttrici di anticorpi è diminuita quando la lesione sembra essere completamente guarita (giorno 75) ma è rimasta più alta di quella nella pelle di controllo. I nostri risultati mostrano quindi che il numero di cellule produttrici di anticorpi aumenta fortemente nella pelle durante il processo di guarigione spontanea, supportando un ruolo per la risposta umorale locale in questo fenomeno, attraverso la produzione di anticorpi anti-micolattone.

Fig. 4 Apparizione di plasmacellule (CD138+) nella pelle durante M. ulcerans infezione nel modello murino FVB / N di guarigione spontanea.

(UN) Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso a quattro colori con la colorazione specifica delle cellule linfoidi totali (CD45+), Cellule B (popolazione P1 = CD45+, CD19+, B220+), plasmablasti (popolazione P2 = CD45+, CD19+, B220int) e plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+). I risultati mostrati qui provengono da un esperimento rappresentativo eseguito in duplicato. (B) Infiltrazione infiammatoria locale (inserto) nel derma di M. ulcerans topi infetti nella fase ulcerosa, tipici di M. ulcerans infezione. ep, epidermide. Immunocolorazione mostra CD138+ plasmacellule (cellule B attivate in grado di produrre anticorpi) nel derma. (C) Analisi di citometria a flusso che mostra l'emergenza di plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+) durante le prime fasi del processo di guarigione spontanea (il controllo è la pelle non infetta). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 (Student's t test). Barre di scala, 160 μm (parte superiore B), 80 μm (parte superiore B, inserto), 100 μm (parte inferiore B) e 20 μm (parte inferiore B, inserto).

Riconoscimento del mycolactone da parte di IgG locali purificate da campioni di biopsia cutanea da pazienti con ulcera di Buruli

Oltre a questa dettagliata caratterizzazione delle Ig anti-micolattone nei topi, abbiamo anche valutato i livelli di queste IgG nei pazienti con ulcera di Buruli. Abbiamo utilizzato ELISA per rilevare gli anticorpi anti-micolattone nei campioni di pelle di pazienti (con o senza diagnosi di ulcera di Buruli) forniti dal Centro di diagnosi e trattamento della Lèpre e dell'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin ). Nel 73% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), è stata diagnosticata la forma più grave della malattia: una lesione ulcerosa (che può essere associata ad altre forme, come edema o placche). Il micolattone è stato riconosciuto dagli anticorpi locali recuperati dalle lesioni del 60% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (9 su 15) (tutti presentanti un'ulcera), mentre il micolattone è stato rilevato in un solo campione di biopsia dai pazienti di controllo (non diagnosticato Ulcera di Buruli; P <0,05, Mann-Whitney U test; Fig. 5). Da allora questo particolare paziente ha sviluppato un carcinoma a cellule squamose, una malattia che si verifica dopo alcune lesioni dell'ulcera di Buruli (27, 28). Pertanto, non possiamo escludere la possibilità che questo paziente abbia già avuto una lesione a causa M. ulcerans infezione. Infine, potrebbero esserci diverse ragioni per la mancanza di rilevazione di IgG leganti il ​​miocolattone nel 40% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (6 su 15) come il tipo di lesione, il sito di campionamento (distanza dal sito di infezione) e la durata del trattamento. Infine, forniamo qui la prima dimostrazione che l'organismo umano può generare un'efficace risposta umorale che coinvolge la produzione di anticorpi che riconoscono il miocolattone durante M. ulcerans infezione.

Fig. 5 Rilevazione di Ig cutanee che si legano al micolattone nelle lesioni dei pazienti con diagnosi di ulcera di Buruli.

I pozzetti sono stati rivestiti con mycolactone e gli anticorpi che si legano al mycolactone nella piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con HRP. Il CDTUB di Pobè (Benin) ha fornito campioni di biopsia da pazienti con ulcera di Buruli sospetta e / o confermata dalla PCR. Nei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR, sono state eseguite biopsie su lesioni attive. Pertanto, non è stato possibile identificare i pazienti che successivamente manifestano una guarigione spontanea. Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,150. **P <0,05 (Mann Whitney U test). Gruppo dell'ulcera di Buruli, n = 15; gruppo di controllo, n = 19. OD, densità ottica.

DISCUSSIONE

L'ulcera del buruli è una malattia tropicale trascurata che rimane la terza malattia micobatterica più comune al mondo. Questa malattia della pelle debilitante è causata da M. ulcerans, che produce una tossina lipidica, il micolattone, il principale fattore di virulenza del bacillo. Senza trattamento, le lesioni possono evolvere in ulcere cutanee croniche. Tuttavia, queste gravi lesioni possono guarire spontaneamente, come osservato nel 5% dei casi, suggerendo che i meccanismi per contrastare gli effetti di M. ulcerans può svilupparsi nell'host. Nonostante lo sviluppo di modelli animali, i meccanismi del processo di guarigione spontanea rimangono poco chiari. In precedenza avevamo mostrato (i) l'assenza di una firma di risposta cellulare immunitaria sistemica e (ii) un debole coinvolgimento della risposta immunitaria cellulare locale nel passaggio dall'infezione acuta a quella cronica (8). Questi risultati evidenziano le conseguenze locali della malattia, osservate con altri approcci (7, 29). Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi intorno al sito di M. ulcerans infezione (10). Sono stati osservati infiltrati di cellule B in condizioni infiammatorie croniche della pelle, tra cui la leishmaniosi cutanea e la dermatite atopica (30, 31). Il dibattito sul ruolo pro o antinfiammatorio delle cellule B della pelle continua, ma queste cellule hanno dimostrato di essere coinvolte nella risoluzione dell'infiammazione cutanea in un modello murino di infiammazione simile alla psoriasi (32). Inoltre, oltre a produrre localmente anticorpi, è stato dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo nel processo di guarigione delle ferite (33).

In questo contesto, abbiamo usato il nostro modello murino di guarigione spontanea per studiare la risposta umorale in tutte le fasi M. ulcerans infezione, compresa la guarigione spontanea. Abbiamo dimostrato la presenza di cellule B che producono anticorpi durante l'infezione e il loro aumento del numero durante l'infezione, raggiungendo un picco durante le prime fasi della guarigione spontanea (il passaggio dall'ulcerazione alla guarigione). Abbiamo rilevato Igs in grado di riconoscere la tossina lipidica di M. ulcerans, mycolactone, in tutte le fasi dell'infezione. Queste Ig sono state trovate nella pelle dei topi infetti ma non nei loro sieri. Forniamo anche la prima dimostrazione della presenza di queste Ig nei campioni di biopsia di pazienti con ulcera di Buruli. Nessun anticorpo anti-micolattone è mai stato rilevato nel siero di pazienti. Collettivamente, questi risultati evidenziano l'esistenza di una firma umorale distinta in risposta a M. ulcerans infezione, con la produzione specifica di pelle di anticorpi contro il miocolattone.

Sembra probabile che la guarigione spontanea osservata nei topi FVB / N sia innescata da fattori genetici dell'ospite. In particolare, i topi FVB / N presentano modifiche di due elementi coinvolti nella risposta immunitaria: (i) una carenza nella secrezione del componente 5 del complemento e (ii) un polimorfismo NLRP. Tuttavia, abbiamo precedentemente osservato che i topi AKR, che ospitano la prima di queste modifiche, (dati non mostrati) e i topi BALB / c (8), che ospitano la seconda mutazione, hanno caratteristiche simili ai topi C57BL / 6, senza guarigione spontanea. Questo ci ha portato a studiare il coinvolgimento della risposta immunitaria mediata dagli anticorpi nel processo di guarigione spontanea. Le Ig specifiche prodotte localmente e in grado di riconoscere M. ulcerans i componenti, incluso il miocolattone in particolare, possono contribuire al controllo dell'infezione osservata durante la guarigione spontanea. Abbiamo studiato questa possibilità, valutando la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti. Abbiamo taggato una sottoclasse specifica di Ig, IgG2a, che è nota per diffondersi facilmente nella pelle (23). È stato riportato che questa sottoclasse è altamente efficace nella neutralizzazione delle esotossine batteriche, come la tossina difterica, l'enterotossina B e Bacillus anthracisTossina associata34), è stato prodotto solo nel modello di guarigione spontanea e sembra essere la firma di questo modello in termini di riconoscimento del miocolattone. Abbiamo anche scoperto che le IgG riconoscono M. ulcerans i componenti che sono stati isolati dalla pelle dei topi FVB / N sono stati in grado di neutralizzare l'attività tossica del micolattone. Nessun altro anticorpo neutralizzante il miocolattone è stato identificato in nessun altro modello murino.

La neutralizzazione delle tossine batteriche è una parte importante della risposta immunitaria umorale alle infezioni batteriche (34). I nostri risultati suggeriscono quindi che la neutralizzazione del miocolattone può essere la chiave del processo di guarigione spontanea dell'ulcera di Buruli. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'ambiente tissutale nei topi FVB / N durante la guarigione spontanea ha indotto un passaggio alla riduzione della produzione di micolattone da M. ulcerans, nonostante cariche batteriche simili. Questo interruttore potrebbe probabilmente essere all'origine della capacità degli anticorpi cutanei di neutralizzare il rimanente micolattone, portando al controllo della risposta infiammatoria acuta e al miglioramento della riparazione dei tessuti, come abbiamo precedentemente osservato (8). Infine, il fenomeno della neutralizzazione può bloccare l'attività del miocolattone in vari modi: Probabilmente sarebbe più difficile per il micolattone collegato a un anticorpo accedere o inibire bersagli intracellulari noti, come il translocon Sec61, (i) se il complesso anticorpo-micolattone non può attraversare le membrane o (ii) se l'anticorpo ostacola il legame del micolattone. È quindi ragionevole presumere che (iii) gli anticorpi neutralizzanti possano aiutare ad eliminare la tossina indirizzandoli alle cellule fagocitiche.

L'esistenza di anticorpi anti-micolattone apre nuove entusiasmanti prospettive di innovazioni nella diagnosi, nel trattamento e nello sviluppo di vaccini in risposta alla sfida scientifica lanciata dall'Organizzazione mondiale della sanità. Al momento non esiste un semplice strumento diagnostico adatto all'uso nelle aree rurali dei paesi in via di sviluppo. Questa situazione è particolarmente deplorevole, poiché le prime fasi dell'ulcera di Buruli possono essere trattate localmente, mentre il trattamento delle fasi successive richiede un ampio intervento chirurgico in ospedali più grandi, con periodi di ricovero più lunghi, a spese molto maggiori. Lo sviluppo di un nuovo strumento diagnostico, come un test basato sulla produzione di anticorpi monoclonali, potrebbe essere più appropriato per queste regioni endemiche. Inoltre, estrapolando dall'uso di anticorpi neutralizzanti per ampliare lo spettro di trattamento per veleni tossici, gli anticorpi neutralizzanti il ​​miocolattone potrebbero anche essere potenzialmente utili nelle strategie per il trattamento dell'ulcera di Buruli.

MATERIALI E METODI

Dichiarazione etica per esperimenti su animali e uso di tessuti umani

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti conformemente alle linee guida nazionali (articoli da R214-87 a R214-90 del “codice rurale” francese) e linee guida europee (direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 su la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della regione della Loira, con il protocollo n. APAFIS8904. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni nella casa degli animali dell'Ospedale universitario di Angers, in Francia (accordo A 49 007 002). L'uso di campioni di biopsia di pazienti a scopo di ricerca è stato approvato dal comitato di ricerca del governo del Benin (Ministero della Salute, Repubblica del Benin, accordo numero 2893).

M. ulcerans sforzo e inoculazione

M. ulcerans il ceppo 01G897 è stato originariamente isolato da pazienti della Guyana francese dal team di batteriologia dell'Angers Hospital (35) e conservato nel nostro laboratorio da questo momento. È stata preparata una sospensione batterica, come precedentemente descritto (8, 22) e la sua concentrazione è stata regolata su 2 × 105 bacilli acido-resistenti / ml per un'inoculazione di 1 × 104 bacilli in 50 μl nelle code di topi consanguinei C57BL / 6 e FVB / N di 6 settimane (topi Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) e BALB / c (Charles River Laboratories, Saint-Germain-Nuelles, Francia ).

Mycolactone

Il malese M. ulcerans Il ceppo 1615 era originariamente isolato dalla biopsia della pelle umana dalla Malesia (36) e somministrato da P. Piccolo laboratorio nel 2005. Il ceppo è stato coltivato su terreno solido 7H10 integrato con OADC al 10% (acido oleico, destrosio, catalasi; Difco, Becton-Dickinson) a 30 ° C per 45 giorni. Il micolattone A / B è stato quindi purificato da batteri interi, come precedentemente descritto (37). Il micolattone è stato diluito ad una concentrazione di 3 mg / ml in etanolo assoluto e conservato al buio in provette di vetro ambrato a -20 ° C.

Preparazione del tessuto del topo e campionamento del siero

I campioni di pelle di topi infetti con lesioni visibili (con arrossamento, edema, ulcera, necrosi o guarigione) sono stati eliminati (abbiamo rimosso 1 cm di tessuto cutaneo intorno alla lesione) e frantumati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con EDTA cOmplete -free cocktail (Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN). Le sospensioni risultanti sono state centrifugate a 3500g per 10 minuti a 4 ° C. I surnatanti sono stati conservati a -80 ° C. I campioni di sangue sono stati raccolti mediante puntura retro-orbitale in ogni fase clinica dell'infezione prima dell'escissione della coda. Il sangue è stato centrifugato a 1500g per 10 minuti per isolare il siero, che è stato recuperato e conservato a -80 ° C.

Preparazione di tessuti per biopsia umana

I campioni di biopsia cutanea sono stati forniti dal Centre de Diagnostic et de Traitement de la Lèpre et de l'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin). I campioni di biopsia sono stati frantumati in PBS integrato con inibitori della proteasi (cocktail senza EDTA completo, Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN), come descritto per i tessuti di topo. The resulting suspensions were centrifuged at 3500g for 10 min at 4°C. The resulting supernatants were stored at −80°C.

Quantitative PCR analysis

Tail skins from infected mice were excised and immediately placed into RNAlater (QIAGEN) and stored at −20°C. Skin tissues were crushed and homogenized with a TissueRuptor (QIAGEN), and total RNA was then purified with the RNeasy fibrous tissue midi kit (QIAGEN). The first-strand complementary DNA was synthesized from 750 ng of RNA with the M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative PCR was performed to quantify the levels of IgM, IgA, and IgG mRNA. Specific gene expression was calculated by the relative expression method (using actin as the calibrator). The sequences of the primers and probes used are provided in table S1.

Quantification of proteins and Igs

Total protein levels were determined with a colorimetric assay (Protein Assay Dye Reagent), according to the manufacturer’s instructions, with Dye Reagent Concentrate Refill (5000006, Bio-Rad) and a standard curve (bovine gamma globulin, kit 1, 50000001, Bio-Rad). Mouse tissue samples were normalized to identical protein concentrations before testing. IgA, IgM, and IgG were quantified in crushed tissue samples and mouse sera by ELISA kit from eBioscience, according to the manufacturer’s recommendations (Mouse IgA Ready-SET-Go, 88-50450; Mouse IgM Ready-SET-Go, 88-50470; Mouse IgG Ready-SET-Go, 88-50400).

Ig purification

Tail skins from infected mice were excised and crushed with metallic beads and a TissueRuptor (QIAGEN) in an equal volume of PBS supplemented with proteases inhibitor (cOmplete EDTA-free cocktail, Roche) and protein A/G IgG Binding Buffer (Thermo Fisher Scientific). The resulting suspensions were centrifuged at 8000g for 45 min at 4°C. Ig were then purified with a NAb protein A/G spin column (Thermo Fisher Scientific), followed by a NAb protein L spin column (Thermo Fisher Scientific), according to the manufacturer’s instructions.

Detection of antibodies directed against M. ulcerans lysate by ELISA

M. ulcerans strain 01G897 lysate was prepared as previously described (8). M. ulcerans lysate (0.5 μg), diluted in 100 μl of sodium bicarbonate buffer (50 mM (pH 9.6)), was immobilized in 96-well ELISA plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by overnight incubation at 4°C. The coated plates were washed four times with 0.05% Tween 20 in PBS and were then saturated by incubation with 5% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. The plates were washed a further four times and were then incubated with crushed tissue samples with normalized protein contents in 1% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. After four washes, antibodies directed against M. ulcerans lysate were detected with horseradish peroxidase (HRP)–conjugated secondary antibodies diluted 1:500 in 1% skimmed milk powder in PBS. The plates were incubated with the secondary antibodies (table S1) for 1 hour at room temperature and were then washed four times. The KPL SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate was used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at λ = 450 nm (with a reference at λ = 570 nm) (Multiskan Ascent, Thermo Fisher Scientific); results are expressed in optical density units.

Detection of mycolactone-binding antibodies

ELISA was performed to detect antibodies directed against mycolactone present in human tissues, mouse cutaneous tissues, and mouse sera. Mycolactone A/B (3 ng) in absolute ethanol was immobilized in 96-well plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by evaporating off the ethanol for approximately 2 hours in the dark; coated plates were stored at −20°C in the dark for several weeks. They were incubated overnight at 4°C with 5% skimmed milk powder in PBS. The protein concentrations of mouse tissue samples were normalized, mouse serum samples were diluted 10-fold, and human samples were diluted twofold. The plates were washed three times in 0.05% Tween 20 in PBS and were then incubated with diluted samples for 2 hours at room temperature. The plates were washed four times and incubated with HRP-conjugated secondary antibodies (goat anti-mouse IgG1, goat anti-mouse IgG2a, goat anti-mouse IgG2b, goat anti-mouse IgG3, and goat anti-mouse IgG/IgA/IgM (H + L)) (diluted 1:1000 in 1% skimmed milk in PBS for 2 hours at room temperature) (table S1). Bound antibodies were revealed using the SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL) used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm and was expressed in optical density units.

Neutralizing activity assay

CD4+ T cells were isolated from the spleens of C57BL/6 mice by magnetic sorting (MACS technology kit 130-104-454), according to the manufacturer’s instructions (Miltenyi Biotec). The purity of CD4+ T cell preparations was determined by flow cytometry, with phycoerythrin-conjugated anti-CD4 monoclonal antibody (eBioscience) and fluorescein isothiocyanate–conjugated anti-CD3ε monoclonal antibody (eBioscience). CD4+ T cells (200,000 cells per well; 100 μl per well) were used to seed 96-well plates. Purified IgG from infected tissue of five mice was diluted in RPMI 1640 (Lonza) supplemented with 10% fetal calf serum (Eurobio), 2 mM glutamine, streptomycin (10 U/ml), and penicillin (100 U/ml) (Lonza). Under some conditions, these were mixed with mycolactone A/B (8 ng/ml) in a 10:1 ratio in a tube and incubated at 37°C with continuous stirring for 45 min. Fetal calf serum was added to the preparation at a final concentration of 10%, followed by phorbol 12-myristate 13-acetate (10 ng/ml) and 1 nM ionomycin. This preparation (100 μl per well) was then added to CD4+ T cells. Cells were incubated for 6 hours at 37°C under an atmosphere containing 5% CO2, and supernatants were collected and stored at −20°C. IL-2 and IFN-γ were quantified by ELISA (eBioscience), according to the manufacturer’s instructions (mouse IL-2 Ready-SET-Go, 88-7024; mouse IFN-γ Ready-SET-Go, 88-7314).

Immune cell isolation and flow cytometry analysis

Tail skin was excised from three mice. Tissues were digested with the Multi Tissue Dissociation kit 1 from Miltenyi Biotec (reference 130-110-201), according to the manufacturer’s instructions. A four-color staining method was used to identify B cell subsets: CD45+, CD19+, B220+, and CD138+ cells were labeled with APC (allophycocyanin) cyanidine7 anti-CD45 (BD Biosciences), phycoerythrin anti-CD19 (BD Biosciences), (phycoerythrin-cyanidine7) anti-CD45R/B220 (BD Biosciences), and BB515 anti-CD138 (BD Biosciences) antibodies; dead cells were excluded from the analysis by staining with 7AAD (7-amino actinomycin D) (Miltenyi Biotec). Flow cytometry analysis was performed on a MACSQuant analyzer. Results were analyzed with FlowLogic software.

Immunohistology

Tails from infected mice were excised and immediately fixed by incubation in 4% paraformaldehyde for 24 hours. Tissues were then embedded in paraffin and cut into 5-mm-thick sections. Hematoxylin phloxine saffron staining was performed according to the manufacturer’s protocol. Immunohistochemical staining was performed with an anti-CD138 polyclonal antibody (Thermo Fisher Scientific ref. no. 36-2900) diluted 1:250 according to the manufacturer’s protocol.

Statistical analysis

The data, presented as means and SE, were analyzed with GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Soſtware, San Diego, CA, USA). Different pathological stages in each mouse strain were compared in Kruskal-Wallis tests with Dunn’s multiple comparison test. FVB/N and C57BL/6 (as well as BALB/c for the ulcerative stage) mice were compared, at each clinical stage, with Mann-Whitney U tests. Patients with buruli ulcer and controls were analyzed in Mann-Whitney U tests. A Student’s t test was used to compare flow cytometry data.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/9/eaax7781/DC1

Supplementary Materials and Methods

Table S1. HRP-conjugated secondary antibodies used in this study.

Table S2. Primer sequences used in this study.

Fig. S1. Macroscopic appearance of lesions in FVB/N and C57BL/6 mice infected with M. ulcerans.

Fig. S2. Ig gene expression in the cutaneous tissues of mice during the course of M. ulcerans infection.

Fig. S3. Detection of cutaneous IgG binding to M. ulcerans lysate by quantitative ELISA.

Fig. S4. Cutaneous IgG2a and IgG2b binding mycolactone from C57BL/6, FVB/N, and BALB/c mice at the ulcerative stage.

Fig. S5. Quantification of local B1-like subset of B cells in the skin during M. ulcerans infection.

Fig. S6. Markers of murine B cell subsets used for flow cytometry analysis.

References (38, 39)

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is not for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank all members of the SCAHU and PACEM platforms and Lore Dubesset for technical assistance. Funding: This work was supported by INSERM, Atip Avenir program, Fondation Raoul Follereau–France, Agence Nationale de la Recherche (ANR) BU_SPONT_HEAL project (InfectEra project) and MYCOPARADOX ANR project, Angers University (REPAIR project), Société Française de Dermatologie, and the Pays de la Loire region (STARTER project). J.M., L.A., and A.A. acknowledge support from the Laboratoire d’Excellence Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases (grant no. ANR-10-LABX-62-IBEID) and the ANR under the “Investments for the Future” program (grant no. ANR-10-IAHU-01). A.A. acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale (grant no. DMI20091117308). Author contributions: M.F., L.A., A.A., and E.M. conceived and designed the experiments. M.F., A.P., J.M., M.R.-S., A.D., L.E., J.-P.S.-A., A.C., and E.M. performed the experiments. M.F., A.P., J.M., F.K., M.R.-S., Y.D., P.J., J.-P.S.-A., A.C., F.A., L.A., A.A., and E.M. performed data analysis. M.F., J.M., F.K., M.R.-S., F.A., Y.D., P.J., L.A., A.A., and E.M. wrote the paper. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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Astratto

L'ulcera di Buruli, una malattia infettiva tropicale trascurata, è causata da Mycobacterium ulcerans. Senza trattamento, le sue lesioni possono progredire fino a ulcere cutanee croniche, ma nel 5% dei casi si osserva una guarigione spontanea, il che suggerisce la possibile istituzione di una strategia ospite per contrastare gli effetti di M. ulcerans. Riveliamo qui una firma umorale locale specifica della pelle del processo di guarigione spontanea, associata a un aumento delle cellule produttrici di anticorpi e al riconoscimento specifico del miocolattone da parte della sottoclasse di immunoglobuline IgG2a di topo. Dimostriamo la produzione di anticorpi specifici per la pelle che neutralizzano l'attività immunomodulatoria della tossina del micolattone e confermiamo il ruolo dei macchinari dell'ospite umano nell'innescare risposte immunitarie locali efficaci mediante il rilevamento di anticorpi anti-micolattone nei pazienti con ulcera di Buruli. Le nostre scoperte aprono la strada a sostanziali progressi sia nella diagnosi che nel trattamento dell'ulcera di Buruli in conformità con le sfide più recenti emesse dall'Organizzazione mondiale della sanità.

INTRODUZIONE

Ulcera di Buruli, una malattia tropicale trascurata causata da Mycobacterium ulcerans, è la terza malattia micobatterica più comune al mondo dopo la tubercolosi e la lebbra (1). Questa malattia infettiva cronica è caratterizzata dalla distruzione del tessuto cutaneo, che porta allo sviluppo di grandi lesioni ulcerative. Questa distruzione dei tessuti è causata da una tossina lipidica unica chiamata mycolactone, prodotta da M. ulcerans. Il micolattone è citotossico ad alte dosi, ma, a dosi più basse, modula il dolore e le risposte immunitarie, facilitando la colonizzazione dell'ospite (26). Nonostante questa secrezione di tossina, gli approcci sperimentali, supportati da osservazioni nei pazienti umani, hanno rivelato che la modulazione della risposta immunitaria da parte del micolattone è locale e regionale piuttosto che sistemica (7, 8). Inoltre, la risposta umorale sistemica a M. ulcerans l'infezione è debole (8), e M. ulcerans è scarsamente riconosciuto dagli anticorpi circolanti (9). Le analisi istologiche dei tessuti dei pazienti hanno dimostrato che le lesioni dell'ulcera di Buruli sono circondate da una massiccia infiltrazione infiammatoria dei leucociti (10). Questa infiltrazione locale è stata caratterizzata nei topi e ha dimostrato di essere costituita principalmente da fagociti (principalmente macrofagi e neutrofili) e linfociti (8). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la risposta immunitaria non può controllare lo sviluppo della lesione, nonostante il reclutamento di diversi attori principali del sistema immunitario. Questo fallimento dell'immunità dell'ospite è una conseguenza della strategia utilizzata da M. ulcerans per sfuggire al sistema immunitario.

I precedenti studi sopra descritti sono stati eseguiti durante le fasi preulcerative e ulcerative. Nessuno studio ha mai preso in considerazione questi processi immunitari durante la fase di guarigione spontanea. L'ulcera di Buruli può essere trattata con antibiotici nelle prime fasi. Tuttavia, nonostante il significativo miglioramento dei trattamenti, circa il 10-15% dei pazienti con ulcera di Buruli diventa invalido permanente secondo l'Organizzazione mondiale della sanità (1114). Inoltre, le lesioni non trattate possono diffondersi agli arti interi e progredire verso ulcere cutanee croniche (11). Tuttavia, in assenza di cure mediche, la guarigione spontanea si verifica nel 5% dei casi, come recentemente riportato in Africa e confermato dalla guarigione spontanea di pazienti australiani non trattati con M. ulcerans infezioni (15, 16), suggerendo la possibile istituzione di una strategia per contrastare gli effetti di M. ulcerans nell'host. Questa osservazione rivela un ruolo dell'ospite nel controllo dello sviluppo della lesione. Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi attorno ai siti di M. ulcerans infezione, suggerendo una risposta adattativa locale specifica (10, 17). Le cellule B producono immunoglobulina (Ig) e costituiscono il braccio umorale del sistema immunitario. Questi linfociti hanno ruoli sia proinfiammatori che soppressivi nella fisiopatologia dei disturbi infiammatori della pelle (18). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule B associate alla pelle sono diverse dalle cellule linfonodali B (19). Questa specifica risposta umorale locale può migliorare la difesa e l'immunità locali nel contesto delle malattie infiammatorie croniche della pelle (20). Tuttavia, la risposta umorale locale mediata da anticorpi, per quanto ne sappiamo, non è mai stata studiata nel corso di M. ulcerans infezione, compresa la fase di guarigione spontanea. Utilizzando il nostro modello di topo originale che riproduce le caratteristiche chiave della malattia umana (inclusa la guarigione spontanea dopo la fase ulcerosa, come precedentemente descritto da Marion et al. (8)), abbiamo studiato il ruolo potenziale degli anticorpi locali naturali, riconoscendo il micolattone prodotto da M. ulcerans. I nostri risultati confermano la presenza di questi anticorpi nell'uomo.

RISULTATI

Produzione di Igs cutanee durante M. ulcerans infezione

Abbiamo studiato la risposta umorale locale durante M. ulcerans infezione, incluso il processo di guarigione spontanea, valutando l'espressione del gene Ig attraverso analisi dei livelli di mRNA nei campioni di tessuto cutaneo. Il modello del mouse FVB / N (che mostra la guarigione spontanea) è stato confrontato con il mouse C57BL / 6 (che non mostra tale guarigione). I livelli relativi di mRNA per IgM, IgA e IgG sono rimasti stabili in entrambi i modelli durante le prime fasi dell'infezione (fig. S2). Tuttavia, i livelli di mRNA per tutti e tre gli isotipi Ig sono aumentati significativamente nei topi FVB / N nella fase ulcerosa (giorno 45), raggiungendo un picco durante la fase di guarigione (giorno 75). I livelli di mRNA che codificano questi tre isotipi erano significativamente più alti (P <0,05 per IgM e IgG e P <0,01 per IgA, Mann-Whitney U test) nei topi FVB / N nella fase di guarigione rispetto ai topi C57BL / 6 nella fase necrotica. Abbiamo caratterizzato i profili di Ig dei tessuti infetti stimando le concentrazioni di IgM, IgA e IgG mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Coerentemente con i dati di mRNA, i livelli totali di Ig sono aumentati nei tessuti cutanei dei topi FVB / N durante M. ulcerans infezione (Fig. 1, da A a C). Tuttavia, nonostante l'assenza di chiari cambiamenti nei livelli locali di mRNA Ig nei topi C57BL / 6, abbiamo osservato un aumento della concentrazione di Ig nei tessuti durante M. ulcerans infezione in questi topi (Fig. 1, da A a C). Sono state rilevate differenze nelle concentrazioni di IgM e IgG tra i due ceppi di topo. I livelli di IgG nei topi FVB / N erano due volte quelli nei topi C57BL / 6 (P <0,01, Mann-Whitney U test) sia durante il rossore che nelle fasi ulcerative ed erano 1,6 volte più alti (P <0,05, Mann-Whitney U test) durante il processo di guarigione rispetto allo stadio necrotico, mentre i livelli di IgM erano più alti nei topi C57BL / 6 dallo stadio ulcerativo (2,7 volte più alti; P <0,01, Mann-Whitney U test) fino alla necrosi (7,8 volte superiore; P <0,01, Mann-Whitney U test). Queste differenze, evidenti fin dalle prime fasi, potrebbero riflettere alti livelli di Ig in circolazione. Tuttavia, non sono state rilevate differenze significative nei livelli di queste Ig tra i campioni di siero dei due ceppi di topo durante le prime fasi dell'infezione (Fig. 1, da D a F). Nonostante l'assenza di cambiamenti sistemici rilevabili, le Ig possono accumularsi nei tessuti durante l'infiammazione (come recentemente descritto (21)), potenzialmente tenendo conto delle differenze osservate tra RNA e livelli proteici. Infine, il corso di M. ulcerans l'infezione è associata a una risposta umorale locale, con i seguenti profili di Ig: IgM> IgG> IgA nei topi C57BL / 6 e IgG> IgM> IgA nei topi FVB / N. Sembra quindi che ci sia una specifica firma di immunità umorale del processo di guarigione, in cui prevale l'IgG.

Fig. 1 Quantificazione di IgM, IgA e IgG nei tessuti cutanei nel sito di inoculazione e nel siero.

Cinetica della produzione di Ig, dopo inoculazione con vitale M. ulcerans bacilli, valutata da ELISA quantitativa. (UN per C) Campioni di tessuto cutaneo (n = 5 per ciascun ceppo), per i quali sono state normalizzate le concentrazioni proteiche e (D per F) campioni di siero (n = 5 per ogni ceppo). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 e **P <0,01 (confronto della titolazione di Ig nei topi FVB / N e C57BL / 6 in ogni stadio della malattia; Mann Whitney U test).

Riconoscimento di M. ulcerans lisato da anticorpi IgG locali

Come tutti i micobatteri, M. ulcerans ha un vasto repertorio antigenico (lipoarabinomannano (LAM), proteine ​​di membrana superficiale e vescicole extracellulari) che può innescare la produzione di anticorpi specifici da parte dell'ospite (22). Abbiamo quindi studiato la specificità della produzione locale di Ig, valutandone la capacità di riconoscere M. ulcerans lisato a cellule intere in ELISA. Le IgG erano l'unico isotipo di Ig in grado di legarsi M. ulcerans componenti di lisato (fig. S3A). Questo riconoscimento è diventato più forte con successive fasi di infezione nei topi FVB / N e C57BL / 6 ed è stato massimo durante le fasi di guarigione e necrosi (P <0,01, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi valutato la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti (fig. S3B). Alti livelli di IgG1 che si legano a M. ulcerans componenti di lisato sono stati osservati in entrambi i modelli di topo. Il legame con IgG1 è stato rilevato all'inizio nella fase di arrossamento nei topi FVB / N e successivamente nella fase di edema nei topi C57BL / 6 (P <0,01 per la differenza tra i due modelli di topo nella fase di arrossamento, Mann-Whitney U test). Al contrario, IgG3 ha riconosciuto M. ulcerans componenti di lisato molto debolmente ma allo stesso modo nei due ceppi di topo. La principale differenza tra i topi FVB / N e C57BL / 6 riguardava le sottoclassi di IgG2a / b. IgG2a riconosciuta M. ulcerans componenti in tutte le fasi dell'infezione (dallo stadio ulcerativo a quello di guarigione) nei topi FVB / N ma sembra essere assente nei topi C57BL / 6. L'ultima sottoclasse, IgG2b, riconosciuta M. ulcerans lisare significativamente più fortemente nei topi C57BL / 6, dallo stadio ulcerativo a quello necrotico, rispetto ai topi FVB / N in stadi equivalenti (P <0,05, Mann-Whitney U test). In conclusione, le risposte umorali locali differivano tra i topi FVB / N (modello di guarigione) e i topi C57BL / 6 (nessuna guarigione spontanea). Questa differenza riguardava principalmente due sottoclassi di Ig specifiche: (i) IgG2a, prodotta solo nel modello di guarigione, e (ii) IgG2b, che riconosceva M. ulcerans componenti fortemente solo nel modello C57BL / 6. Questi risultati suggeriscono un ruolo potenziale per IgG2a nel controllo M. ulcerans infezione nel modello di guarigione FVB / N.

Riconoscimento del mycolactone da parte di anticorpi cutanei locali

La capacità dei topi FVB / N di guarire spontaneamente dopo M. ulcerans l'infezione potrebbe essere spiegata, in parte, dalla produzione di anticorpi che riconoscono la tossina batterica, il micolattone. Abbiamo studiato la specificità di questi anticorpi locali per il micolattone nei tessuti della pelle eseguendo ELISA (Fig. 2). Le IgM prodotte localmente in entrambi i ceppi di topo non sono state in grado di riconoscere il miocolattone. IgA, che è noto per proteggere i tessuti (cioè le cellule epiteliali) dalle tossine batteriche (23), legato il micolattone a bassi livelli solo durante lo stadio ulcerativo nei topi FVB / N. Come osservato per M. ulcerans lisato, IgG ha riconosciuto il micolattone ad alti livelli in entrambi i modelli di topo durante l'infezione. Livelli significativamente più alti di riconoscimento del miocolattone da parte delle IgG sono stati osservati nei topi C57BL / 6 nella fase necrotica rispetto ai topi FVB / N nella fase di guarigione (P <0,05, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi analizzato i sottotipi di IgG in ogni fase dell'infezione. Dallo stadio dell'edema allo stadio ulcerativo, IgG1 sembrava essere una sottoclasse in grado di legare il micolattone a livelli più alti nei topi FVB / N rispetto a C57BL / 6, mentre IgG2b sembrava riconoscere il micolattone a livelli più alti e dalle fasi precedenti esclusivamente in C57BL / 6 topi (P <0,01 per IgG1 in FVB / N rispetto a topi C57BL / 6 e P <0,01 per IgG2b nello stadio ulcerativo nei topi C57BL / 6 rispetto ai topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Durante l'ultima fase dell'infezione (necrosi contro guarigione), sono state fatte le stesse osservazioniP <0,05 contro topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Il profilo legante il miocolattone di IgG3 era simile in entrambi i modelli di topo. Infine, per quanto riguarda il riconoscimento di M. ulcerans lisato, la principale differenza riguardava la sottoclasse di IgG2a, che sembrava essere specifica per topi FVB / N. Questa sottoclasse ha legato la tossina dallo stadio ulcerativo allo stadio di guarigione. La mancanza del rilevamento di IgG2a nei test eseguiti su topi C57BL / 6 può essere spiegata da una mutazione del gene IgG2a in questi topi (24). Abbiamo eseguito saggi in un altro modello di topo che non mostravano guarigione spontanea (topi BALB / c), in cui il gene IgG2a è presente e funzionale, per escludere la possibilità di esclusione di un fenotipo specifico del ceppo e confermare l'importanza di questa proteina nella guarigione processo e nel legame con il miocolattone. L'anticorpo IgG2a prodotto dai topi BALB / c non ha riconosciuto il miocolattone (vedere fig. S4). Insieme, questi risultati rivelano l'esistenza di diversi profili di riconoscimento del miocolattone tra i modelli murini di guarigione e infezione necrotica. IgG2b sembra essere una sottoclasse specifica in grado di riconoscere M. ulcerans tossina nei topi C57BL / 6, ma non è in grado di controllare efficacemente l'infezione. Al contrario, IgG2a era specifica per il modello di guarigione spontanea (topi FVB / N) e può essere coinvolta nel controllo di M. ulcerans infezione associata a guarigione spontanea.

Fig.2 Rilevazione del legame IgG cutaneo al micolattone mediante ELISA quantitativo.

Ogni pozzetto di una piastra ELISA MaxiSorp è stato rivestito con 3 ng di micolattone e le concentrazioni di Ig dei campioni di tessuto cutaneo sono state normalizzate prima della loro aggiunta alla piastra. Gli anticorpi che si legano al micolattone sulla piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP). (UN) Rilevazione di IgG, IgM e IgA e (B) IgG1, IgG2a, IgG3 e IgG2b che riconoscono il micolattone nel tessuto cutaneo da topi FVB / N e C57BL / 6 in varie fasi dell'infezione (sano, arrossamento, ulcera, necrosi o guarigione) (n = Da 3 a 5 topi per ceppo di topo). Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,1. Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,5, **P <0,01 (Mann-Whitney U test).

Neutralizzazione del micolattone da parte degli anticorpi presenti nella pelle

Abbiamo studiato la capacità di questi anticorpi di riconoscere e neutralizzare il miocolattone, valutando la loro capacità di neutralizzare le proprietà immunomodulanti della tossina. È noto che il micolattone inibisce la produzione di citochine infiammatorie legandosi al translocon Sec61 (25). Abbiamo basato il nostro test di neutralizzazione su questo effetto e quindi incubato i linfociti T stimolati (modello cellulare che produce citochine qui usato come strumento di lettura) con solo il miocolattone o con il miocolattone precedentemente incubato con IgG purificato dalla pelle di topi FVB / N e C57BL / 6 e quindi confrontato la produzione di interleuchina-2 (IL-2) e interferone-γ (IFN-γ) dopo 6 ore. Il contatto tra le cellule T e la tossina ha notevolmente ridotto i livelli di produzione di IL-2 e IFN-γ rispetto al controllo positivo (solo cellule T stimolate) in entrambi i modelli di topo (Fig. 3). Al contrario, la produzione di queste due citochine era simile al controllo positivo per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate dalla pelle di topi FVB / N ma non per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate da Topi C57BL / 6. Pertanto, le IgG prodotte nella pelle dei topi FVB / N durante la fase di guarigione possono neutralizzare la M. ulcerans tossina. Questa neutralizzazione può essere coinvolta nel processo di guarigione.

Fig. 3 Neutralizzazione del micolattone da Ig cutanea da topi FVB / N infetti da M. ulcerans.

CD4+ i linfociti sono stati stimolati con phorbol 12-miristate 13-acetate / ionomicina. Il micolattone è stato usato ad una concentrazione di 4 ng / ml. Igs purificate dalla pelle di (UN) Topi FVB / N o (B) C57BL / 6 topi infetti da M. ulcerans sono stati usati con un rapporto di 10 molecole di Ig per molecola di micolattone. Sinistra: quantificazione IL-2; a destra: quantificazione IFN-γ. I dati mostrati corrispondono a un esperimento eseguito in triplicato (significa ± SD). *P <0,05 e **P <0,01 (Student's t test).

Emersione locale di cellule produttrici di anticorpi durante M. ulcerans infezione

Sulla base dell'ipotesi di una risposta immunitaria umorale locale stabilita durante la guarigione spontanea, abbiamo valutato la rilevanza fisiologica di questo processo studiando la presenza di cellule B che producono anticorpi in vivo. Abbiamo usato la colorazione a quattro colori per analizzare le popolazioni di cellule B da topi FVB / N e identificato tre popolazioni: (P1) cellule con un CD45+, CD19+, B220+ fenotipo corrispondente alle cellule B; (P2) CD45+, CD19+, B220int cellule corrispondenti ai plasmablasti; e (P3) CD45+, CD19, B220int, CD138+ cellule, corrispondenti ai marcatori murini dell'ultimo stadio della maturazione delle cellule B, cellule del plasma (26). La frequenza delle cellule linfoidi (CD45+) aumentato di 37 volte rispetto al controllo della pelle durante il processo di guarigione spontanea (Fig. 4A). Di conseguenza, il numero totale di cellule B è aumentato, ma le proporzioni dei vari sottoinsiemi sono rimaste costanti. L'unica modifica osservata è stata un aumento della proporzione di cellule linfoidi totali rappresentate dal sottogruppo di plasmacellule, che è aumentato dallo 0,04 allo 0,63% (corrispondente ad un aumento di 43-19,732 plasmacellule / g di pelle) durante i primi passi del processo di guarigione spontanea (giorno 55), mentre tale aumento non è stato osservato nella pelle non infetta (controllo), come mostrato in Fig. 4C. La presenza di questo sottotipo di cellula B specifica è stata confermata dall'analisi istologica (Fig. 4B). La proporzione di cellule B simili a B1 (CD45+, CD19+, B220int, CD43+), un sottoinsieme specifico che ha dimostrato di produrre anticorpi specificamente nella pelle (27), aumentato durante la guarigione spontanea, raggiungendo lo 0,07% delle cellule linfoidi totali (vedi fig. S5). La proporzione di queste cellule produttrici di anticorpi è diminuita quando la lesione sembra essere completamente guarita (giorno 75) ma è rimasta più alta di quella nella pelle di controllo. I nostri risultati mostrano quindi che il numero di cellule produttrici di anticorpi aumenta fortemente nella pelle durante il processo di guarigione spontanea, supportando un ruolo per la risposta umorale locale in questo fenomeno, attraverso la produzione di anticorpi anti-micolattone.

Fig. 4 Apparizione di plasmacellule (CD138+) nella pelle durante M. ulcerans infezione nel modello murino FVB / N di guarigione spontanea.

(UN) Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso a quattro colori con la colorazione specifica delle cellule linfoidi totali (CD45+), Cellule B (popolazione P1 = CD45+, CD19+, B220+), plasmablasti (popolazione P2 = CD45+, CD19+, B220int) e plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+). I risultati mostrati qui provengono da un esperimento rappresentativo eseguito in duplicato. (B) Infiltrazione infiammatoria locale (inserto) nel derma di M. ulcerans topi infetti nella fase ulcerosa, tipici di M. ulcerans infezione. ep, epidermide. Immunocolorazione mostra CD138+ plasmacellule (cellule B attivate in grado di produrre anticorpi) nel derma. (C) Analisi di citometria a flusso che mostra l'emergenza di plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+) durante le prime fasi del processo di guarigione spontanea (il controllo è la pelle non infetta). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 (Student's t test). Barre di scala, 160 μm (parte superiore B), 80 μm (parte superiore B, inserto), 100 μm (parte inferiore B) e 20 μm (parte inferiore B, inserto).

Riconoscimento del mycolactone da parte di IgG locali purificate da campioni di biopsia cutanea da pazienti con ulcera di Buruli

Oltre a questa dettagliata caratterizzazione delle Ig anti-micolattone nei topi, abbiamo anche valutato i livelli di queste IgG nei pazienti con ulcera di Buruli. Abbiamo utilizzato ELISA per rilevare gli anticorpi anti-micolattone nei campioni di pelle di pazienti (con o senza diagnosi di ulcera di Buruli) forniti dal Centro di diagnosi e trattamento della Lèpre e dell'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin ). Nel 73% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), è stata diagnosticata la forma più grave della malattia: una lesione ulcerosa (che può essere associata ad altre forme, come edema o placche). Il micolattone è stato riconosciuto dagli anticorpi locali recuperati dalle lesioni del 60% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (9 su 15) (tutti presentando un'ulcera), mentre il micolattone è stato rilevato in un solo campione di biopsia dai pazienti di controllo (non diagnosticato con Ulcera di Buruli; P <0,05, Mann-Whitney U test; Fig. 5). Da allora questo particolare paziente ha sviluppato un carcinoma a cellule squamose, una malattia che si verifica dopo alcune lesioni dell'ulcera di Buruli (27, 28). Pertanto, non possiamo escludere la possibilità che questo paziente abbia già avuto una lesione a causa M. ulcerans infezione. Infine, potrebbero esserci diverse ragioni per la mancanza di rilevazione di IgG leganti il ​​miocolattone nel 40% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (6 su 15) come il tipo di lesione, il sito di campionamento (distanza dal sito di infezione) e la durata del trattamento. Infine, forniamo qui la prima dimostrazione che l'organismo umano può generare un'efficace risposta umorale che coinvolge la produzione di anticorpi che riconoscono il miocolattone durante M. ulcerans infezione.

Fig. 5 Rilevazione di Ig cutanee che si legano al micolattone nelle lesioni dei pazienti con diagnosi di ulcera di Buruli.

I pozzetti sono stati rivestiti con mycolactone e gli anticorpi che si legano al mycolactone nella piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con HRP. Il CDTUB di Pobè (Benin) ha fornito campioni di biopsia da pazienti con ulcera di Buruli sospetta e / o confermata dalla PCR. Nei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR, sono state eseguite biopsie su lesioni attive. Pertanto, non è stato possibile identificare i pazienti che successivamente manifestano una guarigione spontanea. Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,150. **P <0,05 (Mann Whitney U test). Gruppo dell'ulcera di Buruli, n = 15; gruppo di controllo, n = 19. OD, densità ottica.

DISCUSSIONE

L'ulcera del buruli è una malattia tropicale trascurata che rimane la terza malattia micobatterica più comune al mondo. Questa malattia della pelle debilitante è causata da M. ulcerans, che produce una tossina lipidica, il micolattone, il principale fattore di virulenza del bacillo. Senza trattamento, le lesioni possono evolvere in ulcere cutanee croniche. Tuttavia, queste gravi lesioni possono guarire spontaneamente, come osservato nel 5% dei casi, suggerendo che i meccanismi per contrastare gli effetti di M. ulcerans può svilupparsi nell'host. Nonostante lo sviluppo di modelli animali, i meccanismi del processo di guarigione spontanea rimangono poco chiari. In precedenza avevamo mostrato (i) l'assenza di una firma di risposta cellulare immunitaria sistemica e (ii) un debole coinvolgimento della risposta immunitaria cellulare locale nel passaggio dall'infezione acuta a quella cronica (8). Questi risultati evidenziano le conseguenze locali della malattia, osservate con altri approcci (7, 29). Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi intorno al sito di M. ulcerans infezione (10). Sono stati osservati infiltrati di cellule B in condizioni infiammatorie croniche della pelle, tra cui la leishmaniosi cutanea e la dermatite atopica (30, 31). Il dibattito sul ruolo pro o antinfiammatorio delle cellule B della pelle continua, ma queste cellule hanno dimostrato di essere coinvolte nella risoluzione dell'infiammazione cutanea in un modello murino di infiammazione simile alla psoriasi (32). Inoltre, oltre a produrre localmente anticorpi, è stato dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo nel processo di guarigione delle ferite (33).

In questo contesto, abbiamo usato il nostro modello murino di guarigione spontanea per studiare la risposta umorale in tutte le fasi M. ulcerans infezione, compresa la guarigione spontanea. Abbiamo dimostrato la presenza di cellule B che producono anticorpi durante l'infezione e il loro aumento del numero durante l'infezione, raggiungendo un picco durante le prime fasi della guarigione spontanea (il passaggio dall'ulcerazione alla guarigione). Abbiamo rilevato Igs in grado di riconoscere la tossina lipidica di M. ulcerans, mycolactone, in tutte le fasi dell'infezione. Queste Ig sono state trovate nella pelle dei topi infetti ma non nei loro sieri. Forniamo anche la prima dimostrazione della presenza di queste Ig nei campioni di biopsia di pazienti con ulcera di Buruli. Nessun anticorpo anti-micolattone è mai stato rilevato nel siero di pazienti. Collettivamente, questi risultati evidenziano l'esistenza di una firma umorale distinta in risposta a M. ulcerans infezione, con la produzione specifica di pelle di anticorpi contro il miocolattone.

Sembra probabile che la guarigione spontanea osservata nei topi FVB / N sia innescata da fattori genetici dell'ospite. In particolare, i topi FVB / N presentano modifiche di due elementi coinvolti nella risposta immunitaria: (i) una carenza nella secrezione del componente 5 del complemento e (ii) un polimorfismo NLRP. Tuttavia, abbiamo precedentemente osservato che i topi AKR, che ospitano la prima di queste modifiche, (dati non mostrati) e i topi BALB / c (8), che ospitano la seconda mutazione, hanno caratteristiche simili ai topi C57BL / 6, senza guarigione spontanea. Questo ci ha portato a studiare il coinvolgimento della risposta immunitaria mediata dagli anticorpi nel processo di guarigione spontanea. Le Ig specifiche prodotte localmente e in grado di riconoscere M. ulcerans i componenti, incluso il miocolattone in particolare, possono contribuire al controllo dell'infezione osservata durante la guarigione spontanea. Abbiamo studiato questa possibilità, valutando la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti. Abbiamo taggato una sottoclasse specifica di Ig, IgG2a, che è nota per diffondersi facilmente nella pelle (23). È stato riportato che questa sottoclasse è altamente efficace nella neutralizzazione delle esotossine batteriche, come la tossina difterica, l'enterotossina B e Bacillus anthracisTossina associata34), è stato prodotto solo nel modello di guarigione spontanea e sembra essere la firma di questo modello in termini di riconoscimento del miocolattone. Abbiamo anche scoperto che le IgG riconoscono M. ulcerans i componenti che sono stati isolati dalla pelle dei topi FVB / N sono stati in grado di neutralizzare l'attività tossica del micolattone. Nessun altro anticorpo neutralizzante il miocolattone è stato identificato in nessun altro modello murino.

La neutralizzazione delle tossine batteriche è una parte importante della risposta immunitaria umorale alle infezioni batteriche (34). I nostri risultati suggeriscono quindi che la neutralizzazione del miocolattone può essere la chiave del processo di guarigione spontanea dell'ulcera di Buruli. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'ambiente tissutale nei topi FVB / N durante la guarigione spontanea ha indotto un passaggio alla riduzione della produzione di micolattone da M. ulcerans, nonostante cariche batteriche simili. Questo interruttore potrebbe probabilmente essere all'origine della capacità degli anticorpi cutanei di neutralizzare il rimanente micolattone, portando al controllo della risposta infiammatoria acuta e al miglioramento della riparazione dei tessuti, come abbiamo precedentemente osservato (8). Infine, il fenomeno della neutralizzazione può bloccare l'attività del miocolattone in vari modi: Probabilmente sarebbe più difficile per il micolattone collegato a un anticorpo accedere o inibire bersagli intracellulari noti, come il translocon Sec61, (i) se il complesso anticorpo-micolattone non può attraversare le membrane o (ii) se l'anticorpo ostacola il legame del micolattone. È quindi ragionevole presumere che (iii) gli anticorpi neutralizzanti possano aiutare ad eliminare la tossina indirizzandoli alle cellule fagocitiche.

L'esistenza di anticorpi anti-micolattone apre nuove entusiasmanti prospettive di innovazioni nella diagnosi, nel trattamento e nello sviluppo di vaccini in risposta alla sfida scientifica lanciata dall'Organizzazione mondiale della sanità. Al momento non esiste un semplice strumento diagnostico adatto all'uso nelle aree rurali dei paesi in via di sviluppo. Questa situazione è particolarmente deplorevole, poiché le prime fasi dell'ulcera di Buruli possono essere trattate localmente, mentre il trattamento delle fasi successive richiede un ampio intervento chirurgico in ospedali più grandi, con periodi di ricovero più lunghi, a spese molto maggiori. Lo sviluppo di un nuovo strumento diagnostico, come un test basato sulla produzione di anticorpi monoclonali, potrebbe essere più appropriato per queste regioni endemiche. Inoltre, estrapolando dall'uso di anticorpi neutralizzanti per ampliare lo spettro di trattamento per veleni tossici, gli anticorpi neutralizzanti il ​​miocolattone potrebbero anche essere potenzialmente utili nelle strategie per il trattamento dell'ulcera di Buruli.

MATERIALI E METODI

Dichiarazione etica per esperimenti su animali e uso di tessuti umani

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti conformemente alle linee guida nazionali (articoli da R214-87 a R214-90 del “codice rurale” francese) e linee guida europee (direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 su la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della regione della Loira, con il protocollo n. APAFIS8904. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni nella casa degli animali dell'Ospedale universitario di Angers, in Francia (accordo A 49 007 002). L'uso di campioni di biopsia di pazienti a scopo di ricerca è stato approvato dal comitato di ricerca del governo del Benin (Ministero della Salute, Repubblica del Benin, accordo numero 2893).

M. ulcerans sforzo e inoculazione

M. ulcerans il ceppo 01G897 è stato originariamente isolato da pazienti della Guyana francese dal team di batteriologia dell'Angers Hospital (35) e conservato nel nostro laboratorio da questo momento. È stata preparata una sospensione batterica, come precedentemente descritto (8, 22) e la sua concentrazione è stata regolata su 2 × 105 bacilli acido-resistenti / ml per un'inoculazione di 1 × 104 bacilli in 50 μl nelle code di topi consanguinei C57BL / 6 e FVB / N di 6 settimane (topi Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) e BALB / c (Charles River Laboratories, Saint-Germain-Nuelles, Francia ).

Mycolactone

Il malese M. ulcerans Il ceppo 1615 era originariamente isolato dalla biopsia della pelle umana dalla Malesia (36) e somministrato da P. Piccolo laboratorio nel 2005. Il ceppo è stato coltivato su terreno solido 7H10 integrato con OADC al 10% (acido oleico, destrosio, catalasi; Difco, Becton-Dickinson) a 30 ° C per 45 giorni. Il micolattone A / B è stato quindi purificato da batteri interi, come precedentemente descritto (37). Il micolattone è stato diluito ad una concentrazione di 3 mg / ml in etanolo assoluto e conservato al buio in provette di vetro ambrato a -20 ° C.

Preparazione del tessuto del topo e campionamento del siero

I campioni di pelle di topi infetti con lesioni visibili (con arrossamento, edema, ulcera, necrosi o guarigione) sono stati eliminati (abbiamo rimosso 1 cm di tessuto cutaneo intorno alla lesione) e frantumati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con EDTA cOmplete -free cocktail (Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN). Le sospensioni risultanti sono state centrifugate a 3500g per 10 minuti a 4 ° C. I surnatanti sono stati conservati a -80 ° C. I campioni di sangue sono stati raccolti mediante puntura retro-orbitale in ogni fase clinica dell'infezione prima dell'escissione della coda. Il sangue è stato centrifugato a 1500g per 10 minuti per isolare il siero, che è stato recuperato e conservato a -80 ° C.

Preparazione di tessuti per biopsia umana

I campioni di biopsia cutanea sono stati forniti dal Centre de Diagnostic et de Traitement de la Lèpre et de l'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin). I campioni di biopsia sono stati frantumati in PBS integrato con inibitori della proteasi (cocktail senza EDTA completo, Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN), come descritto per i tessuti di topo. Le sospensioni risultanti sono state centrifugate a 3500g per 10 minuti a 4 ° C. I supernatanti risultanti sono stati conservati a -80 ° C.

Analisi quantitativa della PCR

Le pelli di coda di topi infetti sono state asportate e immediatamente poste in RNAlater (QIAGEN) e conservate a -20 ° C. Skin tissues were crushed and homogenized with a TissueRuptor (QIAGEN), and total RNA was then purified with the RNeasy fibrous tissue midi kit (QIAGEN). The first-strand complementary DNA was synthesized from 750 ng of RNA with the M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative PCR was performed to quantify the levels of IgM, IgA, and IgG mRNA. Specific gene expression was calculated by the relative expression method (using actin as the calibrator). The sequences of the primers and probes used are provided in table S1.

Quantification of proteins and Igs

Total protein levels were determined with a colorimetric assay (Protein Assay Dye Reagent), according to the manufacturer’s instructions, with Dye Reagent Concentrate Refill (5000006, Bio-Rad) and a standard curve (bovine gamma globulin, kit 1, 50000001, Bio-Rad). Mouse tissue samples were normalized to identical protein concentrations before testing. IgA, IgM, and IgG were quantified in crushed tissue samples and mouse sera by ELISA kit from eBioscience, according to the manufacturer’s recommendations (Mouse IgA Ready-SET-Go, 88-50450; Mouse IgM Ready-SET-Go, 88-50470; Mouse IgG Ready-SET-Go, 88-50400).

Ig purification

Tail skins from infected mice were excised and crushed with metallic beads and a TissueRuptor (QIAGEN) in an equal volume of PBS supplemented with proteases inhibitor (cOmplete EDTA-free cocktail, Roche) and protein A/G IgG Binding Buffer (Thermo Fisher Scientific). The resulting suspensions were centrifuged at 8000g for 45 min at 4°C. Ig were then purified with a NAb protein A/G spin column (Thermo Fisher Scientific), followed by a NAb protein L spin column (Thermo Fisher Scientific), according to the manufacturer’s instructions.

Detection of antibodies directed against M. ulcerans lysate by ELISA

M. ulcerans strain 01G897 lysate was prepared as previously described (8). M. ulcerans lysate (0.5 μg), diluted in 100 μl of sodium bicarbonate buffer (50 mM (pH 9.6)), was immobilized in 96-well ELISA plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by overnight incubation at 4°C. The coated plates were washed four times with 0.05% Tween 20 in PBS and were then saturated by incubation with 5% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. The plates were washed a further four times and were then incubated with crushed tissue samples with normalized protein contents in 1% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. After four washes, antibodies directed against M. ulcerans lysate were detected with horseradish peroxidase (HRP)–conjugated secondary antibodies diluted 1:500 in 1% skimmed milk powder in PBS. The plates were incubated with the secondary antibodies (table S1) for 1 hour at room temperature and were then washed four times. The KPL SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate was used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at λ = 450 nm (with a reference at λ = 570 nm) (Multiskan Ascent, Thermo Fisher Scientific); results are expressed in optical density units.

Detection of mycolactone-binding antibodies

ELISA was performed to detect antibodies directed against mycolactone present in human tissues, mouse cutaneous tissues, and mouse sera. Mycolactone A/B (3 ng) in absolute ethanol was immobilized in 96-well plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by evaporating off the ethanol for approximately 2 hours in the dark; coated plates were stored at −20°C in the dark for several weeks. They were incubated overnight at 4°C with 5% skimmed milk powder in PBS. The protein concentrations of mouse tissue samples were normalized, mouse serum samples were diluted 10-fold, and human samples were diluted twofold. The plates were washed three times in 0.05% Tween 20 in PBS and were then incubated with diluted samples for 2 hours at room temperature. The plates were washed four times and incubated with HRP-conjugated secondary antibodies (goat anti-mouse IgG1, goat anti-mouse IgG2a, goat anti-mouse IgG2b, goat anti-mouse IgG3, and goat anti-mouse IgG/IgA/IgM (H + L)) (diluted 1:1000 in 1% skimmed milk in PBS for 2 hours at room temperature) (table S1). Bound antibodies were revealed using the SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL) used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm and was expressed in optical density units.

Neutralizing activity assay

CD4+ T cells were isolated from the spleens of C57BL/6 mice by magnetic sorting (MACS technology kit 130-104-454), according to the manufacturer’s instructions (Miltenyi Biotec). The purity of CD4+ T cell preparations was determined by flow cytometry, with phycoerythrin-conjugated anti-CD4 monoclonal antibody (eBioscience) and fluorescein isothiocyanate–conjugated anti-CD3ε monoclonal antibody (eBioscience). CD4+ T cells (200,000 cells per well; 100 μl per well) were used to seed 96-well plates. Purified IgG from infected tissue of five mice was diluted in RPMI 1640 (Lonza) supplemented with 10% fetal calf serum (Eurobio), 2 mM glutamine, streptomycin (10 U/ml), and penicillin (100 U/ml) (Lonza). Under some conditions, these were mixed with mycolactone A/B (8 ng/ml) in a 10:1 ratio in a tube and incubated at 37°C with continuous stirring for 45 min. Fetal calf serum was added to the preparation at a final concentration of 10%, followed by phorbol 12-myristate 13-acetate (10 ng/ml) and 1 nM ionomycin. This preparation (100 μl per well) was then added to CD4+ T cells. Cells were incubated for 6 hours at 37°C under an atmosphere containing 5% CO2, and supernatants were collected and stored at −20°C. IL-2 and IFN-γ were quantified by ELISA (eBioscience), according to the manufacturer’s instructions (mouse IL-2 Ready-SET-Go, 88-7024; mouse IFN-γ Ready-SET-Go, 88-7314).

Immune cell isolation and flow cytometry analysis

Tail skin was excised from three mice. Tissues were digested with the Multi Tissue Dissociation kit 1 from Miltenyi Biotec (reference 130-110-201), according to the manufacturer’s instructions. A four-color staining method was used to identify B cell subsets: CD45+, CD19+, B220+, and CD138+ cells were labeled with APC (allophycocyanin) cyanidine7 anti-CD45 (BD Biosciences), phycoerythrin anti-CD19 (BD Biosciences), (phycoerythrin-cyanidine7) anti-CD45R/B220 (BD Biosciences), and BB515 anti-CD138 (BD Biosciences) antibodies; dead cells were excluded from the analysis by staining with 7AAD (7-amino actinomycin D) (Miltenyi Biotec). Flow cytometry analysis was performed on a MACSQuant analyzer. Results were analyzed with FlowLogic software.

Immunohistology

Tails from infected mice were excised and immediately fixed by incubation in 4% paraformaldehyde for 24 hours. Tissues were then embedded in paraffin and cut into 5-mm-thick sections. Hematoxylin phloxine saffron staining was performed according to the manufacturer’s protocol. Immunohistochemical staining was performed with an anti-CD138 polyclonal antibody (Thermo Fisher Scientific ref. no. 36-2900) diluted 1:250 according to the manufacturer’s protocol.

Statistical analysis

The data, presented as means and SE, were analyzed with GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Soſtware, San Diego, CA, USA). Different pathological stages in each mouse strain were compared in Kruskal-Wallis tests with Dunn’s multiple comparison test. FVB/N and C57BL/6 (as well as BALB/c for the ulcerative stage) mice were compared, at each clinical stage, with Mann-Whitney U tests. Patients with buruli ulcer and controls were analyzed in Mann-Whitney U tests. A Student’s t test was used to compare flow cytometry data.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/9/eaax7781/DC1

Supplementary Materials and Methods

Table S1. HRP-conjugated secondary antibodies used in this study.

Table S2. Primer sequences used in this study.

Fig. S1. Macroscopic appearance of lesions in FVB/N and C57BL/6 mice infected with M. ulcerans.

Fig. S2. Ig gene expression in the cutaneous tissues of mice during the course of M. ulcerans infection.

Fig. S3. Detection of cutaneous IgG binding to M. ulcerans lysate by quantitative ELISA.

Fig. S4. Cutaneous IgG2a and IgG2b binding mycolactone from C57BL/6, FVB/N, and BALB/c mice at the ulcerative stage.

Fig. S5. Quantification of local B1-like subset of B cells in the skin during M. ulcerans infection.

Fig. S6. Markers of murine B cell subsets used for flow cytometry analysis.

References (38, 39)

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is not for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank all members of the SCAHU and PACEM platforms and Lore Dubesset for technical assistance. Funding: This work was supported by INSERM, Atip Avenir program, Fondation Raoul Follereau–France, Agence Nationale de la Recherche (ANR) BU_SPONT_HEAL project (InfectEra project) and MYCOPARADOX ANR project, Angers University (REPAIR project), Société Française de Dermatologie, and the Pays de la Loire region (STARTER project). J.M., L.A., and A.A. acknowledge support from the Laboratoire d’Excellence Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases (grant no. ANR-10-LABX-62-IBEID) and the ANR under the “Investments for the Future” program (grant no. ANR-10-IAHU-01). A.A. acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale (grant no. DMI20091117308). Author contributions: M.F., L.A., A.A., and E.M. conceived and designed the experiments. M.F., A.P., J.M., M.R.-S., A.D., L.E., J.-P.S.-A., A.C., and E.M. performed the experiments. M.F., A.P., J.M., F.K., M.R.-S., Y.D., P.J., J.-P.S.-A., A.C., F.A., L.A., A.A., and E.M. performed data analysis. M.F., J.M., F.K., M.R.-S., F.A., Y.D., P.J., L.A., A.A., and E.M. wrote the paper. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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Mercato globale degli inibitori alfa TNF per classe di farmaci (Adalimumab, Certolizumab Pegol, Etanercept, Golimumab, Infliximab), per analisi pipeline (Fase I, Fase II, Fase III), Per regioni (Nord America, Europa, Asia del Pacifico, Resto del mondo ): Previsioni globali fino al 2025

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Questo rapporto di ricerca di mercato include una segmentazione dettagliata del mercato globale degli inibitori del TNF alfa per classe di farmaci (adalimumab, certolizumab pegol, etanercept, golimumab e infliximab), analisi della pipeline (fase I, fase II e fase III) e regioni (Nord America, Europa, Asia-Pacifico e Resto del mondo).

Panoramica delle ricerche di mercato globali sugli inibitori alfa TNF:
Il rapporto di ricerche di mercato di Infoholic prevede che il mercato globale degli inibitori del TNF alfa crescerà ad un CAGR del 3,6% durante il periodo di previsione 2019-2025. Gli inibitori del TNF, noti anche come bloccanti del TNF, farmaci anti-TNF e terapie biologiche, sono un gruppo di farmaci usati per trattare condizioni infiammatorie, tra cui l'artrite reumatoide, l'artrite giovanile, l'artrite psoriasica, la spondilite anchilosante, la malattia infiammatoria intestinale (Croitis e colite ulcerosa ) e la psoriasi. I farmaci riducono l'infiammazione e possono fermare lo sviluppo della malattia prendendo di mira una sostanza che causa l'infiammazione, il fattore di necrosi tumorale (TNF)

Il mercato sta assistendo alla perdita di brevetti in Europa per vari farmaci di successo, con conseguente comparsa di biosimilari. Nell'aprile 2019, Eticovo, un biosimilare tra Samsung Bioepis e Amgen's Enbrel (etanercept), ha ricevuto l'approvazione della FDA. Nel novembre 2018, la FDA ha approvato Hyrimoz sviluppato da Sandoz, un biosimilare del farmaco di successo Humira di AbbVie, che sarà lanciato sul mercato statunitense entro il 2023. Attualmente, solo cinque inibitori del TNF approvati, ad esempio, adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab e infliximab , controlla il mercato. L'ampia applicazione di questi farmaci per numerose malattie autoimmuni garantisce una crescita costante del mercato durante il periodo di previsione 2019-2025.

I principali attori che operano in questo campo, ovvero AbbVie Inc., Amgen Inc., Johnson & Johnson e Celgene Corporation, stanno generando la maggior parte delle entrate nel mercato globale degli inibitori alfa TNF.

Secondo l'analisi di Infoholic Research, il Nord America rappresentava la quota maggiore del mercato globale degli inibitori alfa TNF nel 2018 e manterrà una posizione elevata durante il periodo di previsione. Il Nord America è seguito dall'Europa, con una quota di mercato superiore al 20% nel 2018.

Per classe di farmaci:
• Adalimumab
• Certolizumab Pegol
• Etanercept
• Golimumab
• Infliximab
Nel 2018, il segmento adalimumab ha rappresentato la quota maggiore e si prevede che cresca a un CAGR a metà singola cifra durante il periodo di previsione. L'aumentata efficacia clinica e l'elevata preferenza da parte dei medici per il trattamento di gravi malattie reumatiche hanno reso il segmento il maggiore azionista nel 2018. Si prevede che Golimumab crescerà a un CAGR elevato durante il periodo di previsione 2019-2025.

Analisi della pipeline:
• Fase I
• Fase II
• Fase III
Molte aziende stanno facendo enormi investimenti per sviluppare prodotti ed entrare nel mercato non appena i prodotti biologici perdono i loro brevetti. Tra i vari inibitori del TNF alfa, adalimumab ha il maggior numero di studi clinici in corso, seguiti da certolizumab pegol.
Per regioni:
• Nord America
• Europa
• Asia Pacifico
• Resto del mondo
Basato sulla geografia, il Nord America ha dominato il mercato nel 2018 con una quota di mercato superiore al 60% e si prevede che mantenga questa posizione durante il periodo di previsione. Si prevede che l'Europa crescerà a un CAGR elevato durante il periodo di previsione. La crescente accettazione dei biosimilari e i crescenti investimenti nella ricerca e sviluppo di nuovi farmaci rendono l'Europa la regione in più rapida crescita durante il periodo di previsione.

Analisi competitiva della ricerca di mercato sugli inibitori globali del TNF alfa: Il mercato sta crescendo a un ritmo costante, cioè a un CAGR del 3,6% durante il periodo di previsione 2019-2025. Nuovi lanci di farmaci, approvazioni di prodotti, partnership strategiche e collaborazioni sono tra le strategie significative adottate dai leader di mercato per mantenere la loro posizione di leadership. Ad esempio, a luglio 2019, la FDA statunitense ha approvato HADLIMA di Samsung Bioepis, un riferimento biosimilare HUMIRA, per il trattamento dell'artrite idiopatica giovanile, la malattia di Crohn adulta, l'artrite psoriasica, la spondilite anchilosante, la colite ulcerosa, l'artrite reumatoide e la psoria della placca. Nel marzo 2019, la FDA degli Stati Uniti ha approvato l'iniezione di Cimzia per il trattamento della spondiloartrite assiale non radiografica (nr-axSpA) negli adulti, con segni distinti di gonfiore che lo rendono il primo trattamento approvato dalla FDA che soddisfa i bisogni insoddisfatti di nr-axSpA; e nel maggio 2018, il farmaco è stato approvato per il trattamento della psoriasi a placche da moderata a grave.

La crescente incidenza di malattie autoimmuni croniche ha portato al crescente lancio di biosimilari a livello globale. Nel maggio 2019, Fresenius Kabi ha lanciato l'IDACIO biosimilare IDACIO in Germania. Nel maggio 2019, Janssen ha lanciato Simponi Autoinjector in Giappone e i farmaci sono distribuiti da Mitsubishi Tanabe. Inoltre, altri importanti fornitori si stanno concentrando sull'investimento enorme in attività di ricerca e sviluppo per sviluppare nuovi farmaci per ottenere una quota elevata nel mercato.
Fornitori chiave:
• AbbVie Inc.
• Novartis AG
• Amgen Inc.
• Johnson & Johnson
• Celgene Corporation
• Assistenza sanitaria cellulare
• Samsung Bioepis Co. Ltd.
• Apogenix
• 3SBIO Inc.
• Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co. Ltd.
Fatti competitivi chiave:
• UCB Biopharma S.P.R.L. sta conducendo una sperimentazione clinica di fase 3 in 15 centri in Germania per studiare “Efficacia e sicurezza di certolizumab pegol (CZP) rispetto a un comparatore attivo e placebo in soggetti con psoriasi a placche (PSO) (CIMPACT)”.

• A livello globale, oltre il 95% degli studi clinici su certolizumab è condotto da UCB Pharma.
• Nel luglio 2018, Mylan ha siglato un accordo di licenza di brevetto con AbbVie sul biosimilare Humira proposto da Mylan. Secondo i termini dell'accordo, AbbVie concederà a Mylan le licenze esclusive sulle proprietà intellettuali di Humira il 31 luglio 2023 negli Stati Uniti e in altri paesi esclusa l'Europa.

Vantaggi: il rapporto fornisce dettagli completi sul sottosegmento del mercato globale degli inibitori dell'alfa TNF. Pertanto, le principali parti interessate possono conoscere le principali tendenze, i driver, gli investimenti, le iniziative dei giocatori verticali e le iniziative del governo nei confronti del segmento farmaceutico nei prossimi anni, insieme ai dettagli delle società pureplay che entrano nel mercato. Inoltre, il rapporto fornisce dettagli sulle principali sfide che avranno un impatto sulla crescita del mercato. Inoltre, il rapporto fornisce dettagli completi sulle principali opportunità commerciali per le principali parti interessate al fine di espandere la propria attività e acquisire le entrate in specifici settori verticali e analizzare prima di investire o espandere l'attività in questo mercato.

Key Takeaways:
• Comprendere le potenziali opportunità di mercato con dimensioni precise del mercato e dati previsionali.
• Analisi di mercato dettagliate incentrate sulla crescita del settore degli inibitori dell'alfa TNF.
• Fattori che influenzano la crescita del mercato degli inibitori alfa del TNF.
• Approfondita analisi competitiva di venditori dominanti e di puro gioco.
• Analisi delle previsioni del settore degli inibitori alfa del TNF nelle regioni sviluppate e in via di sviluppo.
• Informazioni chiave relative ai principali segmenti del mercato degli inibitori alfa TNF.
• Le ultime analisi dell'andamento del mercato che incidono sul comportamento di acquisto dei consumatori.

Azionisti principali:
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Sommario

1 Outlook del settore 10
1.1 Panoramica del settore 10
1.1.1 Driver globale per la domanda farmaceutica 11
1.1.2 Gasdotto R&S nell'industria farmaceutica 11
1.1.3 Principali farmaci farmaceutici per vendite ($ milioni) 11
1.2 Tendenze del settore 12
1.3 Mercato totale indirizzabile 13
1.4 Tendenze del mercato dei farmaci per immunoterapia 13
2 Schema del rapporto 15
2.1 Ambito del rapporto 15
2.2 Riepilogo report 15
2.3 Metodologia della ricerca 16
2.4 Presupposti per la segnalazione 16
3 Istantanea del mercato 18
3.1 Definizione del mercato – Ricerca Infoholic 18
3.2 Mercato indirizzato segmentato (SAM) 18
3.3 Tendenze del mercato degli inibitori alfa di TNF 18
3.4 Mercati correlati 19
3.4.1 Farmaci oncologici 19
3.4.2 Prodotti biologici 20
3.4.3 Biosimilari 20
4 Prospettive di mercato 22
4.1 Segmentazione del mercato 22
4.2 Analisi PEST 23
4.3 Porter 5 (Five) Forces 24
5 Caratteristiche del mercato 25
5.1 DRO – Dinamiche di mercato globali degli inibitori alfa TNF 25
5.1.1 Driver 25
5.1.1.1 Aumentare la prevalenza della malattia autoimmune cronica 25
5.1.1.2 Ricerca costante per sviluppare prodotti biologici basati sugli obiettivi 26
5.1.2 Opportunità 26
5.1.2.1 Sviluppo continuo di biosimilari 26
5.1.2.2 Aumentare le opportunità nei mercati emergenti 27
5.1.3 Limitazioni 27
5.1.3.1 Processo complesso di sviluppo di farmaci 27
5.1.3.2 Scadenza del brevetto 28
5.2 DRO – Analisi dell'impatto 29
5.3 Principali stakeholder 30
6 Prodotto: dimensioni e analisi del mercato 31
6.1 Panoramica 31
6.2 Adalimumab 32
6.3 Certolizumab Pegol 36
6.4 Etanercept 38
6.5 Golimumab 42
6.6 Infliximab 43
7 Analisi della pipeline: dimensioni e analisi del mercato 47
7.1 Panoramica 47
7.2 Fase I 47
7.3 Fase II 51
7.4 Fase III 54
8 regioni: dimensioni e analisi del mercato 66
8.1 Panoramica 66
8.2 Nord America 67
8.2.1 Panoramica 67
8.2.2 US 72
8.2.3 Canada e altri 75
8.3 Europa 77
8.3.1 Panoramica 77
8.3.2 UK 82
8.3.3 Germania 83
8.3.4 Russia e Ucraina 84
8.3.5 Turchia 85
8.4 Asia Pacifico 86
8.4.1 Panoramica 86
8.4.2 India 91
8.4.3 Pakistan 92
8.4.4 Indonesia 92
8.4.5 Thailandia 93
8.5 Resto del mondo 93
8.5.1 Panoramica 93
8.5.2 Messico 98
8.5.3 Brasile 98
8.5.4 Medio Oriente e Africa 99
9 Paesaggio competitivo 100
10 Profilo del fornitore 102
10.1 AbbVie Inc. 102
10.1.1 Panoramica 102
10.1.2 Entrate geografiche 105
10.1.3 Focus aziendale 105
10.1.4 Analisi SWOT 106
10.1.5 Strategie aziendali 106
10.2 Novartis AG 107
10.2.1 Panoramica 107
10.2.2 Unità di business 112
10.2.3 Entrate geografiche 113
10.2.4 Focus aziendale 113
10.2.5 Analisi SWOT 114
10.2.6 Strategie aziendali 114
10.3 Amgen Inc. 115
10.3.1 Panoramica 115
10.3.2 Entrate geografiche 120
10.3.3 Focus aziendale 120
10.3.4 Analisi SWOT 121
10.3.5 Strategie aziendali 121
10.4 Johnson & Johnson 122
10.4.1 Panoramica 122
10.4.2 Business Unit 126
10.4.3 Entrate geografiche 127
10.4.4 Focus aziendale 127
10.4.5 Analisi SWOT 128
10.4.6 Strategie aziendali 128
10.5 Celgene Corporation 129
10.5.1 Panoramica 129
10.5.2 Entrate geografiche 132
10.5.3 Focus aziendale 132
10.5.4 Analisi SWOT 133
10.5.5 Strategie aziendali 133
11 aziende da tenere d'occhio per 134
11.1 Apogenix 134
11.1.1 Panoramica 134
11.2 Celltrion Healthcare 135
11.2.1 Panoramica 135
11.3 Samsung Bioepis Co. Ltd. 136
11.3.1 Panoramica 136
11.4 3SBio Inc. 138
11.4.1 Panoramica 138
11.5 Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co. Ltd. 139
11.5.1 Panoramica 139
Allegato 140
Abbreviazioni 140

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MISSISSAUGA 24 febbraio 2020 (Thomson StreetEvents) – Trascrizione modificata di Bausch Health Companies Inc teleconferenza o presentazione degli utili mercoledì 19 febbraio 2020 alle 13:00:00 GMT

* Arthur J. Shannon

Bausch Health Companies Inc. – Vicepresidente senior e responsabile IR e comunicazioni

* Joseph C. Papa

Bausch Health Companies Inc. – CEO e presidente del consiglio di amministrazione

* Paul S. Herendeen

Bausch Health Companies Inc. – Vicepresidente esecutivo e CFO

* David A. Amsellem

* Terence C. Flynn

Evercore ISI Institutional Equities, Research Division – Senior MD & Senior Analyst of Equity Research

Buona giornata e benvenuti alla teleconferenza sui risultati finanziari del quarto trimestre e dell'intero anno 2019 di Bausch. (Istruzioni per l'operatore) Questo evento è in fase di registrazione.

Vorrei ora rivolgere la conferenza a Arthur Shannon, Senior Vice President Investor Relations e Global Communications. Per favore prosegui.

Arthur J. Shannon, Bausch Health Companies Inc. – Senior VP e Head of IR & Communications (2)

Grazie Alicia. Buongiorno a tutti e benvenuti alla nostra Conference Call sui risultati finanziari del quarto trimestre e dell'intero anno 2019. Alla chiamata odierna partecipano il presidente e l'amministratore delegato, Joe Papa; e Chief Financial Officer, Sig. Paul Herendeen. Oltre a questo webcast live, una copia della presentazione di diapositive di oggi e un replay di questa conference call saranno disponibili sul nostro sito Web nella sezione Investor Relations.

Prima di iniziare, vorremmo ricordarti che la nostra presentazione oggi contiene informazioni previsionali. Ti chiediamo di dedicare un momento alla lettura della legenda delle dichiarazioni previsionali all'inizio della nostra presentazione in quanto contiene informazioni importanti. Questa presentazione contiene misure finanziarie non GAAP. Per ulteriori informazioni su queste misure, fare riferimento alla diapositiva 2 della presentazione.

Le riconciliazioni non GAAP sono riportate nell'appendice della presentazione pubblicata sul nostro sito Web. Infine, l'orientamento finanziario in questa presentazione è efficace solo oggi. La nostra politica è in genere di non aggiornare le linee guida fino al trimestre successivo e di non aggiornare o affermare le linee guida se non attraverso una divulgazione pubblica ampiamente diffusa.

Detto questo, è mio piacere consegnare la chiamata a Joe Papa.

Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO e Chairman of the Board (3)

Grazie Art e grazie a tutti al telefono per esserti unito a noi oggi. Rivediamo rapidamente gli argomenti che tratteremo oggi. Inizierò con un breve riassunto dei punti salienti della nostra azienda del 2019 prima di passare la chiamata a Paul Herendeen, il nostro CFO. Paul ci guiderà attraverso i risultati finanziari del quarto trimestre e dell'intero anno e fornirà la nostra guida per il 2020. Esaminerò quindi i punti salienti e i catalizzatori del segmento prima di aprire la linea per le domande.

A partire dalla diapositiva 4. Nel 2019, il nostro tema era quello di offendere o concentrarci sulla promozione della crescita organica nelle nostre attività principali. Ora abbiamo realizzato 8 trimestri consecutivi di crescita organica e il 2019 è stato il nostro primo anno intero di crescita dei ricavi segnalati dal 2015. Bausch Health è cresciuta organicamente del 4% nel 2019 e i ricavi sono aumentati del 3%.

Il nostro più grande segmento, B + L / International, ha realizzato il suo terzo anno consecutivo di crescita organica dei ricavi a metà singola cifra. Per la prima volta Salix ha registrato ricavi per oltre 2 miliardi di dollari per l'intero anno. Abbiamo generato $ 1,5 miliardi di liquidità dalle operazioni. Abbiamo aumentato gli investimenti in ricerca e sviluppo del 14% rispetto al 2018. E abbiamo utilizzato circa $ 1,1 miliardi di contanti per pagare circa $ 900 milioni di debiti e finanziare circa $ 250 milioni di acquisizioni o prodotti di licenza. Il pivot offensivo includeva anche il lancio di nuovi prodotti e la loro crescita, ei nostri nuovi prodotti continuano a crescere.

In primo luogo, dopo il lancio di Thermage FLX nell'Asia del Pacifico, il franchising Thermage ha registrato una crescita organica del 73% rispetto al 2018. Questo eccezionale tasso di crescita ha reso Thermage una delle 10 migliori franchising di Bausch Health nel 2019. LUMIFY ha raggiunto una quota di mercato settimanale di circa il 43% nel 2019, è il prodotto n. 1 raccomandato dai medici nella categoria allevia il rossore.

TRULANCE TRxs è cresciuto del 31% (sic) (30%) anno su anno e abbiamo migliorato la posizione di accesso al mercato per circa 35 milioni di vite da quando abbiamo acquistato il prodotto nel primo trimestre del 2019.

DUOBRII è stato un altro straordinario. I TRx settimanali sono cresciuti del 25% dal terzo al quarto trimestre del 2019 e ora abbiamo raggiunto un accesso commerciale del 63%.

Nel complesso, l'intero team Bausch Health di 22.000 dipendenti ha mantenuto la nostra promessa di commettere reati nel 2019 e ha dimostrato la durabilità della nostra attività, che è cresciuta sia organicamente che attraverso acquisizioni strategiche. Grande sforzo da parte di tutto il team Bausch Health.

Paul ti guiderà attraverso il quarto trimestre e i risultati dell'intero anno in maggiore dettaglio. Quindi, con quello, lo consegnerò a Paul.

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (4)

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Grazie Joe. Molto da coprire. Proverò ad andare veloce. Buon trimestre e un buon anno. Un approccio leggermente diverso in questo trimestre. Inizierò con la diapositiva 5, un riepilogo delle variazioni delle entrate per segmento e per le principali unità di business sia per il quarto trimestre che per l'intero anno 2019. Successivamente, scenderò dal conto economico di primo livello per il trimestre e fornirò alcune osservazioni su l'intero anno prima di passare alla nostra guida per il 2020.

Un rapido promemoria, quando parliamo di crescita organica, ciò significa escludere l'impatto delle variazioni dei tassi di cambio, l'impatto delle attività cedute e cessate nei periodi dell'anno precedente e l'impatto delle attività acquisite.

Va bene. Diapositiva 5. Nel trimestre, abbiamo registrato una crescita organica del 4% rispetto al quarto trimestre del 2018. Ricordiamo che lo scorso anno abbiamo preso provvedimenti per ridurre le scorte di canali detenute presso i grossisti e che hanno avuto l'effetto di ridurre le entrate del quarto trimestre del 18 di un stimato $ 76 milioni. Quindi questo è un vento in poppa per noi in questo trimestre. Escludendo l'impatto della contrazione delle scorte, abbiamo comunque registrato una crescita organica dei ricavi di livello superiore di oltre l'1%. C'erano molte parti in movimento, ma molte cose buone all'interno di ciascuno dei nostri segmenti.

Cominciamo con Salix in quanto ha contribuito maggiormente alla crescita organica dei ricavi nel trimestre, con un aumento organico del 17% sulla continua forte performance di XIFAXAN, con un aumento del 29%. RELISTOR, in crescita del 29%, e PLENVU hanno anch'essi contribuito alla crescita. Abbiamo perso l'esclusività per APRISO nel trimestre e questo, combinato con la continua erosione generica di UCERIS, ha compensato parte della crescita. Pur non essendo un fattore di crescita organica, le vendite di TRULANCE sono ammontate a $ 18 milioni nel trimestre e i TRx riempiti sono aumentati del 69% rispetto al quarto trimestre del '18. Un trimestre forte da Salix per concludere un grande anno, registrando una crescita organica del 13% delle entrate per l'intero anno rispetto al 2018 nonostante i LOE.

I ricavi del segmento B + L / International sono aumentati organicamente del 3% nel trimestre, guidati da Global Consumer, più il 7% organicamente in forza di LUMIFY negli Stati Uniti e dei nostri marchi globali di soluzioni per lenti a contatto, renu e Biotrue multiuso. Global Surgical ha registrato un aumento organico del 5% nel trimestre in termini di forza nei materiali di consumo per la parte posteriore dell'occhio e le IOL enVista. Global Vision Care ha registrato un aumento organico del 4% nel trimestre in termini di forza nelle lenti mensili in silicone ULTRA idrogel, le nostre lenti AQUALOX Daily SiHy in Giappone e le lenti Biotrue ONEday. La nostra attività farmaceutica internazionale è stata sostanzialmente piatta rispetto al quarto trimestre del '18, mentre Global Ophtho Rx è diminuita organicamente del 2% poiché la crescita di VYZULTA e PROLENSA è stata più che compensata dal declino della famiglia del marchio LOTEMAX a causa dell'erosione generica.

Per tutto l'anno, B + L / International è cresciuta organicamente del 5%, in linea con la nostra convinzione che questo segmento diversificato e duraturo possa offrire nel tempo una crescita a metà singola cifra. Tutte e 5 le business unit di B + L / International hanno registrato una crescita organica dei ricavi per l'anno, guidata da Global Consumer, in crescita organica del 6% in forza di LUMIFY negli Stati Uniti e delle nostre vitamine per gli occhi a livello globale; seguito da Global Vision Care, in crescita organica del 7%, con contributi delle nostre lenti Biotrue ONEday, delle nostre lenti mensili ULTRA e delle nostre lenti AQUALOX Daily SiHy in Giappone.

La nostra attività farmaceutica internazionale è cresciuta organicamente del 5% in forza in Russia, Egitto e Canada. Global Ophtho Rx ha registrato un aumento organico del 2%. A differenza del trimestre, per l'intero anno, la crescita di VYZULTA, PROLENSA e un portafoglio dei nostri marchi oftalmici internazionali hanno superato la resistenza LOE di LOTEMAX. Il segmento Ortho Dermatologics è diminuito organicamente dell'1% nel quarto trimestre del '19 rispetto al '18, poiché la crescita spettacolare nel nostro settore dell'estetica globale, Solta, che è cresciuta del 42%, ha quasi superato il calo del 18% della dermatologia medica.

Nel settore Solta, la piattaforma Thermage è ora saldamente tra i primi 10 prodotti per l'intera azienda e ha contribuito in modo significativo alla crescita dell'intera azienda. LOE ha svolto un ruolo importante nel declino trimestrale del derma medico, principalmente la crema Elidel e Zovirax. Il saldo dei prodotti promossi nel derma medico, tra cui DUOBRII, JUBLIA, SILIQ e BRYHALI, è cresciuto rispetto al quarto trimestre del 2018. È praticamente la stessa storia per il segmento Ortho Derm per l'intero anno, forte crescita da Global Solta, oltre al 45% organicamente per l'anno, più che compensato dal declino della dermatologia medica.

Per l'intero anno, il derm medico è stato il nostro business più colpito dalle LOE, con un calo di $ 121 milioni in meno rispetto al 2018. Tra i lati positivi, JUBLIA è stato uno dei 15 principali contribuenti alla crescita dei ricavi a livello aziendale nel 2019 rispetto al '18. Poiché l'impatto dei LOE è moderato in questo segmento, JUBLIA, insieme ai nostri marchi in fase di crescita, sono DUOBRII, SILIQ e BRYHALI, costituiscono il nucleo del nostro portafoglio di derm medici e le basi per un ritorno atteso alla crescita in questo settore nel 2020.

Infine, il segmento Diversified, che è diminuito organicamente del 5% nel trimestre, in quanto i LOE sono stati un freno di $ 29 milioni sul business neuro. La nostra attività di generici è cresciuta organicamente del 3% nel trimestre con le versioni generiche autorizzate dei nostri prodotti a marchio che hanno perso l'esclusività, principalmente UCERIS, APRISO, LOTEMAX ed Elidel, fornendo la maggior parte di tale crescita. Per l'intero anno, Diversified è sceso organicamente del 5%, poiché la crescita dell'11% del nostro business dei generici ha compensato parte della resistenza alla crescita LOE di $ 116 milioni nel nostro business neuro. I ricavi totali dell'azienda per l'anno sono cresciuti organicamente del 4%, con il 2% derivante dal miglioramento dei prezzi di vendita netti realizzati e il 2% dall'aumento del volume.

Passa alla diapositiva 6, il sommario P&L per il trimestre. Il nostro margine lordo nel trimestre è stato del 71,4%, in calo di circa 20 punti base rispetto al quarto trimestre del 2018, principalmente a causa delle maggiori cancellazioni di inventario nel quarto trimestre del 19 rispetto al trimestre dell'anno precedente. Si noti che per l'intero anno, il nostro margine lordo è stato del 72,7%, favorevole di 80 punti base rispetto al 2018, con un mix di un grande driver, in particolare ha influenzato la crescita di XIFAXAN ma anche dai miglioramenti associati alle nostre attività di Project CORE. La nostra guida finale per l'intero anno per il margine lordo è stata di circa il 73%.

Le spese di vendita e pubblicità nel trimestre sono aumentate – o sfavorevoli su base valutaria costante del 6% rispetto al 4 ° trimestre 2018 a causa dell'aggiunta di TRULANCE al portafoglio Salix e dei maggiori costi di A&P in Vision Care per supportare i nuovi lanci e nel settore farmaceutico internazionale per lancio di prodotti, in particolare in Canada e Russia. Le spese di G&A rettificate su base valutaria costante sono state sfavorevoli dell'8% nel trimestre rispetto al quarto trimestre del '18, a causa dell'aumento del costo delle iniziative di sviluppo aziendale e dei costi IT più elevati in corso mentre continuiamo a lavorare per migliorare i nostri sistemi operativi globali.

Voglio sottolineare che nel quarto trimestre del 2019, il tasso di esecuzione G&A rettificato è – è al di sopra di quello che mi aspetterei in media che il tasso di gestione trimestrale sarà nel 2020. Il tasso di esecuzione G&A rettificato per il futuro è probabilmente tra i 163 milioni di dollari che ha visto nel quarto trimestre e la media di $ 140 milioni nei primi 3 trimestri del 2019. La ricerca e sviluppo è diminuita nel trimestre, favorevole del 5% su base valutaria costante. Non vorrei leggere molto in questo perché è solo il modo in cui i tempi delle spese sono diminuiti in entrambi i periodi. Per l'intero anno, la ricerca e sviluppo è cresciuta del 15% su base valutaria costante a $ 471 milioni, leggermente al di sotto della nostra guida finale del 2019 per ricerca e sviluppo di $ 480 milioni. Ancora una volta, solo il momento in cui sono diminuite le spese. Come vedremo quando arriverò all'orientamento 2020, intendiamo impegnare più capitale nelle attività di ricerca e sviluppo.

L'EBITDA rettificato nel trimestre è stato di $ 898 milioni, in crescita del 5% rispetto al trimestre dell'anno precedente su base valutaria costante. Un trimestre solido che ci ha permesso di registrare un EBITDA rettificato di $ 3,571 miliardi per l'intero anno, che è stato più il 4% su base valutaria costante dal 2018 e appena al di sotto della fascia alta della nostra gamma di orientamento finale per il 2019.

Passando alla diapositiva 7. Penso che valga la pena dare un'occhiata a come abbiamo fatto nel 2019 rispetto al punto medio della nostra guida originale del 2019, che era di $ 8,4 miliardi di ricavi e $ 3,425 miliardi di EBITDA rettificato. Le nostre entrate effettive per il 2019 sono state di $ 201 milioni al di sopra del punto medio della guida originale con un risultato favorevole in funzione di 4 cose: l'acquisizione di TRULANCE ha aggiunto $ 55 milioni; i ricavi delle attività LOE sono stati più di $ 53 milioni; la nostra attività di base è stata favorevole di $ 115 milioni; e compensando le variazioni dei buoni nei tassi FX, i ricavi hanno ridotto le entrate di circa $ 22 milioni.

L'EBITDA rettificato è stato di $ 146 milioni al di sopra del punto medio della nostra guida originale. FX non ha avuto alcun impatto. TRULANCE non ha avuto alcun impatto. Le migliori entrate LOE hanno generato un profitto di $ 36 milioni. Le migliori prestazioni di base hanno aggiunto $ 71 milioni di profitti, mentre gli investimenti in ricerca in R&S e SG&A sono stati entrambi leggermente superiori alla nostra visione originale. Il principale fattore singolo nel miglioramento dell'EBITDA rettificato è stato il nostro margine lordo che si è attestato a 120 punti base meglio di quanto inizialmente previsto, che ha generato un rialzo di circa $ 100 milioni.

Il punto della storia è che con il passare degli anni abbiamo avuto una buona fortuna con gli asset LOE. Ma la maggior parte dei risultati migliori è arrivata dalle nostre unità commerciali che promuovono prestazioni migliori nelle nostre attività di base, dalle nostre attività di Project CORE per migliorare le reti lorde e dai nostri incessanti sforzi per migliorare l'efficienza della nostra catena di approvvigionamento. Un buon anno

Passando alla diapositiva 8, il riepilogo del flusso di cassa. La nostra liquidità netta fornita dalle attività operative nel 2019 è stata di $ 1,501 miliardi, la fascia bassa della nostra gamma prevista in quanto abbiamo aumentato le scorte di alcuni prodotti chiave e API per garantire un'offerta ininterrotta. Tieni presente che alla fine dell'anno avevamo a disposizione $ 3,244 miliardi di liquidità, poiché alla fine di dicembre abbiamo completato un'offerta di $ 2,5 miliardi di titoli non garantiti e non avevamo ancora applicato tali proventi al pagamento del contenzioso statunitense in materia di titoli, ovvero $ 1,21 miliardi, e il pagamento anticipato di altri debiti per $ 1,24 miliardi. Al netto di tali importi e delle relative commissioni, la nostra liquidità operativa a fine anno era di circa $ 750 milioni.

Analogamente, nella diapositiva 9, la liquidità e il debito sul nostro bilancio a fine anno sono gonfiati a causa dei tempi dell'aumento del debito di $ 2,5 miliardi e dell'utilizzo di tali proventi netti. Ci penso così. Pro forma per la distribuzione di tali fondi, il nostro debito netto a fine anno sarebbe stato di circa $ 24,2 miliardi. La risoluzione del caso dei titoli statunitensi ci ha riportato indietro nei nostri progressi riducendo il quanto del nostro debito e migliorando i nostri rapporti di leva finanziaria, ma era assolutamente la cosa giusta da fare per quantificare e risolvere una significativa incertezza a strapiombo.

A parte un attimo, proprio la scorsa settimana, abbiamo iniziato il processo di richiamo di altri $ 100 milioni di capitale in obbligazioni. Intendiamo continuare a ridurre sistematicamente il nostro debito verso il basso.

Un'ultima cosa in bilancio. Durante il trimestre, ci siamo accumulati per la risoluzione del caso di drop of stock negli Stati Uniti, altri casi correlati e contenziosi e indagini in corso. L'accantonamento totale è stato di $ 1,39 miliardi ed è incluso in GAAP Altre entrate e uscite nel nostro conto economico. A scanso di equivoci, escludiamo questa spesa dal calcolo dell'EBITDA rettificato e dell'utile netto adjusted.

Infine, e alle diapositive per me, a partire dalla diapositiva 10, che mostra la nostra guida per il 2020. La nostra guida alle entrate per il 2020 è un intervallo da $ 8,65 miliardi a $ 8,85 miliardi e ciò rappresenta un intervallo di crescita compreso tra l'1% e il plus 3% alle attuali tariffe FX. Le nostre linee guida sull'EBITDA rettificato sono comprese tra 3,5 e 3,65 miliardi di dollari, il che rappresenta un intervallo di crescita compreso tra meno il 2% e più il 2% ai tassi FX correnti.

Voglio coprire gli altri elementi della nostra guida su questa diapositiva prima di parlare di come pensare a tali ricavi e tassi di crescita degli utili per il 2020. Le spese amministrative e amministrative regolate sono state di $ 2,5 miliardi nel 2019 e stiamo guidando a circa $ 2,6 miliardi per il 2020. L'incremento di circa $ 100 milioni o del 4% è superiore a quello che potrebbe essere dato che guardiamo al 2021 e al 2022.

Nel nostro piano 2020, abbiamo razionalizzato OpEx in diverse unità di business, ma abbiamo anche allocato risorse di vendita, pubblicità e promozionali incrementali ad alcune unità per supportare prodotti e prodotti di lancio nelle fasi di lancio, inclusi obiettivi Daily SiHy, LUMIFY, DUOBRII e Thermage. In G&A, stiamo continuando a costruire la nostra organizzazione e infrastruttura IT globale, e questo ha un costo, aumentando i nostri G&A adeguati nel 2020 rispetto al 2019. Mentre avanziamo nel 2021 e nel 2022, dovremmo essere in grado di sostenere la crescita di SGAV inferiore a quello della crescita dei ricavi.

Stiamo guidando a circa $ 500 milioni in R&S per il 2020, in aumento di circa $ 30 milioni dal 2019. Se torni al 2017, il nostro investimento in ricerca e sviluppo è stato di $ 361 milioni. Negli ultimi anni, abbiamo creato l'organizzazione e le infrastrutture di ricerca e sviluppo per supportare un volume maggiore di prodotti per sostenere ciascuna delle nostre attività principali. Ciò include la riduzione dell'intensità di investimento in alcune aree, aumentando nel contempo gli impegni in altre aree in cui eravamo stati sotto-investiti per un certo numero di anni, e in particolare GI, B + L Surgical e Ophtho Rx. Mentre un aumento del 6% in R&S riduce la nostra crescita degli utili e degli utili a breve termine, è la cosa giusta da fare per migliorare le nostre prospettive per realizzare una crescita organica a lungo termine. Per gli interessi passivi, stiamo guidando a $ 1,55 miliardi, in calo rispetto a $ 1,6 miliardi nonostante l'aggiunta di $ 1,21 miliardi di debito per finanziare il regolamento dell'azione di titoli statunitensi.

La nostra aliquota fiscale sugli utili rettificati è stata del 7,8% nel 2019. Prevediamo che tale aliquota sia all'incirca la stessa, all'incirca l'8%, nel 2020. Verso la fine della pagina, notiamo che stiamo guidando le spese in conto capitale nel 2020 di circa $ 300 milioni. In passato, ho affermato che il nostro CapEx allo stato stazionario potrebbe essere compreso tra $ 160 milioni e $ 175 milioni all'anno e che l'aumento nel 2019 è dovuto principalmente agli investimenti in relazione all'iniziativa quotidiana di lenti in silicone idrogel e alla nostra costituzione sistemi IT globali.

Nel corso del tempo, abbiamo stabilito che gli investimenti insufficienti, in particolare nella nostra catena di approvvigionamento, negli ultimi anni richiedono maggiori investimenti nel 2020 e oltre. Riteniamo attualmente che dopo circa 300 milioni di dollari di investimenti nel 2020, probabilmente vedremo diminuire i requisiti di CapEx nel 2021 e di nuovo nel 2022. Il nostro stato stazionario di qualche anno potrebbe essere più vicino a 225 milioni di CapEx all'anno.

Considerazioni potenziali, pietre miliari e accordi di licenza sono stati pari a $ 58 milioni nel 2019 e stiamo guidando a circa $ 100 milioni nel 2020. L'aumento è correlato a una pietra miliare prevista per le vendite su RELISTOR e ai pagamenti relativi ai diritti recentemente acquisiti su XIPERE e NOV03.

Infine, Ristrutturazione e altro. Nel 2019, questi articoli hanno totalizzato $ 52 milioni. Nel 2020, stiamo guidando a $ 75 milioni, sottolineando che questo elemento rappresenta la nostra stima dei costi di ristrutturazione, l'integrazione di alcuni sistemi e il regolamento di casi legali e indagini.

Passando alla diapositiva 11, il ponte dai risultati effettivi del 2019 alla nostra guida per il 2020. Innanzitutto, concentrati sull'impatto LOE. Prevediamo un rallentamento della crescita di $ 275 milioni dal paniere di attività LOE nel 2020. La buona notizia qui è che siamo finalmente vicini a lasciare alle spalle l'impatto del grande secchio di LOE. Nel 27 (sic) (2017) contro il '16, la resistenza alla crescita è stata di $ 486 milioni; nel '18 contro il '17, era $ 289 milioni; nel '19 contro il '18, erano $ 360 milioni. Negli ultimi 3 anni, la nostra crescita dei ricavi è stata trainata da oltre $ 1,1 miliardi di resistenza LOE.

Nel 2020, prevediamo che la resistenza si ridurrà a $ 275 milioni. Ed ecco la parte buona. Ciò si basa sul fatto che realizziamo entrate per il paniere LOE di $ 237 milioni nel 2020. E mentre tale importo diminuirà nel 2021 rispetto al 2020, la resistenza sarà sostanzialmente ridotta. Non abbiamo aggiunto nuovi LOE al paniere LOE nel 2020. E guardando nel periodo dal '21 al '23, prevediamo che l'impatto dei futuri beni LOE sarà abbastanza gestibile.

Le prestazioni di base di oltre 100 – mi scusi $ 415 milioni sono influenzate in modo negativo da alcune cose che ho chiamato durante la nostra ultima chiamata e alcune altre degne di nota. In primo luogo, vi è la parte non ricorrente dei miglioramenti delle reti lorde che abbiamo visto nel 2019, in particolare nel terzo trimestre, che sono un freno alla crescita del 2020. Successivamente, la traiettoria – è la traiettoria di Glumetza. Glumetza era stato un grande performer nei primi 3 trimestri del 2019, prima che ci avvertissimo. È caduto quasi a metà nel quarto trimestre e si prevede che tenderà al ribasso da lì nei prossimi trimestri.

Successivamente, e uno che non avevo precedentemente chiamato per te, abbiamo avuto prestazioni eccezionali nel nostro settore dei farmaci generici nel 2019 con importanti contributi dalle versioni generiche autorizzate di UCERIS ed Elidel. Con il lancio di versioni più generiche di questi prodotti, vedremo un calo significativo delle entrate per le nostre AG nel 2020. Pensa alle AG come a noi che allunghiamo la coda dei marchi che perdono l'esclusività. Va bene, ma sta andando via.

Un altro pezzetto di colore. Le prestazioni di base avrebbero potuto essere migliori, ma la nostra guida include una stima di un significativo vento contrario sulla nostra regione di Asia Pac, in particolare la Cina, associata alla situazione del coronavirus. La nostra guida alle entrate include un impatto di circa 50 milioni di coronavirus. Questa è una stima e vedremo come andrà a finire nel 2020. Ovviamente, ciò ha influito anche sulla nostra guida EBITDA modificata. Pertanto, questi elementi fanno parte del motivo per cui la crescita delle entrate nel 2020 implicita nell'orientamento è compresa tra l'1% e il 3% ai tassi di cambio correnti.

Passando al ponte EBITDA nella parte inferiore della pagina, gli impatti su valuta, LOE e R&S sono autoesplicativi. Nell'ambito delle prestazioni di base, stiamo assorbendo circa $ 100 milioni o un aumento del 4% in SG&A. E l'impatto del coronavirus sulle nostre aspettative di entrate influisce anche sul nostro EBITDA rettificato. Tutti questi elementi insieme sono alla base dei tassi di crescita EBITDA rettificati impliciti che i nostri intervalli di orientamento sono inferiori a quelli del nostro tasso di crescita dei ricavi.

Questo è tutto per me. Di nuovo a te, Joe.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO e presidente del consiglio di amministrazione (5)

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Grazie Paul. Nella diapositiva 12, ci sono molte informazioni, ma il messaggio importante da evidenziare è che ora abbiamo consegnato 3 anni consecutivi di crescita organica delle entrate a metà cifra per B + L / International. B + L / International è cresciuto del 6% nel 2017, del 4% nel 2018 e del 5% nel 2019.

Passando alla diapositiva 13. Global Vision Care è stata una forte performance e voglio evidenziare 2 prodotti che sono stati i driver chiave della crescita in questo settore: le lenti a contatto Biotrue ONEday e ULTRA. Abbiamo mostrato ricavi riportati a 5 anni per ciascuno nel grafico dalla parte inferiore della diapositiva 13. A sinistra, dal 2015 al 2019, le lenti Biotrue ONEday hanno registrato un tasso di crescita annuale composto del 22% e le entrate organiche sono aumentate del 23% nel 2019 A destra, gli obiettivi ULTRA hanno avuto un CAGR del 32% negli ultimi 5 anni e sono cresciuti organicamente del 24% nel 2019. Abbiamo definito le pietre miliari che hanno guidato la crescita incrementale, tra cui il lancio di obiettivi per astigmatismo, presbiopia ed estensione indossare.

Le elevate prestazioni sottolineano la durata di questi prodotti e la forza del marchio Bausch + Lomb. Stiamo assistendo a una maggiore quota di mercato negli Stati Uniti Vision Care. Questa attività ha guadagnato 1,6 punti di condivisione all'11% di quota unitaria per il mese di dicembre 2019 contro una quota del 9,4% a dicembre 2018. Infine, prevediamo di lanciare le nostre lenti giornaliere in idrogel di silicone negli Stati Uniti entro la fine dell'anno. Le lenti in silicone idrogel sono uno dei segmenti in più rapida crescita nel mercato delle lenti a contatto.

Passando alla diapositiva 14 per un aggiornamento su Global Consumer. Voglio evidenziare 2 franchising. In primo luogo, il nostro portafoglio di vitamine dell'occhio più venduto negli Stati Uniti, Ocuvite e PreserVision, è cresciuto organicamente del 4% nel 2019 e ha avuto un CAGR di circa il 7% dal 2015 al 2019. E in secondo luogo, LUMIFY, il primo medico raccomandato dal categoria di alleviamento di arrossamenti, ha registrato vendite per $ 63 milioni nel 2019 e ha raggiunto una quota di mercato settimanale di circa il 43%.

Nella diapositiva 15, abbiamo messo in evidenza le prestazioni di enVista nella nostra attività di chirurgia globale. La famiglia di lenti intraoculari o IOL di enVista sono lenti trasparenti e artificiali che i chirurghi oculari usano per sostituire le lenti naturali di una persona quando diventa troppo torbida a causa di una cataratta. enVista è cresciuto organicamente del 36% nel 2019. Il grafico seguente mostra i ricavi riportati da enVista negli ultimi 5 anni, che sono cresciuti a un CAGR del 22%.

Abbiamo anche lanciato un enVista toric nel 2019, che abbiamo mostrato in basso a destra. Guardando al catalizzatore 2020, prevediamo di lanciare una piattaforma di lenti intraoculari con profondità di messa a fuoco estesa nel 2020. Con l'introduzione di questa piattaforma, entreremo nel segmento IOL premium al di fuori degli Stati Uniti. Infine, prevediamo di lanciare una IOL precaricata piattaforma iniettori per IOL enVista nel secondo trimestre del 2020.

Passiamo ora alla diapositiva 16. Prima di esaminare i punti salienti di Salix, desidero esaminare 2 aggiornamenti.

In primo luogo, dopo aver esaminato il nostro portafoglio IG alla luce delle opportunità di mercato, abbiamo deciso di aumentare l'attenzione promozionale su XIFAXAN e TRULANCE e abbiamo interrotto la promozione di DOPTELET e LUCEMYRA. Inoltre, abbiamo recentemente ricevuto la notifica che Norwich Pharmaceuticals ha presentato un ANDA per compresse rifaximin da 550 milligrammi. Alfasigma e Bausch Health presenteranno denuncia contro Norwich, sostenendo la violazione di brevetti e scateneranno un periodo di approvazione di 30 mesi. Rimaniamo fiduciosi nella forza dei 23 brevetti che coprono XIFAXAN e continueremo a difendere vigorosamente la nostra proprietà intellettuale.

Il grafico a destra mostra la crescita di XIFAXAN TRx negli ultimi 9 trimestri. Come puoi vedere, TRxs è cresciuto del 7% dal 2017 al 2018 e dell'8% dal 2018 al 2019. In particolare per IBS-D, TRxs è cresciuto del 15% nel 2019 rispetto al '18.

Passando ora a RELISTOR, TRxs è cresciuto del 6% nel 2019. E a partire dal 2020, abbiamo recentemente migliorato la posizione di accesso al mercato orale di RELISTOR per oltre 50 milioni di vite.

Finalmente TRULANCE. I TRx sono cresciuti di oltre il 30% nel 2019. E dall'acquisizione, abbiamo migliorato la posizione di accesso al mercato per circa 35 milioni di vite. Stiamo registrando progressi nel mercato a marchio IBS-C, in cui la nuova quota di mercato di TRULANCE Rx è cresciuta – dal 3,9% al 6,4% nel 2019.

Alla diapositiva 17, Ortho Dermatologics. In primo luogo, DUOBRII TRx è aumentato del 25% nel quarto trimestre rispetto al terzo trimestre, e siamo molto soddisfatti di questo lancio. Come mostrato nella tabella in basso a sinistra, entro 2 quarti dal lancio, DUOBRII sta catturando circa il 40% dei nuovi pazienti che iniziano con un prodotto di psoriasi topica o orale con marchio di prima linea. Quando si guarda DUOBRII contro questi 3 concorrenti elencati, riteniamo che offra una prospettiva sull'opportunità di DUOBRII e sui potenziali risparmi che potrebbero derivare dal ritardare la necessità di iniziare i pazienti con un trattamento biologico.

Inoltre, sono lieto di dire che DUOBRII è ora al 63% di accesso commerciale per gli Stati Uniti. E guadagniamo – man mano che otteniamo una copertura incrementale, prevediamo di ridurre il supporto dei coupon e prevediamo che le reti lorde miglioreranno nel tempo. È importante sottolineare che il prezzo medio di vendita è aumentato dal terzo trimestre e abbiamo chiuso l'anno con un ASP più elevato. Ci stiamo chiaramente muovendo nella giusta direzione. Siamo molto entusiasti dell'opportunità per DUOBRII, principalmente perché, per la prima volta, possiamo offrire ai pazienti con psoriasi un prodotto topico con un corticosteroide ad alta potenza che possono trattare fino alla clearance piuttosto che essere limitati per un certo periodo di tempo.

Passando ora a SILIQ. TRxs è cresciuto del 100% nel 2019 rispetto all'anno precedente e abbiamo raggiunto un accesso commerciale del 67%. I BRXHALI TRx sono aumentati del 60% nella seconda metà del 2019 rispetto alla prima metà e BRYHALI ha ora un accesso commerciale del 71%. Riteniamo che tassi di accesso dal 60% al 70% dimostrino che l'assistenza gestita riconosce il valore e l'efficacia dei nostri prodotti per la psoriasi nel contribuire a migliorare la vita dei pazienti.

A destra, evidenziamo un nuovo modello di pagamento in contanti per i nostri prodotti di dermatologia su prescrizione negli Stati Uniti, ora disponibile online su Dermatology.com. Telemedicina ed e-commerce sono disponibili sulla piattaforma da ieri. Prodotti iconici come Retin-A saranno disponibili su Dermatology.com e nuovi prodotti come ALTRENO. La piattaforma è stata lanciata con un portafoglio di 15 prodotti e prevediamo di espandere il numero di prodotti con pagamento in contanti nel tempo. Riteniamo che Dermatology.com abbia il potenziale per soddisfare le esigenze dei pazienti e contribuire a far crescere la nostra attività in dermatologia.

Passando alla diapositiva 18. La nostra attività estetica, Global Solta, è cresciuta organicamente del 42% nel quarto trimestre del 2019 rispetto al quarto trimestre del 2018 e del 45% nell'intero anno, guidata dall'espansione globale di Thermage FLX. Thermage è una terapia a radiofrequenza non invasiva che può affrontare la scienza dell'invecchiamento della pelle. Puoi vedere la tendenza nel grafico a sinistra con un CAGR del 46% dal 2017. Guardando al 2020 oltre, prevediamo di vedere una continua espansione globale per Thermage FLX, compresa l'espansione geografica nell'UE.

Nella diapositiva 19, puoi vedere che abbiamo un buon numero di programmi di sviluppo in fase avanzata in ciascuno dei nostri 4 segmenti di business. Abbiamo aumentato gli investimenti in R&S nel 2019 rispetto al 2018 e abbiamo assegnato una percentuale maggiore del nostro budget in R&S a Bausch + Lomb e Salix su base annuale. Il lancio di nuovi prodotti guiderà la nostra crescita futura e siamo lieti di avere una pipeline attiva in fase avanzata di nuovi programmi innovativi con il potenziale per espandere il nostro portafoglio di salute degli occhi, IG e dermatologia.

Ho parlato di alcuni dei programmi lungo la strada, ma voglio evidenziarne un paio in modo più dettagliato. Prima di passare alla Slide 20, all'inizio del 2018, abbiamo identificato i Significant Seven come fattori chiave per la crescita futura. Questi 7 prodotti sono cresciuti collettivamente del 68% nel 2019. Mentre siamo soddisfatti di quella crescita, limitandoci a 7 prodotti ed escludendo prodotti di crescita come Biotrue, ULTRA, PreserVision, enVista IOL, Thermage, Aplenzin, TRULANCE e XIFAXAN non ci dà quadro completo dei driver attesi della nostra crescita futura delle entrate. Di conseguenza, continueremo a registrare i ricavi per i nostri primi 10 prodotti per ogni azienda e in generale per Bausch Health, ma non segnaleremo più i ricavi combinati per i Significant Seven.

Let's turn to Slide 20 for additional detail on our promising late-stage programs in GI and eye health. Amiselimod is a late-stage oral compound that targets the S1P receptor, which plays an important role in autoimmune diseases such as inflammatory bowel disease. Approximately 1.6 million Americans currently suffer from IBD and as many as 70,000 new patients are diagnosed in the U.S. annually. We entered into an exclusive licensing agreement with Mitsubishi to develop and commercialize amiselimod in April 2019.

In January 20, we completed an FDA-approved cardiovascular clinical trial protocol that compared amiselimod to placebo and moxifloxacin. The primary endpoint demonstrated that amiselimod had no effect on QT interval prolongation and no other secondary safety signals were identified. We expect to initiate a multi-arm, randomized, placebo-controlled Phase II study in 2020 in ulcerative colitis for amiselimod.

On Slide 21, we highlight NOV03, which we recently licensed in for the U.S. and Canada. NOV03 is a nonaqueous eye drop for the treatment of Dry Eye. The prescription Dry Eye market represents a great opportunity with 6.8% of the U.S. adult population projected to have diagnosed Dry Eye disease, and prevalence will increase with age.

If approved, NOV03 will be the first new prescription treatment for Dry Eye disease with a mechanism of action that is different from currently available products. A Phase II study has already been completed, which showed significant and clinically meaningful improvements in both signs and symptoms of Dry Eye disease. There's a Phase III study underway, and we expect to initiate a second Phase III study later this year.

To wrap up, on Slide 22, we have provided an overview of the 2020 vision for our 3 core businesses which includes both a look back and what has driven performance and a look ahead to what is coming into focus for 2020.

First, Bausch + Lomb. We expect mid-single-digit growth to continue for 2020 based on 5 years of organic revenue growth for ULTRA, Biotrue and Ocuvite and PreserVision and new products like LUMIFY and VYZULTA. Looking ahead, we see significant opportunities in the SiHy launch in the U.S., in EU and the rest of the world, the ramp-up of our enVista IOL platform and the expected launch of an extended depth of focus for the IOL platform.

Next, in Salix, while absorbing the headwinds from APRISO and Glumetza in 2020, our GI business will be based on 2 years of high single TRx growth for XIFAXAN, increased market share for TRULANCE and double-digit growth driven by market access for our RELISTOR oral business. In 2020, we are planning to look forward to also PLENVU ramp-up, continued development of new formulations and indications for rifaximin and pipeline expansions, including dolcanatide and amiselimod.

Third, Ortho Dermatologics, we expect this business to return to growth in 2020 based on a 73% organic revenue growth for Thermage franchise, weekly DUOBRII TRx growth and increased commercial access, driving improved gross-to-nets and the continued ramp of launch products, including SILIQ, BRYHALI and ALTRENO.

Looking ahead, we seek opportunity in building out the cash pay model with more products, telemedicine and e-commerce and the launch of ARAZLO. Finally, we continue to expect to deliver on our 3-year CAGRs on a constant currency basis. And for the midpoint of 2019 guidance, we expect revenue to grow at 4% to 6% CAGR and adjusted EBITDA to grow at 5% to 8% CAGR.

With that, operator, let's open up the line for questions.

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Questions and Answers

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Operator (1)

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(Operator Instructions) The first question today comes from Terence Flynn of Goldman Sachs.

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Terence C. Flynn, Goldman Sachs Group Inc., Research Division – MD (2)

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Maybe 2 for me. Just wondering, at a high level, what's embedded in your 2020 guidance for net pricing across the portfolio. How that compares to 2019?

And then on SiHy, the launch in Japan. I was wondering any details you can share on market share. And then how we should think about pricing and positioning as you approach the U.S. launch?

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (3)

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Okay. Let me start on our pricing — net pricing. Our expectation is that we'll have somewhere in that 2% range, approximately. That's very consistent with what we saw in our 2019 information. Net pricing was approximately 2%. We expect it to be something comparable to that. Now there will be some variation between the product A and product B, but on balance there.

In terms of the SiHy market share, again in Japan, we're pleased with our initial launch in Japan. There were some issues that we had to deal with as we launched a new product, but on balance, we're pleased with what we've seen in terms of that launch. And as Paul said in previous quarters, importantly, as we looked at the Japan market, we believe the SiHy market as a percentage of Japan is about 15% and is growing by about 31%, so — the SiHy market that is. So we think it's an important contributor to growth and will be an important contributor for a long time and also as we launch here in the U.S. later this year. The U.S. is a little smaller percentage of total market in the U.S. It's less than, I think, 13%, but we also see it growing quickly. So we're excited about what that means for us.

We probably aren't going to say anything about pricing yet on the SiHy Daily, but I think you can think that will be competitive with the other products out in the marketplace in the U.S. SiHy Daily business.

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Operator (4)

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(Operator Instructions) The next question comes from David Amsellem of Piper Sandler.

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David A. Amsellem, Piper Sandler & Co., Research Division – MD & Senior Research Analyst (5)

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I wanted to focus on XIFAXAN. And looking at the IQVIA retail data is in January, it looks like the growth trajectory of prescriptions is a little more muted compared to 2019. So I'm wondering if there's any indication that the franchise is maturing in any way. And how should we think about the trajectory of volumes for both IBS and AG as we move more into 2020?

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (6)

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Sicuro. I'll start with that one. We always see some normal variation in the early year, especially as patients have the donut hole questions and different reimbursement challenges as we start the year. So we don't see anything specifically happening there that is unusual relative to what we've seen in the past.

I think as you think about trajectory, I mean if you — one of the comments I made was talking about XIFAXAN specifically relative to IBS-D. I remind you that within IBS-D, we were growing, I think, it was mid-double digits. Somewhere around 15%. And importantly, we believe the opportunity there is still very significant for us with XIFAXAN.

Remember that the IBS-D category, for example, has about 9 — I'm sorry, has about 12 million antispasmodic prescriptions. And as we've looked at that, we're less than, let's call it, 10% of that business. Therefore, we believe we've got a great product for IBS-D patients, where, with an episodic treatment, you can potentially get these patients to just move off of these products like the antispasmodics like BENTYL dicyclomine and actually get relief from — long-term relief for use of XIFAXAN. So we're going to continue to promote that area, and we continue to expect to see that growth going on into the future to be clear.

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Operator (7)

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The next question comes from Ken Cacciatore of Cowen and Company.

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Kenneth Charles Cacciatore, Cowen and Company, LLC, Research Division – MD & Senior Research Analyst (8)

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Congratulations on all the progress. I know from time to time, you're asked about splitting or selling some of the businesses. But I was wondering, as you get more credit for your performance and the underlying value of all the entity and everything that you're doing, your equity is clearly responding. So I just wanted to know, strategically, how do you view your equity? Is this something that you would think about using to deleverage? Is it something you're thinking about in terms of maybe larger acquisitions? Just wanted to get your thoughts on that.

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (9)

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Sì. Thanks for the question, Ken. It's Paul. Sì. Our equity has responded. It kind of opens the door to potentially using that equity in some way. I'd say that, for now, I mean, we have a great deal of runway to continue to run our businesses and using equity to reduce our leverage and just be — based on the quantum of our debt and what it would take in order to make a meaningful change, probably not the path we go down.

Now using equity in the context of a value generative transaction, obviously, would have to be the right transaction and something we were incredibly excited about, but we would indeed consider that. I want to touch on because it's interesting. We haven't heard the question as often about splitting the company up over the last, I'd say, several months as the stock has performed better. But I think when you look longer term, the trend — the overall trend in financial markets is for a preference on the part of investors for pure plays. And we own a bunch of great businesses that are today together, and I think that they are stronger — we are stronger with those businesses together today in light of our capital structure.

But as we look down the road, some day down the road, there may be opportunities to pursue more pure plays with respect to one or more of our businesses. But that's just something that's down the road.

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Operator (10)

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The next question comes from Umer Raffat of Evercore.

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Umer Raffat, Evercore ISI Institutional Equities, Research Division – Senior MD & Senior Analyst of Equity Research (11)

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I have 2, if I may. One for you, Joe — maybe both for you, Joe. Okay. So you clearly characterize the pivot to be offense and the EBITDA growth of 5% to 8%. But in light of the guidance for this year and in light of our raising investor debate on whether the base business is truly a growth business in the first place, I'm curious, do you feel strongly that the 5% to 8% CAGR is achievable? Especially this year, tracks at the midpoint of the guidance?

And secondly, I was very curious about the S1P1 press release you guys put out in January, not only because I could still never find the trial online anywhere. So I was curious where it was actually done. And — but also, it seemed to me that the issue with the drug was cardiovascular adverse events and not exactly a QT signal. So I was curious that FDA asked you to do a QT study as a clearing event for larger trials.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (12)

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Okay. So I'll start on the first part of the question of what we're thinking about pivot to offense and guidance, but I'm going to also turn it over to Paul who's worked his way through that. And then I'll comment on the S1P modulator.

So the simple answer to your question on the CAGRs, are we confident? The answer is yes. We continue to look at that revenue guidance of 4% to 6% growth and then the 5% to 8% on the EBITDA as something that is achievable, and I'm going to let Paul comment more about that specifically. But the simple answer is yes. And Paul, do you want to make some specific comments, and then I'll come back on the amiselimod?

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (13)

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Yes, sure. I mean — and thanks for the question because we — Umer, because we do get this question a fair amount. Joe said in his remarks, so let's refresh what we meant when we said 4% to 6% and 5% to 8%. It was off the midpoint of our original 2019 guidance at constant currency. If you adjust that, you would could come up with a range of targets for 2022 in order to meet that CAGR in the range of, say, circa $9.4 billion to $9.95 billion in revenue, $3.9 billion to $4.29 billion for adjusted EBITDA. Yes, we continue to believe that we can and will produce revenue and adjusted EBITDAs in that range. I mean, that's our current belief. Obviously, not a forecast or a bit of guidance that we take lightly. It is fully supported by our bottoms-up long-term view of what we think we can do with each of our businesses.

I want to point out because people lose sight of this, and say it was off the midpoint of 2019 guidance. I spent some time in my prepared remarks talking about how we did in 2019 relative to that original midpoint. We did better so that helps us along the road. I think people are going to look at our revenue — forecast revenue off of our guidance range of plus 1% to plus 3% and adjusted EBITDA minus 2% to plus 2%, say, gee, you're not on track. And say, first of all, we've said this a million times, it's not linear. And we are focused on where we need to be in 2022 in order to be able to achieve those targets that we set for ourselves, and we remain confident that we can achieve those targets.

The good news is we had a great 2019. The bad news is part of that was through LOEs that continued on. We're delighted to have earned the profit and have generated the cash from those LOEs, but that goes away. And so that's a bit of a growth track for us in 2020. Net-net, we are on track.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (14)

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On the second part of your question, Umer, on the S1P modulator, amiselimod, the trial that we did was an FDA-approved protocol that we had gone and had the FDA approve the protocol. So we had that in place. We wanted to solve that question or answer that question so that we were assured that there was no QT elongation issue. As you know, other products in this category have had that problem. And we wanted to make sure that, that was not going to happen with this product.

We had belief that it wasn't, but we finished — we wanted to finish the definitive trial for amiselimod to get to that answer. So that is the reason we did it. There was no request or anything. It was just — we had asked and had that as part of the information that we acquired when we received the product from Mitsubishi on amiselimod. So I think that answers that part of the question.

On the rest of it, we will publish this trial. It has not been published yet, but it will be published and presented in a poster session in the not-too-distant future. And I think that was the other part of the question.

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Operator (15)

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The next question comes from Gregg Gilbert of SunTrust.

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Gregory Daniel Fraser, SunTrust Robinson Humphrey, Inc., Research Division – Research Analyst (16)

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It's Greg Fraser on for Gregg Gilbert. On XIFAXAN, can you comment on payer coverage for the IBS indication and whether there's any room for improvement there? And can you also please comment on your initiatives to drive higher growth for the HE indication?

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (17)

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Sicuro. We have very strong coverage for XIFAXAN. Overall, it's 98.7%. HE is a little bit stronger, but at that level, it's essentially universal coverage. I mean, we've got very strong coverage on XIFAXAN. There is some variation from plan A to plan B, but we're very pleased with that.

On the question of HE, our view is that we are going to continue to try to improve the compliance and adherence to the product. We have great data that says that if a patient stays compliant with XIFAXAN, you can reduce rehospitalization for hepatic encephalopathy. And if we're able to do that, obviously, we could save the healthcare system a tremendous amount of dollars. So that's our plan and our focus, and we continue to go out and share that data with plans so that they can help lower the cost.

Our fundamental belief, though, is that as healthcare plans, and there's mergers where the medical and the pharmaceutical comes together, we believe we're going to have even more traction on that as we look at the opportunity to not only lower the total cost of the patient from the point of view of both the drug cost and the cost of rehospitalization, et cetera.

So that's our plan, and that's how we've been working on it. We think it's going to be important for patients going into the future with hepatic encephalopathy. And you may recall from our previous comments, we're even looking at trying to get to some of these patients before the actual hepatic encephalopathy by going after some clinical trial evidence that we see in patients who have cirrhosis. So a lot more work. Stay tuned to that for the future.

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Operator (18)

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The next question comes from Jason Gerberry of Bank of America.

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Jason Matthew Gerberry, BofA Merrill Lynch, Research Division – MD in US Equity Research (19)

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So a quick question on XIFAXAN. I think previously, in September, you communicated around a 10% to 12% range of growth with minimal contribution from Project CORE. I just wanted to confirm if that's still the fundamental outlook.

And then just on the Significant Seven, is the change in disclosure more or less, hey, this isn't indicative of our broader pipeline value? Or is there a diminished outlook as it pertains to the $1 billion target end of 2022?

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (20)

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Paul, why don't you take the first part of that?

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (21)

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Sì. Sì. On the first part of that, I think what we said was we kind of continue to believe that XIFAXAN would — in 2020 versus 2019 that the way — best way to forecast that would be to think about TRxs in growth and use as a proxy for unit growth. And I think we continue to believe that, that can be in the high single digits. And to that, you need to add a couple hundred basis points of net price increase. And the reason it's only a couple hundred basis points is that nonrecurring part of the revenue that we saw in 2019 related to the nondurable part of the improvements in gross-to-nets. Some of it is reflected in absolutely improved net selling price increases that we've realized in '19, but some of it is — it just goes away and becomes kind of a growth headwind.

So net-net, I think we pretty much said high single-digits units and a couple hundred basis points of growth, so circa 10%.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (22)

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On the second part of your question on Significant Seven, the way we looked at it is if you go back historically, in 2018 — early 2018, we identified 7 products that we felt were the key growth drivers for us. And as we thought about that, we had great success. This year, it was up 68%, achieved $269 million and expect to see it continue to grow to be clear going forward.

But what we felt is that that's going to leave out some really important growth drivers like XIFAXAN, like TRULANCE, like Thermage, like Biotrue, ULTRA, PreserVision, enVista, Aplenzin. And we really came up with a group of not 7, but actually, I could be fair to say, so close to 15 products that are clear drivers for our future. Now we're not going to comment specifically about those. But my point was that there are some big opportunities there for the future relative to where we saw the future of this business.

And specifically, you get a product like XIFAXAN, our largest product growing double digits, it really is a meaningful contributor. And you can't leave that out of the equation as you're thinking about the future for our business. So that was really the issue. It was — no concerns about our expectations for the future on that one.

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Operator (23)

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The next question comes from Chris Schott of JP Morgan.

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Christopher Thomas Schott, JP Morgan Chase & Co, Research Division – Senior Analyst (24)

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Maybe — first question was maybe one for Paul and just following up with the potential for a split and some of those comments you made on investor appetite for pure plays. I think you mentioned that's a trend to think about down the road. But just maybe a little more color on what you'd need to see to enable a split. Is this simply just a matter of getting leverage to a lower level? Or is there something fundamentally we need to think about in the businesses before you would consider maybe separating out into individual kind of units as compared to the portfolio you have today?

My second question was just a quick one on the second XIFAXAN filer. Just any color about this filer relative to Sandoz as you think about the defense of that franchise over time?

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (25)

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Sì. Chris, thanks for the question. I'll obviously take the first one. Leverage, I would say our level of leverage today is a — makes — it would make it challenging to pursue something where we spin out one of our entities or whatever. It's not impossible, but it would make it a fairly significant challenge. That is the primary thing that we'd sit there and say, it becomes more clear for us with the passage of time. And again, I don't think I'm saying anything here that's groundbreaking.

A pure play is a thing. I mean, people love pure play. We get it. We own businesses that are very attractive and very attractive in their own right. As we're sitting here today and for the near term, we continue to believe that we are, based on our cap structure, stronger together. And we'll continue to evaluate opportunities for providing that pure play as we go forward.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (26)

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On the second part of your question, new XIFAXAN filer, as I mentioned in my comments, that company is Norwich. My understanding, although we don't have all the information yet, is they filed specifically on both the IBS-D and HE. Our belief is that we have 23 patents. So when we initially settled with the largest generic company, Teva, we had 22 patents. We have now supplemented that with another patent. So we have 23 patents. So we feel very strong about our intellectual property position relative to this filing. And we don't see anything specifically different from this — from what they filed versus what Teva filed.

So we continue to believe we've got a strong intellectual property position. So no other specifics — any differences that we've observed.

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Operator (27)

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The last question comes from Akash Tewari of Wolfe Research.

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Akash Tewari, Wolfe Research, LLC – Director of Equity Research & Senior Research Analyst (28)

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So look, if we take into account the $275 million LOE impact, the roughly $160 million kind of inventory true-up accrual benefit you had in 2019 that we might not necessarily carry over, it looks like you need over $500 million in new product sales year-over-year to kind of hit the midpoint of your guidance on reps. Can you walk us through where that growth is coming from?

I'm assuming maybe like $150 million is on XIFAXAN, but what's the contribution on the Significant Seven? What's the contribution on Thermage, et cetera, et cetera? Any color would be really appreciated.

And then just a bit on the cash flow. There was a bit of dip in Q4. I'd love a bit more color on what happened. And then how we should think about it in 2020. It looks like your 2020 cash flow from operations is $1.5 billion, which is a bit lower than what I had expected. So if there's any color on that, we'd really appreciate it.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (29)

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Okay. I'm going to start, but Paul — we're going to — there were quite a few questions there. We're going to have to take pieces here.

I think the fundamental first question is, where can we grow and how can we grow in 2020 and beyond? And what I would simply go back to is that as we look at our business, we think the overall B + L/International business is going to grow at that mid-single-digit rate. I think your characterization of XIFAXAN growing ballpark 10%, I think that's a fair characterization. Solta, I think you saw the growth that we experienced with Solta in 2019. We clearly think that, that's a great opportunity. And then the final area I'd say is the derm returning to growth is a really important message. If you think about our business, the B + L business, the Salix business have been important to us, but we've had a headwind with dermatology.

As that dermatology grows, especially with some of the new programs, new products like DUOBRII plus the Derm.com — Dermatology.com contribution to our business, we think are all going to be important parts of that growth for the future. And obviously, we got less LOEs versus we had in the past. But Paul, anything you want to add to that portion or talk a little bit about cash flow with them?

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Paul S. Herendeen, Bausch Health Companies Inc. – Executive VP & CFO (30)

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Well, sure. I mean, I actually — I do want to talk about the kind of the growth, where is it going to come from. First is, I think you stated a number on the kind of an inventory issue that was well above what it really was. In 2019, the '18, the aggregate amount that it was kind of a onetimer, if you will, of us taking those wholesale inventories down was $76 million. A big number in the quarter, a couple of hundred basis points of volume growth that was based on that relative — basically what was a relative expansion, although it was not an expansion at all. And for the year, yes, it was also baked into our year versus 2018, but not as big a factor on a total revenue base of $8.6-odd billion.

If you look at the bridge on Slide 11 of our presentation, that $415 million of increase in coming from what we call base performance is obviously net of any pipeline things that would have come up. So that bridge shows you, I think, how we will get to in the aggregate at a company-wide basis, how we'll get to within our revenue guidance.

With respect to cash flow, I mean, I don't want to start with 2019 because, as I said in my prepared remarks, we were at $1.501 billion. So just at the low end of our guidance range. And to be super clear, that is for cash generated from operations, and that's on a GAAP basis.

The primary difference between us at being $1.5 billion and being $1.55 billion or $1.6 billion was that we did at the end of the year have more inventory than we had perhaps been thinking about when we started the year. And that was based on specific decisions that we took to increase inventories, both finished goods and of API for key products to ensure that we had consistency of supply. You'll get our balance sheet later this year. You'll see the increase in our inventory at the end of the year, and that was a primary driver.

Looking ahead to 2020, we have all the factoids that you essentially need to make — come up with a forecast for cash flow from ops. You've got our adjusted EBITDA from the guidance range. You've got our interest expense. You've got restructuring and other. You've got recent milestones and license agreements. You have a pretty good idea what our taxes will be based on our guidance there. And the 1 wildcard is working capital. We will grow in 2020, 2019. And accordingly, that growth, if you assume we're currently at the right level of adjusted working capital, which I would comment on in a minute, that you would add some working capital.

So you'll do that math and you're going to come out somewhere near $1.5 billion. That's the way the math works out. I mean, the pieces that you can't see or can't forecast as well as we can is the interaction or the impact of accruals and other things that are very difficult to forecast. But I think the length — the $1.5 billion will be consistent. I mean, interesting if you look at the history, in 2018, it was $1.501 billion. In 2019, it was $1.501 billion. And we're guiding to $1.5 billion in 2020. It's what we expect today. It could be more than that, but we'll just have to wait and see how that year plays out.

On my last comment, I said about inventory and working capital. I want to provide additional texture. Over time, we are going to drive our inventory balance down. We made some progress, and we've now taken some strategic steps that have moved us in the opposite direction. Longer term, we will be able to unlock cash from our balance sheet by better managing our inventory balances. It's — we're not seeing it in 2019. And I'm essentially telling you we're not going to see it in a significant way in 2020. Stop there.

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Joseph C. Papa, Bausch Health Companies Inc. – CEO & Chairman of the Board (31)

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Okay. Let me just thank everyone for joining us, and we'll see you soon as we will be on the road for the next few months at the various healthcare conferences. Thank you, everyone, for joining. Have a great day, everyone.

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Operator (32)

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The conference has now concluded. Thank you for attending today's presentation. You may now disconnect.

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Bene, si scopre che non solo abbiamo bisogno di alimenti ricchi di nutrienti per avere corpi sani, ma dobbiamo anche mangiarli per capelli sani. Mentre le pubblicità televisive ti dicono che una formula speciale in un certo tipo di shampoo o olio lo farà, mangiare vitamine è l'opzione migliore per una crescita più rapida dei capelli. È molto più facile da integrare nella tua routine (a meno che tu non sia un orso in letargo che non mangia quotidianamente).

Che aspetto ha una dieta ricca di nutrienti? Dovrebbe essere composto da tutte le 13 vitamine essenziali che possono aiutare a mantenere la salute dei capelli. Le vitamine essenziali includono vitamina A, C, D, E, nonché il gruppo del complesso B.

Ci sono alcuni avvertimenti quando si tratta di una crescita più rapida dei capelli. Inutile dire che non esiste un trattamento “taglia unica per tutti” per la caduta dei capelli. Se il tuo bestie può far crescere i capelli più velocemente di te, non significa che dovrebbe essere lo stesso per te. In secondo luogo, nessuna prova supporta l'idea di singole vitamine che incoraggiano i capelli a crescere più velocemente.

Il segreto per risolvere ENTRAMBE questi problemi è includere una combinazione di aggiunta di integratori e regolazione della dieta per garantire che includa le giuste dosi di nutrienti essenziali come il ferro. I ricercatori hanno condotto una serie di studi su come le vitamine D ed E potrebbero supportare la crescita dei capelli, insieme alle vitamine del complesso B. Quando non mangi queste vitamine, le carenze causano la caduta dei capelli, quindi è importante consumarne abbastanza per ridurre la possibilità di perdere i capelli.

Quanto tempo ci vuole per vedere i risultati dalle vitamine dei capelli?

Prima di iniziare, sappi che possono essere necessari circa 3 mesi per iniziare a vedere i risultati o fino a 6 mesi per vedere i risultati completi. Infatti, potresti riscontrare carenze nel presentarsi come spargimento eccessivo. Ma poi quando le cellule ciliate iniziano a crescere con buone vitamine, di solito inizierai a vedere i risultati entro 6-12 settimane, che è il periodo di tempo di un ciclo di crescita naturale dei capelli.

In questo articolo, forniamo informazioni sulle migliori vitamine per capelli per una crescita più rapida dei capelli per prevenire il diradamento e la caduta dei capelli.

Le migliori vitamine per capelli per una crescita più rapida dei capelli:

Vitamina A

Tutte le cellule del corpo hanno bisogno di vitamina A per la crescita, compresi i capelli. La vitamina A, è una vitamina di fondamentale importanza per la salute dei capelli.

La vitamina A aiuta anche le ghiandole della pelle a produrre sebo che è una secrezione oleosa della nostra pelle che idrata il cuoio capelluto e mantiene sani i follicoli piliferi. Il sebo favorisce la circolazione dell'ossigeno sul cuoio capelluto e rafforza i follicoli piliferi migliorando la crescita dei capelli e prevenendone la rottura. Non sorprende quindi che una carenza di vitamina A possa portare a A) capelli secchi e B) perdita di capelli.

Tuttavia, una recensione del 2017 ha mostrato che l'assunzione di quantità in eccesso può avere effetti negativi, inclusa la perdita di capelli. Quindi, consuma solo la quantità raccomandata perché di più non è meglio quando si tratta di vitamina A.

Gli alimenti ricchi di vitamina A includono: carote, zucca, patate dolci, spinaci, olio di fegato di merluzzo, peperone rosso dolce, piselli dagli occhi neri, albicocche, cavolo e cavolo, mentre prodotti animali come latte, uova e yogurt inoltre sono ricchi di vitamina A.

Vitamina B7

La vitamina B7 o la biotina scompone le proteine ​​per espellere gli aminoacidi essenziali per rafforzare i capelli. Carenze di biotina o vitamina B7, in particolare, possono portare alla caduta dei capelli. Secondo una recensione del 2019, i ricercatori hanno esaminato 18 studi su persone con carenza di biotina. In otto di questi studi, l'integrazione della vitamina biotina ha combattuto la maggior parte dei sintomi di perdita di capelli.

La biotina è una vitamina del complesso B ed è importante per la crescita dei capelli. Mentre la ricerca mostra che una carenza di biotina è una delle cause della perdita di capelli, l'attuale relazione tra biotina e crescita dei capelli è ancora un po 'un mistero. Le vitamine del gruppo B sono ben note per aiutare a creare i globuli rossi, che svolgono un ruolo importante nella crescita dei capelli perché trasportano ossigeno e sostanze nutritive al cuoio capelluto e ai follicoli piliferi.

L'uso e il consumo di alimenti ricchi di biotina per la crescita dei capelli inverte i danni causati da acconciature, acqua clorata e sole. Il consumo regolare di compresse di vitamine della biotina per la crescita dei capelli provoca anche capelli voluminosi e lucenti.

La biotina si trova naturalmente in molti alimenti, tra cui: spinaci, cereali integrali, broccoli, mandorle, patate dolci, cavolfiore, funghi, formaggio, arachidi, noci, carne, frutti di mare, tuorli d'uovo, cereali, latte, sardine, avocado, lamponi, banane, mandorle e verdure a foglia verde scure.

Vitamina C

La vitamina C è una vitamina per la crescita dei capelli che crea una proteina chiamata collagene che è parte integrante della struttura dei capelli poiché produce antiossidanti e combatte i radicali liberi. Inoltre, la vitamina C previene l'invecchiamento dei capelli. La vitamina C aiuta anche il corpo ad assorbire il ferro, un minerale essenziale per la crescita dei capelli. Alcuni dei benefici positivi della vitamina C è che agisce come antiossidante e previene i danni dei radicali liberi. Lo stress da radicali liberi colpisce le cellule del follicolo pilifero, l'invecchiamento precoce e il conseguente danno (inclusa la caduta dei capelli) possono iniziare a manifestarsi con l'età.

La vitamina C è diffusa in una varietà di alimenti tra cui: cavoletti di Bruxelles, broccoli, cavolfiori, agrumi, fragole, peperoni, spinaci, cime di rapa, cavoli, pomodori, zucca invernale, guaiave, ribes nero, timo, limone e prezzemolo.

Vitamina D

La perdita dei capelli è collegata a carenze di vitamine legate alla crescita come la vitamina D. Nel 2019, una recensione ha trovato un legame tra la mancanza di vitamina D nel corpo e l'alopecia. L'alopecia, un nome scientifico per la perdita di capelli, è una condizione che può portare a una grave perdita di capelli e i sondaggi condotti nella revisione del 2019 hanno mostrato che le persone con alopecia areata avevano livelli più bassi di vitamina D nel sangue.

Tuttavia, in uno studio del 2016 sui dati del sondaggio dello studio sulla salute degli infermieri, sono stati raccolti dati di 55.929 donne negli Stati Uniti, ma i ricercatori non hanno trovato una connessione diretta tra l'assunzione totale di vitamina D e la caduta dei capelli. Oltre a ciò, c'erano meno prove che suggeriscono persino che la vitamina D può portare alla ricrescita dei capelli. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per confermare la verità sulla vitamina D per la crescita dei capelli.

Sebbene la vitamina D possa non avere collegamenti diretti con la crescita dei capelli, sicuramente previene gli effetti dei bassi livelli di vitamina D. L'Ufficio degli integratori alimentari raccomanda agli adulti di assumere 600 unità internazionali o 15 microgrammi (mcg) di vitamina D al giorno. Tuttavia, molte persone non rientrano in questo requisito. Infatti, statisticamente alcuni studi dimostrano che oltre 1 miliardo di persone in tutto il mondo ha una carenza di vitamina D, quindi assicurati di assumere la dose giornaliera di vitamina D.

Vitamina D dal sole:

Soprannominata la “vitamina del sole o del sole”, la vitamina D può creare nuovi follicoli piliferi e alcuni pensano che abbiano un ruolo nella produzione dei capelli. Il tuo corpo produce vitamina D attraverso il contatto con i raggi del sole, oppure puoi ottenerlo da pesci grassi, olio di fegato di merluzzo e alcune varietà di funghi. Tuttavia, molte persone non ricevono abbastanza vitamina D su base giornaliera.

Quindi, l'esposizione al sole può anche aiutare. Il corpo umano produce vitamina D quando entriamo in contatto diretto con i raggi del sole. Indossare la protezione solare per la protezione della pelle è fondamentale se si prevede di assumere la vitamina D in questo modo.

Vitamina D dai supplementi:

Le persone che assumono un integratore dovrebbero farlo con un pasto che contenga un buon grasso. Questo assorbirà parte della vitamina D. Sì, le vitamine sono importanti ma, alcuni minerali sono importanti anche per la crescita dei capelli, tra cui ferro, zinco e iodio. La mancanza di ferro è la carenza nutrizionale più comune in tutto il mondo e più connessa alla caduta dei capelli in numerosi studi. Quindi puoi assumere integratori di ferro anche con una dieta a base di pesce grasso.

Alcuni modi naturali per ottenere più vitamina D includono il consumo: formaggio, latte fortificato a basso contenuto di grassi, succo d'arancia, mandorla, pesce come salmone o pesce spada, olio di fegato di merluzzo, ostriche, tuorlo d'uovo, funghi, latte di soia, farina d'avena, cereali.

In tutti i casi, quando si integra con vitamina D, è necessario prestare attenzione. La vitamina D è liposolubile e si accumula nei tessuti adiposi a livelli pericolosi. L'ingestione di vitamina D in eccesso può portare a troppo calcio nel sangue, che può causare affaticamento e problemi ai reni.

Vitamina E

La vitamina E fa circolare l'ossigeno sul cuoio capelluto rafforzando i follicoli piliferi. Aspira l'umidità, evitando che il fusto del capello si asciughi e appaia opaco. Ecco perché la vitamina E è vista come una delle migliori vitamine per capelli per una crescita più rapida dei capelli. Alcune persone persino strofinano l'olio di vitamina E direttamente sulla pelle o sul cuoio capelluto, credendo che accelererà la rigenerazione cellulare, ma la scienza non lo supporta ancora.

Ma questo è ciò che la scienza supporta quando si tratta di vitamina E: in una recensione del 2019, le persone con alopecia avevano concentrazioni significativamente più basse di vitamina E nel sangue rispetto a quelle senza la condizione. I risultati di uno studio clinico del 2010 hanno anche scoperto che l'uso di integratori di tocotrienolo presenti nella vitamina E ha migliorato la salute dei capelli delle persone con alopecia. Questi integratori hanno anche contribuito a prevenire la caduta dei capelli.

Ottenere la vitamina E dagli integratori:

La vitamina E può essere acquistata in forma di capsule e come liquido.

I prodotti alimentari che contengono vitamina E includono: germe di grano, cavolo, spinaci, semi di girasole, avocado, mandorle, arachidi, nocciole, broccoli, olio di semi di girasole, olio di semi di soia, mango, kiwi, pistacchio, olive e albicocche sott'aceto

Altri rimedi per la caduta dei capelli:

Sì, le vitamine e altri nutrienti del cibo sono importanti per la salute dei capelli, ma puoi anche seguire questi cambiamenti nello stile di vita:

  • Ridurre l'uso di gel per capelli, asciugare e raddrizzare i capelli e spazzolare i capelli quando sono bagnati.
  • Ridurre lo stress impegnandosi in almeno 150 minuti di esercizio da moderato a intenso a settimana, cioè solo 30 minuti di esercizio ogni 5 giorni della settimana, secondo le raccomandazioni dell'American Heart Association (AHA). Ridurre lo stress può anche aiutare a migliorare la forza e l'aspetto dei capelli.
  • Bevi da sei a otto bicchieri d'acqua ogni giorno.
  • Guarda la tua dieta.
  • Tirare costantemente indietro i capelli per una coda di cavallo o un panino alto o usando alcune tecniche di acconciatura può aggravare l'alopecia.

Cose da considerare prima di acquistare vitamine e integratori per la crescita dei capelli:

1. Scopri le vitamine per la crescita dei capelli e cosa fanno

Le vitamine e i minerali chiave che agiscono per la crescita dei capelli sono le vitamine A, B, C, E, D, oltre a minerali e proteine ​​come acido folico, niacina, ferro, zinco, acidi grassi omega-3, tiamina, riboflavina, calcio e pochi altri.

Nel regno delle vitamine per la crescita dei capelli, molti si chiedono se dovrebbero sprecare soldi per così tante vitamine. Le persone chiedono anche: “Non posso ottenere gli stessi risultati con un multivitaminico?”

La risposta è che ci sono molti integratori per la crescita dei capelli, pillole e vitamine sul mercato. Ma i multivitaminici non sono progettati per la crescita di capelli (e unghie) in genere per includere la giusta quantità di vitamine e minerali ritenuti essenziali per i capelli sani. Tuttavia, fai attenzione ai prodotti inferiori che non fanno altro che sovraccaricarti di determinate vitamine e minerali senza fare molto per i capelli.

2. Leggi l'etichetta

È facile dire che dovremmo leggere l'etichetta di tutto ciò che acquistiamo, ma in realtà è un'altra cosa farlo quando si è di fretta. Fai del tuo meglio per leggere l'etichetta di qualsiasi integratore per la crescita dei capelli prima di acquistare. Per uno, potrebbe esserci un ingrediente a cui sei allergico o che altrimenti non ti fa bene. Dovresti evitare integratori non naturali o prodotti chimicamente. Anche le fonti organiche e gli integratori a base vegetale sono buoni, perché le cellule li assorbono più facilmente.

3. Leggi anche gli ingredienti

Dopo aver letto l'etichetta, sapere quali ingredienti sono buoni per te. Abbiamo già discusso importanti vitamine per la crescita dei capelli, ma dovresti anche cercare estratti come biotina, bacche di palmetto, neem, olio di ricino, gambo e foglia di bambù, olio di semi di lino, olio di borragine, alghe e altri. Non che questi ingredienti debbano essere presenti in ogni bottiglia esaminata, ma sappi solo che sono utili per la crescita dei capelli. Una grande proteina presente nei capelli è la cheratina che è ottima per la crescita dei capelli.

4. Parla con il tuo medico

Alcune carenze nutrizionali sono comuni, come ferro, calcio, vitamina A, vitamina B12, magnesio, quindi consulta il tuo medico per scoprire se potresti averne uno. Inoltre, può fornirti utili informazioni sulla caduta dei capelli. Ad esempio, quando stavo perdendo i capelli come un cane, il mio dermatologo mi ha chiesto se avevo la febbre virale? Quando ho detto di sì, mi ha immediatamente assicurato che la mia perdita di capelli era il risultato della ricostruzione del mio corpo. Sono cresciuto di nuovo capelli lunghi e spessi in 4 mesi.

5. Costo

Costoso non significa necessariamente meglio per qualsiasi prodotto, compresi gli integratori per la crescita dei capelli. L'importante è trovare un integratore che funzioni e si adatti al tuo budget.

6. Leggi le recensioni, sia buone che cattive

Quindi, se non sai già che ci sono molte persone che rivendicano grandi cose su un prodotto, ma è solo perché vengono pagate per farlo. Ecco perché è importante leggere anche quelli negativi. Dopo aver letto una recensione, hai una buona idea di quali prodotti producono risultati e quali persone usano da un po 'di tempo.

Pensieri finali

La caduta dei capelli può o meno essere grave. Se si verificano capelli che cadono a chiazze, può essere un segno di una condizione di salute di base come la psoriasi, la dermatite e il cancro della pelle, l'alopecia areata, lo stress e alcuni trattamenti medici. D'altra parte, potrebbe essere la mancanza di un buon cibo ricco di vitamine equilibrato. Quindi, se sei preoccupato per la perdita dei capelli, visita un dermatologo per determinare cosa sta causando i loro problemi di crescita dei capelli.

Inoltre, tieni presente che il taglio regolare dei capelli può mantenerlo sano. Il taglio dei capelli elimina le doppie punte e alleggerisce il peso dei capelli, riducendo così l'impatto sulle radici, che crescono dal cuoio capelluto. Quindi, un cuoio capelluto sano è fondamentale per la crescita dei capelli sani.

Alla fine, due fattori tendono ad influenzare la maggior parte dei casi di caduta dei capelli: ormoni e genetica. Anche se acquisti le migliori vitamine per capelli per una crescita più rapida dei capelli, non puoi superare la genetica e i tuoi ormoni. Ma queste vitamine sono state studiate per promuovere la crescita dei capelli in coloro che sono carenti.

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The following is a discussion and analysis of the financial condition of
AbbVie Inc. (AbbVie or the company) as of December 31, 2019 and 2018 and results
of operations for each of the three years in the period ended December 31, 2019.
This commentary should be read in conjunction with the consolidated financial
statements and accompanying notes appearing in Item 8, "Financial Statements and
Supplementary Data."
EXECUTIVE OVERVIEW
Company Overview
AbbVie is a global, research-based biopharmaceutical company formed in 2013
following separation from Abbott Laboratories (Abbott). AbbVie uses its
expertise, dedicated people and unique approach to innovation to develop and
market advanced therapies that address some of the world's most complex and
serious diseases. AbbVie's products are focused on treating conditions such as
chronic autoimmune diseases in rheumatology, gastroenterology and dermatology;
oncology, including blood cancers; virology, including hepatitis C virus (HCV)
and human immunodeficiency virus (HIV); neurological disorders, such as
Parkinson's disease; metabolic diseases, including thyroid disease and
complications associated with cystic fibrosis; pain associated with
endometriosis; as well as other serious health conditions. AbbVie also has a
pipeline of promising new medicines in clinical development across such
important medical specialties as immunology, oncology and neuroscience, with
additional targeted investment in cystic fibrosis and women's health.
AbbVie's products are generally sold worldwide directly to wholesalers,
distributors, government agencies, health care facilities, specialty pharmacies
and independent retailers from AbbVie-owned distribution centers and public
warehouses. In the United States, AbbVie distributes pharmaceutical products
principally through independent wholesale distributors, with some sales directly
to pharmacies and patients. Outside the United States, AbbVie sells products
primarily to customers or through distributors, depending on the market served.
Certain products are co-marketed or co-promoted with other companies. AbbVie has
approximately 30,000 employees. AbbVie operates in one business
segment-pharmaceutical products.
On June 25, 2019, AbbVie announced that it entered into a definitive transaction
agreement under which AbbVie will acquire Allergan plc (Allergan). See Note 5 to
the Consolidated Financial Statements for additional information regarding the
proposed acquisition.
2019 Financial Results
AbbVie's strategy has focused on delivering strong financial results, advancing
and investing in its pipeline and returning value to shareholders while ensuring
a strong, sustainable growth business over the long term. The company's
financial performance in 2019 included delivering worldwide net revenues of
$33.3 billion, operating earnings of $13.0 billion, diluted earnings per share
of $5.28 and cash flows from operations of $13.3 billion. Worldwide net revenues
grew by 3% on a constant currency basis, primarily driven by revenue growth
related to IMBRUVICA and VENCLEXTA as well as the continued strength of HUMIRA
in the U.S. and newly launched immunology assets SKYRIZI and RINVOQ, offset by
international HUMIRA biosimilar competition.
Diluted earnings per share in 2019 was $5.28 and included the following
after-tax costs: (i) $3.2 billion for the change in fair value of contingent
consideration liabilities; (ii) $1.3 billion related to the amortization of
intangible assets; (iii) a Stemcentrx-related impairment charge of $823 million
net of the related fair value adjustment to contingent consideration
liabilities; (iv) $364 million for acquired in-process research and development
(IPR&D); and (v) $338 million of expenses related to the proposed Allergan
acquisition. These costs were partially offset by the following after-tax
benefits: (i) $414 million from litigation matters primarily due to the
settlement of an intellectual property dispute with a third party; (ii)
$400 million due to the favorable resolution of various tax positions; and (iii)
$297 million from an amended and restated license agreement between AbbVie and
Reata Pharmaceuticals, Inc. (Reata). Additionally, financial results reflected
continued funding to support all stages of AbbVie's emerging pipeline assets and
continued investment in AbbVie's on-market brands.
In November 2019, AbbVie's board of directors declared a quarterly cash dividend
of $1.18 per share of common stock payable in February 2020. This reflects an
increase of approximately 10.3% over the previous quarterly dividend of $1.07
per share of common stock.

26 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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2020 Strategic Objectives
AbbVie's mission is to be an innovation-driven, patient-focused specialty
biopharmaceutical company capable of achieving top-tier financial performance
through outstanding execution and a consistent stream of innovative new
medicines. AbbVie intends to continue to advance its mission in a number of
ways, including: (i) growing revenues by diversifying revenue streams, ensuring
strong commercial execution of new product launches and driving late-stage
pipeline assets to the market; (ii) continuing to invest and expand its pipeline
in support of opportunities in immunology, oncology and neuroscience, with
additional targeted investment in cystic fibrosis and women's health as well as
continued investment in key on-market products; (iii) expanding operating
margins; and (iv) returning cash to shareholders via a strong and growing
dividend while also reducing incremental debt. In addition, AbbVie anticipates
several regulatory submissions and key data readouts from key clinical trials in
the next 12 months.
AbbVie expects to achieve its strategic objectives through:
• Completion and successful integration of the proposed Allergan acquisition.


• Crescita dei ricavi dell'oncologia ematologica sia da IMBRUVICA che da VENCLEXTA.

• Crescita dei ricavi dell'immunologia guidata da lanci commerciali di successo

SKYRIZI e RINVOQ, nonché HUMIRA NOI. crescita delle vendite.

• Gestione efficace dell'erosione biosimilare internazionale HUMIRA.


•         The favorable impact of pipeline products and indications recently
          approved or currently under regulatory review where approval is
          expected in 2020. These products are described in greater detail in the
          section labeled "Research and Development" included as part of this
          Item 7.


AbbVie remains committed to driving continued expansion of operating margins and
expects to achieve this objective through continued leverage from revenue
growth, productivity initiatives in supply chain and ongoing efficiency programs
to optimize manufacturing, commercial infrastructure, administrative costs and
general corporate expenses.
The combination of AbbVie and Allergan will create a diverse entity with
leadership positions across immunology, hematologic oncology, aesthetics,
neuroscience, women's health, eye care and virology. AbbVie's existing product
portfolio and pipeline will be enhanced with numerous Allergan assets and
Allergan's product portfolio will benefit from AbbVie's commercial strength,
expertise and international infrastructure.
Research and Development
Research and innovation are the cornerstones of AbbVie's business as a global
biopharmaceutical company. AbbVie's long-term success depends to a great extent
on its ability to continue to discover and develop innovative pharmaceutical
products and acquire or collaborate on compounds currently in development by
other biotechnology or pharmaceutical companies.
AbbVie's pipeline currently includes approximately 60 compounds or indications
in clinical development individually or under collaboration or license
agreements and is focused on such important medical specialties as immunology,
oncology and neuroscience along with targeted investments in cystic fibrosis and
women's health. Of these programs, approximately 30 are in mid- and late-stage
development.
The following sections summarize transitions of significant programs from
Phase 2 development to Phase 3 development as well as developments in
significant Phase 3 and registration programs. AbbVie expects multiple Phase 2
programs to transition into Phase 3 programs in the next 12 months.
Significant Programs and Developments
Immunology
RINVOQ
•         In February 2019, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) accepted

per revisione prioritaria New Drug Application (NDA) di AbbVie per

upadacitinib, un inibitore selettivo del JAK1 orale sperimentale, per la

          treatment of adult patients with moderate to severe rheumatoid
          arthritis (RA).

• Nel Febbraio 2019, AbbVie ha avviato uno studio clinico di fase 3 per valutare

          the efficacy and safety of upadacitinib in subjects with giant cell
          arteritis.



    2019 Form 10-K  | ((Image Removed: abbvieimage2a14.gif))  27



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•         In August 2019, the FDA approved RINVOQ (upadacitinib) for the
          treatment of adults with moderately to severely active RA who have had
          an inadequate response or intolerance to methotrexate.

• Nel Ottobre 2019, AbbVie ha annunciato i migliori risultati della sua prima fase

3 studi clinici su RINVOQ in pazienti adulti con psoriasica attiva

artrite (PsA). Risultati dello studio SELECT-PsA 2, che ha valutato

RINVOQ rispetto al placebo in pazienti che non hanno risposto adeguatamente

il trattamento con uno o più DMARD biologici ha mostrato che entrambe le dosi di

RINVOQ (15 mg e 30 mg) ha raggiunto gli endpoint primari e secondari chiave a

          week 12. The safety profile was consistent with that of previous
          studies across indications, with no new safety risks detected.


•         In November 2019, AbbVie announced data from the Phase 2/3
          SELECT-AXIS 1 trial in which twice as many adult patients with
          ankylosing spondylitis treated with RINVOQ achieved the primary

endpoint alla settimana 14 rispetto al placebo. Il profilo di sicurezza era coerente

          with that of previous studies across indications, with no new safety
          risks detected.

• Nel Novembre 2019, AbbVie ha avviato uno studio clinico di fase 3 per valutare

          the efficacy and safety of RINVOQ in adult patients with axial
          spondyloarthritis.

• Nel Dicembre 2019, il Commissione europea (CE) ha concesso la commercializzazione

          authorization for RINVOQ for the treatment of adult patients with
          moderate to severe active rheumatoid arthritis who have had an
          inadequate response or intolerance to one or more DMARDs.

• Nel Febbraio 2020, AbbVie ha annunciato i migliori risultati dalla sua seconda

Studio clinico di fase 3 di RINVOQ in pazienti adulti con PsA attiva.

Risultati dello studio SELECT-PsA 1, che ha valutato RINVOQ rispetto a

          placebo in patients who did not adequately respond to treatment with
          one or more non-biologic DMARDs, showed that both doses of RINVOQ (15

mg e 30 mg) hanno soddisfatto gli endpoint primari e secondari chiave. La sicurezza

profilo era coerente con quello di studi precedenti in tutto

indicazioni, senza che siano stati rilevati nuovi rischi per la sicurezza.

SKYRIZI

• Nel Marzo 2019, AbbVie ha avviato due studi clinici di fase 3 per valutare

l'efficacia e la sicurezza di risankizumab, uno studio sperimentale

inibitore dell'interleuchina-23 (IL-23), in soggetti con artrite psoriasica.


•         In April 2019, the FDA approved SKYRIZI (risankizumab) for the
          treatment of moderate to severe plaque psoriasis in adults who are
          candidates for systemic therapy or phototherapy.

• Nel Aprile 2019, la CE ha rilasciato l'autorizzazione all'immissione in commercio per SKYRIZI per

il trattamento della psoriasi a placche da moderata a grave nei pazienti adulti

che sono candidati per la terapia sistemica.

Oncologia

IMBRUVICA

• Nel Gennaio 2019, approvato dalla FDA IMBRUVICA, in combinazione con GAZYVA

          (obinutuzumab), for adult patients with previously untreated chronic
          lymphocytic leukemia (CLL)/small lymphocytic lymphoma (SLL).


•         In June 2019, AbbVie announced results from the Phase 3 CLL12 trial,
          evaluating IMBRUVICA in patients with previously untreated CLL, which
          demonstrated that IMBRUVICA significantly improved event- and
          progression-free survival.

• Nel Novembre 2019, AbbVie ha presentato una nuova domanda di droga supplementare

          (sNDA) to the FDA for IMBRUVICA in combination with rituximab for the
          first-line treatment of younger patients with CLL or SLL.

VENCLEXTA

• Nel Marzo 2019, AbbVie ha annunciato che la FDA ha posto una clinica parziale

          hold on all clinical trials evaluating VENCLEXTA for the
          investigational treatment of multiple myeloma (MM). The partial
          clinical hold followed a review of data from the ongoing Phase 3
          BELLINI trial, a study in relapsed/refractory MM, in which a higher
          proportion of deaths was observed in the VENCLEXTA arm compared to the
          control arm of the trial. In June 2019, AbbVie announced that the FDA
          lifted the partial clinical hold placed on the Phase 3 CANOVA trial,
          evaluating VENCLEXTA for the investigational treatment of
          relapsed/refractory MM positive for the translocation (11;14)
          abnormality, based upon agreement on revisions to the CANOVA study

protocollo, comprese le nuove misure di mitigazione del rischio, specificato dal protocollo

          guidelines and updated futility criteria. This action does not impact
          any of the approved indications for VENCLEXTA, such as CLL or acute
          myeloid leukemia (AML).



28  ((Image Removed: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Form 10-K


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• Nel Maggio 2019, il VENCLEXTA approvato dalla FDA, in combinazione con

obinutuzumab, per pazienti adulti con CLL / SLL non precedentemente trattati. Il

l'approvazione si basava sui dati dello studio di fase 3 CLL14, valutando il

efficacia e sicurezza di VENCLEXTA più obinutuzumab rispetto a obinutuzumab

          plus chlorambucil in previously untreated patients with CLL, which
          demonstrated that VENCLEXTA plus obinutuzumab prolonged
          progression-free survival and achieved higher rates of complete

risposta e minima negatività residua della malattia rispetto al comune

standard di cura usato obinutuzumab più clorambucile.

• Nel Gennaio 2020, AbbVie ha annunciato che il comitato per i medicinali

          Products for Human Use (CHMP) of the European Medicines Agency (EMA)
          granted a positive opinion for VENCLYXTO in combination with
          obinutuzumab for patients with previously untreated CLL.

Depatux-M

• Nel Maggio 2019, AbbVie ha annunciato la decisione di interrompere la Fase 3

Studio INTELLANCE-1 sulla depatuxizumab mafodotin (Depatux-M, precedentemente

noto come ABT-414) in pazienti con glioblastoma di nuova diagnosi, di cui

i tumori hanno amplificazione dell'EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico), a

          an interim analysis. An Independent Data Monitoring Committee
          recommended stopping enrollment in INTELLANCE-1 due to lack of survival
          benefit for patients receiving Depatux-M compared with placebo when

aggiunto al regime standard di radiazioni e temozolomide. Iscrizione

è stato sospeso in tutti gli studi Depatux-M in corso.

Veliparib

• Nel Luglio 2019, AbbVie ha annunciato che i risultati di punta della Fase 3

Studio BROCADE3 che valuta veliparib, un poli orale sperimentale

(adenosina difosfato-ribosio) inibitore della polimerasi (PARP), in

la combinazione con carboplatino e paclitaxel ha raggiunto il suo endpoint primario di

          progression-free survival in patients with HER2 negative germline
          BRCA-mutated advanced breast cancer.

• Nel Luglio 2019, AbbVie ha annunciato che i risultati di punta della Fase 3

Studio VELIA, condotto in collaborazione con il GOG Foundation, Inc.,

valutazione di veliparib con carboplatino e paclitaxel seguiti da

la terapia di mantenimento con veliparib ha raggiunto il suo endpoint primario di

sopravvivenza libera da progressione in pazienti con ovaia di nuova diagnosi

cancro, indipendentemente dallo stato dei biomarcatori.

Rova-T

• Nel Agosto 2019, AbbVie ha annunciato la decisione di chiudere il MERU

prova, uno studio di Fase 3 che valuta rovalpituzumab tesirina (Rova-T) come a

terapia di mantenimento di prima linea per carcinoma polmonare avanzato a piccole cellule

(SCLC). Si raccomanda un comitato indipendente di monitoraggio dei dati

la conclusione dello studio dopo che i risultati non hanno dimostrato alcun beneficio in termini di sopravvivenza a

          a pre-planned interim analysis for patients receiving Rova-T as
          compared with placebo. With the closing of the MERU trial, AbbVie
          announced the termination of the Rova-T research and development
          program.


Virology/Liver Disease
•         In August 2019, the EC granted marketing authorization for MAVIRET
          (glecaprevir/pibrentasvir) to shorten the once-daily treatment duration
          from 12 to 8 weeks in treatment-naïve, compensated cirrhotic, chronic
          HCV patients with genotype (GT)1, 2, 4, 5 and 6 infection.

• Nel Settembre 2019, il MAVYRET approvato dalla FDA (glecaprevir / pibrentasvir)

ridurre la durata del trattamento una volta al giorno da 12 a 8 settimane in

pazienti con cirrosi, HCV cronici, naïve al trattamento, compensati in tutto

genotipi (GT1-6).

• Nel Gennaio 2020, AbbVie ha annunciato che il CHMP dell'EMA ha

ha raccomandato una modifica dell'autorizzazione all'immissione in commercio per MAVIRET a

ridurre la durata del trattamento una volta al giorno da 12 a 8 settimane in

pazienti con HCV cronica, cirrotica, compensata, naïve al trattamento con GT 3

          infection.


Neuroscienza

• Nel Maggio 2019, AbbVie ha avviato uno studio clinico di Fase 3 per valutare la

sicurezza e tollerabilità di ABBV-951, una levodopa / carbidopa sottocutanea

          delivery system, in subjects with Parkinson's disease.


•         In July 2019, AbbVie announced the decision to discontinue the Phase 2

Studio ARISE che ha valutato ABBV-8E12, un anticorpo sperimentale anti-tau,

          in patients with progressive supranuclear palsy, after an Independent
          Data



    2019 Form 10-K  | ((Image Removed: abbvieimage2a14.gif))  29


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Monitoring Committee recommended stopping the trial for futility after the trial
showed that ABBV-8E12 did not provide efficacy.
Other
•         In July 2019, AbbVie submitted an NDA to the FDA for elagolix in
          combination with estradiol/norethindrone acetate (E2/NETA) daily
          add-back therapy for the management of heavy menstrual bleeding
          associated with uterine fibroids.


RESULTS OF OPERATIONS
Net Revenues
The comparisons presented at constant currency rates reflect comparative local
currency net revenues at the prior year's foreign exchange rates. This measure
provides information on the change in net revenues assuming that foreign
currency exchange rates had not changed between the prior and the current
periods. AbbVie believes that the non-GAAP measure of change in net revenues at
constant currency rates, when used in conjunction with the GAAP measure of
change in net revenues at actual currency rates, may provide a more complete
understanding of the company's operations and can facilitate analysis of the
company's results of operations, particularly in evaluating performance from one
period to another.
                                                                                        Percent change
                                                                  At actual currency rates        At constant currency rates
years ended (dollars in
millions)                   2019         2018         2017           2019             2018           2019             2018
United States            $ 23,907$ 21,524$ 18,251           11.1  %          17.9 %         11.1  %          17.9 %
International               9,359       11,229        9,965          (16.7 )%          12.8 %        (13.6 )%          10.4 %
Net revenues             $ 33,266$ 32,753$ 28,216            1.6  %          16.1 %          2.6  %          15.2 %




30 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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La tabella seguente descrive i ricavi netti mondiali di AbbVie:

                                                                                                   Percent change
                                                                             At actual currency rates        At constant currency rates
years ended December 31 (dollars
in millions)                           2019         2018         2017          2019             2018            2019             2018
Immunology
HUMIRA          United States       $ 14,864$ 13,685$ 12,361           8.6  %          10.7  %          8.6  %           10.7  %
                International          4,305        6,251        6,066         (31.1 )%           3.1  %        (27.8 )%            0.6  %
                Total               $ 19,169$ 19,936$ 18,427          (3.9 )%           8.2  %         (2.9 )%            7.4  %
SKYRIZI         United States       $    311     $      -     $      -           n/m              n/m             n/m               n/m
                International             44            -            -           n/m              n/m             n/m               n/m
                Total               $    355     $      -     $      -           n/m              n/m             n/m               n/m
RINVOQ          United States       $     47     $      -     $      -           n/m              n/m             n/m               n/m
                International              -            -            -           n/m              n/m             n/m               n/m
                Total               $     47     $      -     $      -           n/m              n/m             n/m               n/m
Hematologic Oncology
IMBRUVICA       United States       $  3,830$  2,968$  2,144          29.1  %          38.4  %         29.1  %           38.4  %
                Collaboration
                revenues                 844          622          429          35.8  %          45.0  %         35.8  %           45.0  %
                Total               $  4,674$  3,590$  2,573          30.2  %          39.5  %         30.2  %           39.5  %
VENCLEXTA       United States       $    521$    247$     89       >100.0%          >100.0%         >100.0%           >100.0%
                International            271           97           33       >100.0%          >100.0%         >100.0%           >100.0%
                Total               $    792$    344$    122       >100.0%          >100.0%         >100.0%           >100.0%
HCV
MAVYRET         United States       $  1,473$  1,614$    277          (8.8 )%       >100.0%            (8.8 )%        >100.0%
                International          1,420        1,824          213         (22.1 )%       >100.0%           (19.6 )%        >100.0%
                Total               $  2,893$  3,438$    490         (15.9 )%       >100.0%           (14.6 )%        >100.0%
VIEKIRA         United States       $      -     $      3$     61        (100.0 )%         (96.7 )%       (100.0 )%          (96.7 )%
                International             36          175          723         (79.2 )%         (75.6 )%        (77.2 )%          (74.8 )%
                Total               $     36$    178$    784         (79.6 )%         (77.2 )%        (77.6 )%          (76.5 )%
Other Key Products
Creon           United States       $  1,041$    928$    831          12.2  %          11.7  %         12.2  %           11.7  %
Lupron          United States       $    720$    726$    669          (0.8 )%           8.6  %         (0.8 )%            8.6  %
                International            167          166          160           0.8  %           3.4  %          6.0  %            4.7  %
                Total               $    887$    892$    829          (0.5 )%           7.6  %          0.5  %            7.9  %
Synthroid       United States       $    786$    776$    781           1.3  %          (0.6 )%          1.3  %           (0.6 )%
Synagis         International       $    718$    726$    738          (1.2 )%          (1.6 )%          0.9  %           (2.8 )%
Duodopa         United States       $     97$     80$     61          20.4  %          31.4  %         20.4  %           31.4  %
                International            364          350          294           4.2  %          19.1  %          9.8  %           14.8  %
                Total               $    461$    430$    355           7.2  %          21.2  %         11.7  %           17.7  %
Sevoflurane     United States       $     74$     74$     78           2.0  %          (6.2 )%          2.0  %           (6.2 )%
                International            274          317          332         (13.8 )%          (4.4 )%         (9.5 )%           (4.3 )%
                Total               $    348$    391$    410         (10.9 )%          (4.7 )%         (7.4 )%           (4.6 )%
Kaletra         United States       $     38$     55$     71         (31.0 )%         (22.1 )%        (31.0 )%          (22.1 )%
                International            245          281          352         (12.9 )%         (20.2 )%         (9.5 )%          (20.1 )%
                Total               $    283$    336$    423         (15.8 )%         (20.5 )%        (12.9 )%          (20.4 )%
AndroGel        United States       $    172$    469$    577         (63.3 )%         (18.8 )%        (63.3 )%          (18.8 )%
ORILISSA        United States       $     91$     11     $      -       >100.0%              n/m         >100.0%               n/m
                International              2            -            -           n/m              n/m             n/m               n/m
                Total               $     93$     11     $      -       >100.0%              n/m         >100.0%               n/m
All other                           $    511$    308$    876          66.1  %         (64.9 )%         73.0  %          (73.2 )%
Total net revenues                  $ 33,266$ 32,753$ 28,216           1.6  %          16.1  %          2.6  %           15.2  %



n / m – Non significativo

2019 Modulo 10-K | ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) 31

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The following discussion and analysis of AbbVie's net revenues by product is
presented on a constant currency basis.
Global HUMIRA sales decreased 3% in 2019 and increased 7% in 2018. The sales
decrease in 2019 was primarily driven by direct biosimilar competition in
certain international markets, partially offset by market growth across
therapeutic categories. The sales increase in 2018 was primarily driven by
market growth across therapeutic categories and geographies as well as favorable
pricing in certain geographies. In the United States, HUMIRA sales increased 9%
in 2019 and 11% in 2018. The sales increases in 2019 and 2018 were primarily
driven by market growth across all indications and favorable pricing.
Internationally, HUMIRA revenues decreased 28% in 2019 and increased 1% in 2018.
The sales decrease in 2019 was primarily driven by direct biosimilar competition
in Europe following the expiration of the European Union composition of matter
patent for adalimumab in October 2018. The sales increase in 2018 was primarily
driven by market growth across indications partially offset by direct biosimilar
competition. Biosimilar competition for HUMIRA is not expected in the United
States until 2023. AbbVie continues to pursue strategies intended to further
differentiate HUMIRA from competing products and add to the sustainability of
HUMIRA.
Net revenues for SKYRIZI were $355 million in 2019 following the April 2019
regulatory approvals for the treatment of moderate to severe plaque psoriasis.
Net revenues for RINVOQ were $47 million in 2019 following the August 2019 FDA
approval for the treatment of moderate to severe rheumatoid arthritis.
Net revenues for IMBRUVICA represent product revenues in the United States and
collaboration revenues outside of the United States related to AbbVie's 50%
share of IMBRUVICA profit. AbbVie's global IMBRUVICA revenues increased 30% in
2019 and 39% in 2018 as a result of continued penetration of IMBRUVICA for
patients with CLL as well as favorable pricing.
Net revenues for VENCLEXTA increased by more than 100% in 2019 and 2018
primarily due to market share gains following additional regulatory approvals of
VENCLEXTA for the treatment of patients with relapsed/refractory CLL and
first-line AML in 2018 and first-line CLL in 2019.
Global MAVYRET sales decreased by 15% in 2019 primarily driven by lower patient
volumes in certain international markets and competitive dynamics in the U.S.
Global MAVYRET sales increased more than 100% in 2018 as a result of market
share gains following the FDA and EMA approvals of MAVYRET in the second half of
2017 as well as further geographic expansion. Global VIEKIRA sales decreased by
78% in 2019 and 76% in 2018 primarily due to lower market share following the
launch of MAVYRET.
Net revenues for Creon increased 12% in 2019 and 12% in 2018, primarily driven
by continued market growth and favorable pricing. Creon maintains market
leadership in the pancreatic enzyme market.
Net revenues for Duodopa increased 12% in 2019 and 18% in 2018, primarily driven
by increased market penetration.
Gross Margin
                                                                                 Percent change
years ended December 31 (dollars
in millions)                        2019          2018          2017           2019            2018
Gross margin                     $  25,827$  25,035$  21,174            3 %             18 %
as a percent of net revenues            78 %          76 %          75 %


Gross margin as a percentage of net revenues in 2019 increased from 2018
primarily due to the full year effect of the expiration of HUMIRA royalties,
partially offset by the IMBRUVICA profit sharing arrangement and unfavorable
impact from higher intangible asset amortization.
Gross margin as a percentage of net revenues in 2018 increased from 2017
primarily due to the expiration of HUMIRA royalties and a 2017 intangible asset
impairment charge of $354 million partially offset by the IMBRUVICA profit
sharing arrangement.

32 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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Vendita, generale e amministrativa

                                                                                 Percent change
years ended December 31 (dollars
in millions)                        2019          2018          2017           2019            2018
Selling, general and
administrative                   $   6,942$   7,399$   6,295           (6 )%            18 %
as a percent of net revenues            21 %          23 %          22 %


Selling, general and administrative (SG&A) expenses as a percentage of net
revenues in 2019 decreased from 2018 primarily due to the favorable impacts of
international HUMIRA expense reductions and lower litigation reserve charges
that decreased by $326 million. This favorability was partially offset by new
product launch expenses, higher restructuring charges and $103 million of
transaction expenses associated with the proposed Allergan transaction.
Additionally, SG&A expenses in 2018 included non-recurring philanthropic
contributions of $350 million to certain U.S. not-for-profit organizations.
SG&A expenses as a percentage of net revenues in 2018 increased from 2017
primarily due to new product launch expenses and non-recurring philanthropic
contributions to certain U.S. not-for-profit organizations partially offset by
continued leverage from revenue growth.
Research and Development and Acquired In-Process Research and Development
                                                                                Percent change
years ended December 31 (dollars
in millions)                        2019          2018          2017           2019          2018
Research and development         $   6,407$  10,329$   5,007          (38 )%       >100%
as a percent of net revenues            19 %          32 %          18 %
Acquired in-process research and
development                      $     385$     424$     327

(9)% 30%



Research and Development (R&D) expenses decreased in 2019 and increased in 2018
principally due to impairment charges related to IPR&D acquired as part of the
2016 Stemcentrx acquisition. In 2019, the company recorded a $1.0 billion
intangible asset impairment charge which represented the remaining value of the
IPR&D acquired following the decision to terminate the Rova-T R&D program. In
2018, the company recorded a $5.1 billion intangible asset impairment charge
following the decision to stop enrollment in the TAHOE trial, which lowered the
probabilities of success of achieving regulatory approval across Rova-T and
other early-stage assets obtained in the acquisition. See Note 7 to the
Consolidated Financial Statements for additional information regarding these
impairment charges.
Acquired IPR&D expenses reflect upfront payments related to various
collaborations. There were no individually significant transactions or cash
flows during 2019 or 2018. Acquired IPR&D expense in 2017 included a charge of
$205 million as a result of entering into a global strategic collaboration with
Alector, Inc. (Alector) to develop and commercialize medicines to treat
Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. See Note 5 to the
Consolidated Financial Statements for additional information regarding the
Alector agreement.
Other Operating Expenses and Income
Other operating income in 2019 included $550 million of income from a legal
settlement related to an intellectual property dispute with a third party and
$330 million of income related to an amended and restated license agreement
between AbbVie and Reata. See Note 5 to the Consolidated Financial Statements
for additional information on the Reata agreement.
Other operating expenses in 2018 included a $500 million charge related to the
extension of the previously announced Calico collaboration to discover, develop
and bring to market new therapies for patients with age-related diseases,
including neurodegeneration and cancer. See Note 5 to the Consolidated Financial
Statements for additional information regarding the Calico agreement.

2019 Modulo 10-K | ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) 33

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Other Non-Operating Expenses
years ended December 31 (in millions)     2019        2018        2017
Interest expense                        $ 1,784$ 1,348$ 1,150
Interest income                            (275 )      (204 )      (146 )
Interest expense, net                   $ 1,509$ 1,144$ 1,004

Net foreign exchange loss               $    42$    24$   348
Other expense, net                        3,006          18         466


Interest expense in 2019 increased compared to 2018 primarily due to $363
million of incremental interest and debt issuance costs associated with
financing the proposed acquisition of Allergan, as well as the unfavorable
impact of higher interest rates on the company's debt obligations. Interest
expense in 2018 increased compared to 2017 primarily due to the unfavorable
impact of higher interest rates on the company's debt obligations and a higher
average outstanding debt balance during 2018.
Interest income in 2019 increased compared to 2018 primarily due to a higher
average cash and cash equivalents balance during 2019, partially offset by
decreased investments in debt securities. Interest income in 2018 increased
compared to 2017 primarily due to higher interest rates.
Net foreign exchange loss in 2017 included $316 million of historical currency
translation losses that were reclassified from accumulated other comprehensive
income (AOCI) related to the liquidation of certain foreign entities following
the enactment of U.S. tax reform.
Other expense, net included charges related to the change in fair value of the
contingent consideration liabilities of $3.1 billion in 2019, $49 million in
2018 and $626 million in 2017. The fair value of contingent consideration
liabilities is impacted by the passage of time and multiple other inputs,
including the probability of success of achieving regulatory/commercial
milestones, discount rates, the estimated amount of future sales of the acquired
products still in development and other market-based factors. In 2019, the
Boehringer Ingelheim (BI) contingent consideration liability increased due to
higher probabilities of success, higher estimated future sales, declining
interest rates and passage of time. The higher probabilities of success
primarily resulted from the April 2019 regulatory approvals of SKYRIZI for the
treatment of moderate to severe plaque psoriasis. These changes were partially
offset by a $91 million decrease in the Stemcentrx contingent consideration
liability due to the termination of the Rova-T R&D program during the third
quarter of 2019. In 2018, the BI contingent consideration liability increased
due to the passage of time and higher estimated future sales partially offset by
the effect of rising interest rates. This increase in the BI contingent
consideration liability was primarily offset by a $428 million decrease in the
Stemcentrx contingent consideration liability recorded during the fourth quarter
of 2018 due to a reduction in probabilities of success of achieving regulatory
approval across Rova-T and other early-stage Stemcentrx assets. In 2017, the
change in fair value represented mainly higher probabilities of success, the
passage of time and declining interest rates. Other expense, net for 2017 also
included realized gains on available-for-sale investment securities of $90
million.
Income Tax Expense
The effective income tax rate was 6% in 2019, negative 9% in 2018 and 31% in
2017. The effective tax rate in each period differed from the statutory tax rate
principally due to the allocation of the company's taxable earnings among
jurisdictions, the benefit from foreign operations which reflects the impact of
lower income tax rates in locations outside the United States, tax incentives in
Puerto Rico and other foreign tax jurisdictions and business development
activities. The increase in the effective tax rate for 2019 over the prior year
was principally due to the timing of provisions of the Tax Cuts and Jobs Act
(the Act) related to the earnings from certain foreign subsidiaries. The
increase is also attributable to changes in the jurisdictional mix of earnings,
including a change in fair value of contingent consideration liabilities. These
increases were partially offset by the favorable resolution of various tax
positions in the current year.
The effective tax rate for 2018 also included the effects of Stemcentrx
intangible impairment related expenses.
The effective tax rate in 2017 included tax expense of $4.5 billion on the
one-time mandatory repatriation of previously untaxed earnings of foreign
subsidiaries, partially offset by a $3.6 billion net tax benefit for the
remeasurement of deferred taxes related to the Act and foreign tax law changes.

34 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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The Act significantly changed the U.S. corporate tax system. The Act reduced the
U.S. federal corporate tax rate from 35% to 21% and created a territorial tax
system that included new taxes on certain foreign sourced earnings. See Note 14
to the Consolidated Financial Statements for additional information regarding
the Act.
FINANCIAL POSITION, LIQUIDITY AND CAPITAL RESOURCES
years ended December 31 (in millions)   2019         2018        2017
Cash flows from:
Operating activities                  $ 13,324$ 13,427$ 9,960
Investing activities                       596      (1,006 )      (274 )
Financing activities                    18,708     (14,396 )    (5,512 )


Operating cash flows in 2019 decreased slightly from 2018 primarily due to
higher payments for income taxes offset by improved results of operations
resulting from an increase in operating earnings. Operating cash flows in 2018
increased from 2017 primarily due to improved results of operations from revenue
growth and a decrease in income tax payments. Operating cash flows also
reflected AbbVie's contributions to its defined benefit plans of $727 million in
2019, $873 million in 2018 and $246 million in 2017.
Investing cash flows in 2019 included net sales and maturities of investments
totaling $2.1 billion resulting from the sale of substantially all of the
company's investments in debt securities, payments made for other acquisitions
and investments of $1.1 billion and capital expenditures of $552 million.
Investing cash flows in 2018 included payments made for other acquisitions and
investments of $736 million and capital expenditures of $638 million, partially
offset by net sales and maturities of investment securities totaling
$368 million. Investing cash flows in 2017 included capital expenditures of
$529 million and payments made for other acquisitions and investments of
$308 million, partially offset by net sales and maturities of investment
securities totaling $563 million.
Financing cash flows in 2019 included the issuance of $30.0 billion aggregate
principal amount of floating rate and fixed rate unsecured senior notes at
maturities ranging from 18 months to 30 years. AbbVie expects to use the net
proceeds of $29.8 billion to fund a portion of the aggregate cash consideration
due to Allergan shareholders in connection with the proposed acquisition and to
pay related fees and expenses. Pending the consummation of the proposed Allergan
acquisition, the net proceeds from the offering are permitted to be invested
temporarily in short-term investments. All of the notes are subject to special
mandatory redemption at a redemption price equal to 101% of the aggregate
principal amount of the notes plus accrued and unpaid interest if the proposed
acquisition of Allergan is not completed by January 30, 2021 or the company
notifies the trustee in respect of the notes that it will not pursue the
consummation of the proposed Allergan acquisition.
Additionally, financing cash flows in 2019 included the issuance of €1.4 billion
aggregate principal amount of unsecured senior Euro notes which the company used
to redeem €1.4 billion aggregate principal amount of 0.38% senior Euro notes
that were due to mature in November 2019, as well as the repayment of a
$3.0 billion 364-day term loan credit agreement that was scheduled to mature in
June 2019.
Financing cash flows in 2018 included proceeds from the issuance of $3.0 billion
drawn under the term loan in June 2018. In September 2018, the company issued
$6.0 billion aggregate principal amount of unsecured senior notes. Of the
$5.9 billion net proceeds, $2.0 billion was used to repay the company's
outstanding three-year term loan credit agreement in September 2018 and $1.0
billion was used to repay the aggregate principal amount of 2.00% senior notes
at maturity in November 2018. Financing cash flows in 2018 also included the May
2018 repayment of $3.0 billion aggregate principal amount of the company's 1.80%
senior notes at maturity.
In 2019, 2018 and 2017, the company issued and redeemed commercial paper. There
were no commercial paper borrowings outstanding as of December 31, 2019 and
there was $699 million outstanding as of December 31, 2018. AbbVie may issue
additional commercial paper or retire commercial paper to meet liquidity
requirements as needed.
Cash dividend payments totaled $6.4 billion in 2019, $5.6 billion in 2018 and
$4.1 billion in 2017. The increase in cash dividend payments was primarily
driven by an increase in the dividend rate. On November 1, 2019, AbbVie
announced that its board of directors declared an increase in the quarterly cash
dividend from $1.07 per share to $1.18 per share beginning with the dividend
payable on February 14, 2020 to stockholders of record as of January 15, 2020.
This reflects an increase of approximately 10.3% over the previous quarterly
rate. The timing, declaration, amount of and payment of any dividends by AbbVie
in the future is within the discretion of its board of directors and will depend
upon many factors, including AbbVie's financial condition, earnings, capital
requirements of its operating subsidiaries, covenants associated with certain of
AbbVie's

2019 Modulo 10-K | ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) 35

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debt service obligations, legal requirements, regulatory constraints, industry
practice, ability to access capital markets and other factors deemed relevant by
its board of directors.
On February 15, 2018, AbbVie's board of directors authorized a new $10.0 billion
stock repurchase program, which superseded AbbVie's previous stock repurchase
program. On December 13, 2018, AbbVie's board of directors authorized a $5.0
billion increase to the existing $10.0 billion stock repurchase program. The
company's stock repurchase authorization permits purchases of AbbVie shares from
time to time in open-market or private transactions at management's discretion.
The program has no time limit and can be discontinued at any time. Under this
authorization, AbbVie repurchased 4 million shares for $300 million in 2019 and
109 million shares for $10.7 billion in 2018. AbbVie cash-settled $201 million
of its December 2018 open market purchases in January 2019. AbbVie's remaining
stock repurchase authorization was $4.0 billion as of December 31, 2019.
Under previous stock repurchase programs, AbbVie made open market share
repurchases of 11 million shares for $1.3 billion in 2018 and 13 million shares
for $1.0 billion in 2017. AbbVie cash-settled $285 million of its December 2016
open market purchases in January 2017.
In 2019, AbbVie made contingent consideration milestone and royalty payments to
BI totaling $234 million following the commercial launch of SKYRIZI in certain
geographies. $163 million of these payments were included in financing cash
flows and $71 million of the payments were included in operating cash flows. In
2018, AbbVie paid $100 million of contingent consideration to BI related to BLA
and MAA acceptance milestones. $78 million of these payments were included in
financing cash flows and $22 million of the payments were included in operating
cash flows. In 2017, AbbVie paid $305 million of contingent consideration to BI
related to a Phase 3 enrollment milestone. $268 million of this milestone was
included in financing cash flows and $37 million was included in operating cash
flows.
In connection with the proposed acquisition of Allergan, on June 25, 2019,
AbbVie entered into a $38.0 billion 364-day bridge credit agreement and on July
12, 2019, AbbVie entered into a $6.0 billion term loan credit agreement. The
company incurred a total of $242 million of debt issuance costs related to the
two agreements. On October 25, 2019, AbbVie commenced offers to exchange any and
all outstanding notes of certain series issued by Allergan for up to $15.5
billion aggregate principal amount and €3.7 billion aggregate principal amount
of new notes to be issued by AbbVie and cash, subject to conditions including
the closing of the proposed acquisition. See Note 10 to the Consolidated
Financial Statements for additional information. In February 2020, the remaining
commitments under the bridge credit agreement were reduced to $0 as a result of
cash on hand at AbbVie. AbbVie subsequently terminated the bridge credit
agreement in its entirety as permitted under its terms.
Credit Risk
AbbVie monitors economic conditions, the creditworthiness of customers and
government regulations and funding, both domestically and abroad. AbbVie
regularly communicates with its customers regarding the status of receivable
balances, including their payment plans and obtains positive confirmation of the
validity of the receivables. AbbVie establishes an allowance against accounts
receivable when it is probable they will not be collected. AbbVie may also
utilize factoring arrangements to mitigate credit risk, although the receivables
included in such arrangements have historically not been a significant amount of
total outstanding receivables.
Credit Facility, Access to Capital and Credit Ratings
Credit Facility
In August 2019, AbbVie entered into an amended and restated $4.0 billion
five-year revolving credit facility that matures in August 2024. This amended
facility enables the company to borrow funds on an unsecured basis at variable
interest rates and contains various covenants. At December 31, 2019, the company
was in compliance with all its credit facility covenants. Commitment fees under
the credit facility were insignificant. No amounts were outstanding under the
company's credit facilities as of December 31, 2019 and 2018.
Access to Capital
The company intends to fund short-term and long-term financial obligations as
they mature through cash on hand, future cash flows from operations, or by
issuing additional debt. The company's ability to generate cash flows from
operations, issue debt or enter into financing arrangements on acceptable terms
could be adversely affected if there is a material decline in the demand for the
company's products or in the solvency of its customers or suppliers,
deterioration in the company's key financial ratios or credit ratings, or other
material unfavorable changes in business conditions. At the current time, the
company believes it has sufficient financial flexibility to issue debt, enter
into other financing arrangements and attract long-term capital on acceptable
terms to support the company's growth objectives.

36 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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Credit Ratings
Following the announcement of the proposed acquisition of Allergan and the
$30.0 billion senior notes issuance, Moody's Investor Service affirmed its Baa2
senior unsecured long-term rating and Prime-2 short-term rating with a stable
outlook. S&P Global Ratings revised its ratings outlook to negative from stable
and expects to lower the issuer credit rating by one notch to BBB+ from A- and
the short-term rating to A-2 from A-1 when the acquisition is complete.
Unfavorable changes to the ratings may have an adverse impact on future
financing arrangements; however, they would not affect the company's ability to
draw on its credit facility and would not result in an acceleration of scheduled
maturities of any of the company's outstanding debt.
Contractual Obligations
The following table summarizes AbbVie's estimated contractual obligations as of
December 31, 2019:
                                                     Less than          One to           Three to          More than
(in millions)                           Total         one year        three years        five years        five years
Long-term debt, including current
portion                              $  67,233$     3,750$       14,150$       7,625$      41,708
Interest on long-term debt(a)           30,494           2,146              4,087             3,479            20,782
Non-cancelable operating and finance
lease payments(f)                          774             129                224               125               296
Purchase obligations and other(b)        3,532           3,295                186                45                 6
Other long-term liabilities (c) (d)
(e)                                     11,544             166              1,395             2,123             7,860
Total                                $ 113,577$     9,486$       20,042$      13,397$      70,652

(a) Include i pagamenti di interessi futuri stimati sul debito a lungo termine. Interesse

i pagamenti sul debito sono calcolati per periodi futuri utilizzando gli interessi previsti

tassi in vigore alla fine del 2019. I pagamenti di interessi previsti comprendono il

effetti correlati degli accordi di swap su tassi di interesse. Alcuni di questi proiettati

i pagamenti di interessi potrebbero differire in futuro in base alle variazioni del floating

tassi di interesse o altri fattori o eventi. I pagamenti degli interessi previsti

riguardano solo gli obblighi e gli accordi in essere presso 31 dicembre 2019.

Per ulteriori informazioni, consultare la Nota 10 del bilancio consolidato

informazioni relative agli strumenti di debito della società e alla nota 11 per

ulteriori informazioni sugli accordi di swap su tassi di interesse in essere presso

31 dicembre 2019.

(b) Include i significativi obblighi di acquisto incondizionati della società. Questi

gli impegni non superano i requisiti previsti dalla società e vengono assunti

nel normale corso degli affari.

(c) Esclude le passività associate ai benefici fiscali non riconosciuti della società

in quanto non è possibile stimare in modo affidabile i tempi della liquidità futura

deflussi relativi a tali passività. Vedi nota 14 al testo consolidato

Bilanci per ulteriori informazioni su tali imposte non riconosciute

benefici.

(d) Include $ 7,3 miliardi delle passività per corrispettivo potenziale che sono

registrato al valore equo nel bilancio consolidato. Potenziale

pagamenti di corrispettivi potenziali che eccedono il valore equo registrato nel

    consolidated balance sheet are not included in the table of contractual
    obligations. See Note 11 to the Consolidated Financial Statements for
    additional information regarding these liabilities.

(e) Include un'obbligo fiscale di transizione una tantum su un obbligo ritenuto

conseguente rimpatrio di utili precedentemente non tassati di filiali estere

a partire dal NOI. riforma fiscale attuata nel 2017. L'imposta di transizione una tantum è

generalmente pagabile in otto rate annuali. Vedi nota 14 al

Bilancio consolidato per ulteriori informazioni al riguardo

passività fiscali.

(f) I pagamenti per il leasing includono circa $ 350 milioni del minimo contrattuale

pagamenti per contratti di locazione eseguiti ma non ancora iniziati. Questi contratti di locazione lo faranno

iniziare nel 2020 con un contratto di locazione di circa 11 anni.



AbbVie enters into R&D collaboration arrangements with third parties that may
require future milestone payments to third parties contingent upon the
achievement of certain development, regulatory, or commercial milestones.
Individually, these arrangements are insignificant in any one annual reporting
period. However, if milestones for multiple products covered by these
arrangements would happen to be reached in the same reporting period, the
aggregate charge to expense could be material to the results of operations in
that period. From a business perspective, the payments are viewed as positive
because they signify that the product is successfully moving through development
and is now generating or is more likely to generate future cash flows from
product sales. It is not possible to predict with reasonable certainty whether
these milestones will be achieved or the timing for achievement. As a result,
these potential payments are not included in the table of contractual

2019 Modulo 10-K | ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) 37

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obligations. See Note 5 to the Consolidated Financial Statements for additional
information on these collaboration arrangements.
CRITICAL ACCOUNTING POLICIES AND ESTIMATES
The preparation of financial statements in accordance with generally accepted
accounting principles in the United States requires the use of estimates and
assumptions that affect the reported amounts of assets and liabilities and the
reported amounts of revenue and expenses. A summary of the company's significant
accounting policies is included in Note 2 to the Consolidated Financial
Statements. Certain of these policies are considered critical as these most
significantly impact the company's financial condition and results of operations
and require the most difficult, subjective, or complex judgments, often as a
result of the need to make estimates about the effect of matters that are
inherently uncertain. Actual results may vary from these estimates.
Revenue Recognition
AbbVie recognizes revenue when control of promised goods or services is
transferred to the company's customers, in an amount that reflects the
consideration AbbVie expects to be entitled to in exchange for those goods or
services. Sales, value add and other taxes collected concurrent with
revenue-producing activities are excluded from revenue. AbbVie generates revenue
primarily from product sales. For the majority of sales, the company transfers
control, invoices the customer and recognizes revenue upon shipment to the
customer.
Rebates
AbbVie provides rebates to pharmacy benefit managers, state government Medicaid
programs, insurance companies that administer Medicare drug plans, wholesalers,
group purchasing organizations and other government agencies and private
entities.
Rebate and chargeback accruals are accounted for as variable consideration and
are recorded as a reduction to revenue in the period the related product is
sold. Rebates and chargebacks totaled $18.8 billion in 2019, $16.4 billion in
2018 and $12.9 billion in 2017. Rebate amounts are typically based upon the
volume of purchases using contractual or statutory prices, which may vary by
product and by payer. For each type of rebate, the factors used in the
calculations of the accrual for that rebate include the identification of the
products subject to the rebate, the applicable price terms and the estimated lag
time between sale and payment of the rebate, which can be significant.
In order to establish its rebate and chargeback accruals, the company uses both
internal and external data to estimate the level of inventory in the
distribution channel and the rebate claims processing lag time for each type of
rebate. To estimate the rebate percentage or net price, the company tracks sales
by product and by customer or payer. The company evaluates inventory data
reported by wholesalers, available prescription volume information, product
pricing, historical experience and other factors in order to determine the
adequacy of its reserves. AbbVie regularly monitors its reserves and records
adjustments when rebate trends, rebate programs and contract terms, legislative
changes, or other significant events indicate that a change in the reserve is
appropriate. Historically, adjustments to rebate accruals have not been material
to net earnings.

38 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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The following table is an analysis of the three largest rebate accruals and
chargeback allowances, which comprise approximately 94% of the total
consolidated rebate and chargebacks recorded as reductions to revenues in 2019.
Remaining rebate provisions charged against gross revenues are not significant
in the determination of operating earnings.
                               Medicaid
                                  and        Managed
                               Medicare        Care       Wholesaler
(in millions)                   Rebates       Rebates     Chargebacks

Saldo a 31 dicembre 2016$ 1,167$ 1,167$ 383
disposizioni

                        2,909        3,990           5,026
Payments                         (2,736 )     (3,962 )        (4,887 )
Balance at December 31, 2017      1,340        1,195             522
Provisions                        3,493        4,729           6,659
Payments                         (3,188 )     (4,485 )        (6,525 )
Balance at December 31, 2018      1,645        1,439             656
Provisions                        4,035        5,772           7,947
Payments                         (3,915 )     (5,275 )        (7,917 )

Saldo a 31 dicembre 2019$ 1,765$ 1.936$ 686



Cash Discounts and Product Returns
Cash discounts and product returns, which totaled $1.6 billion in 2019, $1.6
billion in 2018 and $1.3 billion in 2017, are accounted for as variable
consideration and are recorded as a reduction to revenue in the same period the
related product is sold. The reserve for cash discounts is readily determinable
because the company's experience of payment history is fairly consistent.
Product returns can be reliably estimated based on the company's historical
return experience.
Pension and Other Post-Employment Benefits
AbbVie engages outside actuaries to assist in the determination of the
obligations and costs under the pension and other post-employment benefit plans
that are direct obligations of AbbVie. The valuation of the funded status and
the net periodic benefit cost for these plans are calculated using actuarial
assumptions. The significant assumptions, which are reviewed annually, include
the discount rate, the expected long-term rate of return on plan assets and the
health care cost trend rates, and are disclosed in Note 12 to the Consolidated
Financial Statements.
The discount rate is selected based on current market rates on high-quality,
fixed-income investments at December 31 each year. AbbVie employs a yield-curve
approach for countries where a robust bond market exists. The yield curve is
developed using high-quality bonds. The yield-curve approach reflects the plans'
specific cash flows (i.e. duration) in calculating the benefit obligations by
applying the corresponding individual spot rates along the yield curve. AbbVie
reflects the plans' specific cash flows and applies them to the corresponding
individual spot rates along the yield curve in calculating the service cost and
interest cost portions of expense. For other countries, AbbVie reviews various
indices such as corporate bond and government bond benchmarks to estimate the
discount rate. AbbVie's assumed discount rates have a significant effect on the
amounts reported for defined benefit pension and other post-employment plans as
of December 31, 2019. A 50 basis point change in the assumed discount rate would
have had the following effects on AbbVie's calculation of net periodic benefit
costs in 2020 and projected benefit obligations as of December 31, 2019:
                                                  50 basis point
(in millions) (brackets denote a reduction)  Increase       Decrease
Defined benefit plans
Service and interest cost                   $    (76 )$       92
Projected benefit obligation                    (723 )            825
Other post-employment plans
Service and interest cost                   $    (11 )$       14
Projected benefit obligation                    (101 )            117

Il tasso di rendimento atteso a lungo termine si basa sull'allocazione delle attività,
performance storica e visione attuale dei rendimenti futuri attesi. Abbvie
considera questi input con un focus a lungo termine per evitare il mercato a breve termine
influenze. Il


    2019 Form 10-K  | ((Image Removed: abbvieimage2a14.gif))  39



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current long-term rate of return on plan assets for each plan is supported by
the historical performance of the trust's actual and target asset allocation.
AbbVie's assumed expected long-term rate of return has a significant effect on
the amounts reported for defined benefit pension plans as of December 31, 2019
and will be used in the calculation of net periodic benefit cost in 2020. A
one percentage point change in assumed expected long-term rate of return on plan
assets would increase or decrease the net period benefit cost of these plans in
2020 by $71 million.
The health care cost trend rate is selected by reviewing historical trends and
current views on projected future health care cost increases. The current health
care cost trend rate is supported by the historical trend experience of each
plan. Assumed health care cost trend rates have a significant effect on the
amounts reported for health care plans as of December 31, 2019 and will be used
in the calculation of net periodic benefit cost in 2020. A one percentage point
change in assumed health care cost trend rates would have the following effects
on AbbVie's calculation of net periodic benefit costs in 2020 and the projected
benefit obligation as of December 31, 2019:
                                                   One percentage point
(in millions) (brackets denote a reduction)       Increase           Decrease
Service and interest cost                   $      40$    (28 )
Projected benefit obligation                      244                   (186 )


Income Taxes
AbbVie accounts for income taxes under the asset and liability method.
Provisions for federal, state and foreign income taxes are calculated on
reported pretax earnings based on current tax laws. Deferred taxes are provided
using enacted tax rates on the future tax consequences of temporary differences,
which are the differences between the financial statement carrying amount of
assets and liabilities and their respective tax bases and the tax benefits of
carryforwards. A valuation allowance is established or maintained when, based on
currently available information, it is more likely than not that all or a
portion of a deferred tax asset will not be realized.
Litigation
The company is subject to contingencies, such as various claims, legal
proceedings and investigations regarding product liability, intellectual
property, commercial, securities and other matters that arise in the normal
course of business. See Note 15 to the Consolidated Financial Statements for
additional information. Loss contingency provisions are recorded for probable
losses at management's best estimate of a loss, or when a best estimate cannot
be made, a minimum loss contingency amount within a probable range is recorded.
Accordingly, AbbVie is often initially unable to develop a best estimate of loss
and therefore, the minimum amount, which could be zero, is recorded. As
information becomes known, either the minimum loss amount is increased,
resulting in additional loss provisions, or a best estimate can be made, also
resulting in additional loss provisions. Occasionally, a best estimate amount is
changed to a lower amount when events result in an expectation of a more
favorable outcome than previously expected.
Valuation of Goodwill and Intangible Assets
AbbVie has acquired and may continue to acquire significant intangible assets in
connection with business combinations that AbbVie records at fair value.
Transactions involving the purchase or sale of intangible assets occur with some
frequency between companies in the pharmaceuticals industry and valuations are
usually based on a discounted cash flow analysis incorporating the stage of
completion. The discounted cash flow model requires assumptions about the timing
and amount of future net cash flows, risk, cost of capital, terminal values and
market participants. Each of these factors can significantly affect the value of
the intangible asset. IPR&D acquired in a business combination is capitalized as
an indefinite-lived intangible asset until regulatory approval is obtained, at
which time it is accounted for as a definite-lived asset and amortized over its
estimated useful life, or discontinuation, at which point the intangible asset
will be written off. IPR&D acquired in transactions that are not business
combinations is expensed immediately, unless deemed to have an alternative
future use. Payments made to third parties subsequent to regulatory approval are
capitalized and amortized over the remaining useful life.
AbbVie reviews the recoverability of definite-lived intangible assets whenever
events or changes in circumstances indicate the carrying value of an asset may
not be recoverable. Goodwill and indefinite-lived intangible assets are reviewed
for impairment annually or when an event occurs that could result in an
impairment. See Note 2 to the Consolidated Financial Statements for further
information.
Annually, the company tests its goodwill for impairment by first assessing
qualitative factors to determine whether it is more likely than not that the
fair value is less than its carrying amount. Some of the factors considered in
the assessment include general macro-economic conditions, conditions specific to
the industry and market, cost factors, the overall financial

40 ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) | 2019 Modulo 10-K

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performance and whether there have been sustained declines in the company's
share price. If the company concludes it is more likely than not that the fair
value of the reporting unit is less than its carrying amount, a quantitative
impairment test is performed. AbbVie tests indefinite-lived intangible assets
for impairment by first assessing qualitative factors to determine whether it is
more likely than not that the fair value is less than its carrying amount. If
the company concludes it is more likely than not that the fair value is less
than its carrying amount, a quantitative impairment test is performed.
For its quantitative impairment tests, the company uses an estimated future cash
flow approach that requires significant judgment with respect to future volume,
revenue and expense growth rates, changes in working capital use, the selection
of an appropriate discount rate, asset groupings and other assumptions and
estimates. The estimates and assumptions used are consistent with the company's
business plans and a market participant's views. The use of alternative
estimates and assumptions could increase or decrease the estimated fair value of
the assets and could potentially impact the company's results of operations.
Actual results may differ from the company's estimates.
Contingent Consideration
The fair value measurements of contingent consideration liabilities are
determined as of the acquisition date based on significant unobservable inputs,
including the discount rate, estimated probabilities and timing of achieving
specified development, regulatory and commercial milestones and the estimated
amount of future sales of the acquired products. Contingent consideration
liabilities are revalued to fair value at each subsequent reporting date until
the related contingency is resolved. The potential contingent consideration
payments are estimated by applying a probability-weighted expected payment model
for contingent milestone payments and a Monte Carlo simulation model for
contingent royalty payments, which are then discounted to present value. Changes
to the fair value of the contingent consideration liabilities can result from
changes to one or a number of inputs, including discount rates, the
probabilities of achieving the milestones, the time required to achieve the
milestones and estimated future sales. Significant judgment is employed in
determining the appropriateness of certain of these inputs. Changes to the
inputs described above could have a material impact on the company's financial
position and results of operations in any given period. At December 31, 2019, a
50 basis point increase/decrease in the assumed discount rate would have
decreased/increased the value of the contingent consideration liabilities by
approximately $280 million. Additionally, at December 31, 2019, a five
percentage point increase/decrease in the assumed probability of success across
all potential indications would have increased/decreased the value of the
contingent consideration liabilities by approximately $150 million.
Recent Accounting Pronouncements
See Note 2 to the Consolidated Financial Statements for additional information
on recent accounting pronouncements.

2019 Modulo 10-K | ((Immagine rimossa: abbvieimage2a14.gif)) 41

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© Edgar Online, fonte scorci