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SUD SAN FRANCISCO, California., 13 gennaio 2020 / PRNewswire / – Rigel Pharmaceuticals, Inc. (Nasdaq: RIGL) ha fornito oggi un aggiornamento aziendale, compresi i ricavi preliminari del prodotto e il totale TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) bottiglie per il trimestre; l'approvazione della Commissione Europea (CE) di fostamatinib disodio esaidrato (fostamatinib) per pazienti adulti con trombocitopenia immune cronica (ITP); e progressi nell'arruolamento nel suo studio pilota di Fase 3 per l'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA). Il presidente e CEO della società, Raul Rodriguez, fornirà una panoramica aziendale più dettagliata durante la sua presentazione in corso Giovedì 16 gennaio a 7:30 PT alla 38a Conferenza annuale J.P.Morgan Healthcare.

“Rigel ha costruito una solida base per una crescita continua, ancorata all'aumento dei ricavi delle nostre attività commerciali negli Stati Uniti. Con l'approvazione europea di fostamatinib, prevediamo di generare entrate dai pagamenti delle royalty a partire dalla seconda metà dell'anno e, soprattutto, riceveremo un' $ 20 milioni pietra miliare del nostro partner, Grifols, S.A. “, ha dichiarato Rodriguez, presidente e CEO di Rigel.” L'iscrizione alla nostra sperimentazione clinica di Fase 3 in caldo AIHA sta accelerando con l'attivazione in corso di siti di prova. Questo è un mercato estremamente interessante per Rigel data la mancanza di una terapia approvata dalla FDA e le sinergie con la nostra attività commerciale ITP. Inoltre, stiamo facendo progressi significativi con i nostri nuovi programmi IRAK 1/4 e RIP1 e siamo entusiasti del loro potenziale valore. “

Aggiornamento finanziario preliminare
Mentre Rigel è ancora in procinto di determinare i risultati finali per il quarto trimestre del 2019, la società prevede di segnalare vendite nette di prodotti di circa $ 13,8 milioni, rispetto a $ 7,3 milioni nello stesso periodo del 2018, con un incremento del 90%.

Entrate contrattuali da collaborazioni per il trimestre chiuso 31 dicembre 2019, dovrebbero essere approssimativamente $ 1,6 milioni, che consiste in a $ 1,5 milioni commissione guadagnata a seguito di una modifica in Ottobre 2019 del contratto di licenza e collaborazione con Aclaris datato 27 agosto 2015, nonché i ricavi differiti derivanti dalla sua collaborazione con Grifols in relazione all'esecuzione di determinati servizi di ricerca e sviluppo.

Per il quarto trimestre 2019, Rigel prevede di registrare ricavi totali di circa 15,4 milioni di dollari.

La società prevede di segnalare disponibilità liquide, mezzi equivalenti e investimenti a breve termine a partire dal 31 dicembre 2019 di circa $ 98,0 milioni, rispetto a $ 128,5 milioni come di 31 dicembre 2018.

Le informazioni di cui sopra sono preliminari, non sono state sottoposte a revisione contabile e sono soggette a modifiche al completamento della revisione contabile dei bilanci aziendali a partire da e per l'esercizio chiuso 31 dicembre 2019.

Aggiornamento commerciale
TAVALISSE in crescita nel mercato statunitense
Durante il quarto trimestre del 2019, negli Stati Uniti sono state vendute in totale 1.518 bottiglie di TAVALISSE di cui 1.422 spedite direttamente a pazienti e cliniche. Il tasso di ricarica al mese 4 è aumentato a circa il 54%, riflettendo il beneficio dei pazienti poiché TAVALISSE è usato più frequentemente nel trattamento di prima linea e i medici acquisiscono maggiore esperienza con il suo uso.

Verso il 2020, Rigel è pronta per un'ulteriore crescita con piani di espansione della sua forza vendita di sei persone nei mercati chiave. Inoltre, la società intende continuare le sue iniziative di dati in corso e sfruttare i dati post-hoc presentati di recente che mostrano un tasso di risposta del 78% nei pazienti ITP che hanno ricevuto TAVALISSE in seconda linea.

Approvazione CE di Fostamatinib e lancio del prodotto
Rigel ha annunciato oggi di aver ricevuto l'approvazione CE della sua domanda di autorizzazione all'immissione in commercio (MAA) per fostamatinib per il trattamento della trombocitopenia immunitaria cronica in pazienti adulti refrattari ad altri trattamenti. Con questa approvazione, l'azienda riceverà un pagamento cardine di $ 20 milioni basato sui termini della sua collaborazione con Grifols, S.A. Durante il processo di revisione normativa, Grifols ha iniziato a prepararsi a lanciare il prodotto nei principali mercati europei ed è ora in grado di avviare i processi regolatori per la commercializzazione nei singoli paesi. La società prevede di generare entrate incrementali dalle vendite europee di fostamatinib nella seconda metà di quest'anno sotto forma di pagamenti di royalty.

Aggiornamento del portafoglio
Prova di fase 3 in Warm AIHA
Dal lancio di FORWARD (Fostamatinib Research in Warm Antibody AIHA Disease), studio cardine di Fase 3 di Rigel in AIHA caldo, la società ha lavorato con cliniche e autorità regolatorie e ha creato la stragrande maggioranza degli oltre 100 siti di sperimentazione clinica pianificati su 22 paesi. Con il numero di siti aperti in rapida crescita, oltre 45 negli ultimi tre mesi, l'iscrizione alla sperimentazione è stata accelerata come previsto con 15 su 20 pazienti totali arruolati negli ultimi due mesi. Il processo rimane sulla buona strada per completare le iscrizioni a metà del 2020.

Pipeline di sviluppo clinico
Nel quarto trimestre del 2019, Rigel ha annunciato i risultati del suo studio clinico di Fase 1 su R8351, l'inibitore della chinasi 1/4 (IRAK1 / 4) associato al recettore dell'interleuchina-1. Questa nuova molecola è l'unica risorsa nello sviluppo clinico che è un doppio inibitore di IRAK1 e IRAK4 ed è stato dimostrato preclinicamente di bloccare la produzione di citochine infiammatorie in risposta al recettore toll-like (TLR) e al recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) segnalazione familiare. Lo studio di Fase 1 ha stabilito la dimostrazione del meccanismo dimostrando l'inibizione della produzione di citochine infiammatorie in una sfida LPS (lipopolisaccaride).

Inoltre, Rigel ha recentemente avviato uno studio di fase 1 sul suo inibitore della proteina chinasi recettore (RIP1), R5521. Si ritiene che RIP1 svolga un ruolo critico nella necroptosi, una forma di morte cellulare regolata implicata in malattie infiammatorie e neurodegenerative. I dati iniziali della Fase 1 in corso di Rigel suggeriscono che R552 ha un profilo farmacocinetico (PK) e di sicurezza attraente con un'emivita di circa 15 ore. In precedenti studi preclinici, la molecola ha dimostrato di prevenire l'infiammazione delle articolazioni e della pelle in un modello murino mediato dalla chinasi RIP1.

Entrambe le attività mirano a percorsi di grande interesse per l'industria biofarmaceutica e si ritiene che abbiano un potenziale significativo nel trattamento delle malattie infiammatorie e immuno-mediate.

38th Annuale J.P. Morgan Webcast Dettagli di presentazione
La presentazione di Rigel sarà trasmessa via web ed è programmata per aver luogo Giovedì 16 gennaio a 7:30 PT. Per accedere al webcast live e successivamente archiviato, visitare la sezione Investor Relations del sito Web della società all'indirizzo www.rigel.com. Si prega di connettersi al sito Web alcuni minuti prima dell'inizio del webcast live per garantire il tempo adeguato per qualsiasi download di software che potrebbe essere necessario.

Informazioni su ITP
Nei pazienti con ITP (trombocitopenia immunitaria), il sistema immunitario attacca e distrugge le piastrine del sangue, che svolgono un ruolo attivo nella coagulazione e nella guarigione del sangue. I sintomi più comuni di ITP sono lividi e sanguinamento eccessivi. Le persone che soffrono di ITP cronica possono vivere con un aumentato rischio di eventi emorragici gravi che possono causare gravi complicazioni mediche o persino la morte. Le attuali terapie per ITP includono steroidi, stimolatori della produzione di piastrine nel sangue (TPO-RA) e splenectomia. Tuttavia, non tutti i pazienti rispondono alle terapie esistenti. Di conseguenza, rimane una significativa necessità medica di ulteriori opzioni di trattamento per i pazienti con ITP.

Informazioni su AIHA
L'anemia emolitica autoimmune (AIHA) è una malattia rara e grave del sangue in cui il sistema immunitario produce anticorpi che provocano la distruzione dei globuli rossi del corpo. L'AIHA colpisce circa 45.000 pazienti adulti negli Stati Uniti e può essere una malattia grave e debilitante. Ad oggi, non esistono terapie mirate alla malattia approvate per AIHA, nonostante il bisogno medico insoddisfatto che esiste per questi pazienti. L'anticorpo caldo AIHA (wAIHA), la forma più comune di AIHA, è caratterizzato dalla presenza di anticorpi che reagiscono con la superficie dei globuli rossi a temperatura corporea.

Circa R8351
Il candidato in fase di sperimentazione, R835, è un inibitore disponibile, potente e selettivo per via orale di IRAK1 e IRAK4 che ha dimostrato preclinicamente di bloccare la produzione di citochine infiammatorie in risposta al recettore a pedaggio (TLR) e al recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) segnalazione familiare. TLR e IL-1R svolgono un ruolo critico nella risposta immunitaria innata e la disregolazione di questi percorsi può portare a una varietà di condizioni patologiche infiammatorie. Il trattamento R835 dimostra il miglioramento dei sintomi clinici in più modelli di roditori di malattia infiammatoria tra cui psoriasi, artrite, lupus, sclerosi multipla e gotta. La sicurezza e l'efficacia di R835 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Circa R5521
Il candidato sperimentale, R552, è un inibitore disponibile, potente e selettivo per via orale della proteina chinasi recettore-interagente (RIP1). Si ritiene che RIP1 svolga un ruolo critico nella necroptosi. La necroptosi è una forma di morte cellulare regolata in cui la rottura delle cellule porta alla dispersione del loro contenuto interno, che induce risposte immunitarie e migliora l'infiammazione. In studi preclinici, R552 ha prevenuto l'infiammazione delle articolazioni e della pelle in un modello murino mediato da RIP1 di infiammazione e danno tissutale. La sicurezza e l'efficacia di R552 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Informazioni su TAVALISSE
Indicazione
TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) compresse è indicato per il trattamento della trombocitopenia in pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica (ITP) che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento.

Informazioni importanti sulla sicurezza
Avvertenze e precauzioni

  • L'ipertensione può verificarsi con il trattamento TAVALISSE. I pazienti con ipertensione preesistente possono essere più sensibili agli effetti ipertesi. Monitorare la pressione sanguigna ogni 2 settimane fino a che non sia stabile, quindi mensilmente e regolare o avviare la terapia antiipertensiva per il mantenimento del controllo della pressione arteriosa durante la terapia. Se l'aumento della pressione sanguigna persiste, può essere necessaria l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • Con TAVALISSE possono verificarsi test elevati di funzionalità epatica (LFT), principalmente ALT e AST. Monitorare mensilmente le LFT durante il trattamento. Se ALT o AST aumentano a> 3 volte il limite superiore del normale, gestire l'epatotossicità usando l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • La diarrea si è verificata nel 31% dei pazienti e la diarrea grave si è verificata nell'1% dei pazienti trattati con TAVALISSE. Monitorare i pazienti per lo sviluppo di diarrea e gestirli utilizzando misure di terapia di supporto subito dopo l'insorgenza dei sintomi. Se la diarrea diventa grave (≥ 3 ° grado), interrompere, ridurre la dose o interrompere TAVALISSE.
  • La neutropenia si è verificata nel 6% dei pazienti trattati con TAVALISSE; neutropenia febbrile si è verificata nell'1% dei pazienti. Monitorare mensilmente l'ANC e l'infezione durante il trattamento. Gestire la tossicità con l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • TAVALISSE può causare danni al feto quando somministrato a donne in gravidanza. Consiglia alle donne in gravidanza il potenziale rischio per un feto. Consigliare alle donne in età fertile di usare un metodo contraccettivo efficace durante il trattamento e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose. Verificare lo stato di gravidanza prima di iniziare TAVALISSE. Non è noto se TAVALISSE o il suo metabolita siano presenti nel latte materno. A causa della possibilità di gravi reazioni avverse in un bambino allattato al seno, consiglia a una donna che allatta di non allattare durante il trattamento con TAVALISSE e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose.

Interazioni farmacologiche

  • L'uso concomitante di TAVALISSE con potenti inibitori del CYP3A4 aumenta l'esposizione al principale metabolita attivo di TAVALISSE (R406), che può aumentare il rischio di reazioni avverse. Monitorare le tossicità che potrebbero richiedere una riduzione della dose di TAVALISSE.
  • Non è raccomandato l'uso di TAVALISSE con potenti induttori del CYP3A4, poiché l'uso concomitante riduce l'esposizione a R406.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di alcuni farmaci per substrato del CYP3A4 e può richiedere una riduzione della dose del farmaco per substrato del CYP3A4.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di farmaci substrato BCRP (ad es. Rosuvastatina) e farmaci substrato P-glicoproteina (P-gp) (ad esempio digossina), che possono richiedere una riduzione della dose del farmaco substrato BCRP e P-gp.

Reazioni avverse

  • Gravi reazioni avverse da farmaco negli studi in doppio cieco ITP sono state neutropenia febbrile, diarrea, polmonite e crisi ipertensiva, verificatesi nell'1% dei pazienti con TAVALISSE. Inoltre, si sono verificate gravi reazioni avverse tra cui dispnea e ipertensione (entrambi 2%), neutropenia, artralgia, dolore toracico, diarrea, vertigini, nefrolitiasi, dolore alle estremità, mal di denti, sincope e ipossia (tutto l'1%).
  • Reazioni avverse comuni (≥5% e più comuni rispetto al placebo) di FIT-1 e FIT-2 incluse: diarrea, ipertensione, nausea, vertigini, aumento di ALT e AST, infezione respiratoria, rash, dolore addominale, affaticamento, dolore toracico e neutropenia.

Consultare www.TAVALISSE.com per informazioni complete sulla prescrizione.

Per segnalare gli effetti collaterali dei farmaci da prescrizione alla FDA, visitare www.fda.gov/medwatch o chiamare il numero 1-800-FDA-1088 (800-332-1088).

TAVALISSE è un marchio commerciale di Rigel Pharmaceuticals, Inc.

Rigel Rigel (www.rigel.com)
Rigel Pharmaceuticals, Inc., è una società di biotecnologie dedicata alla scoperta, allo sviluppo e alla fornitura di nuovi farmaci a piccole molecole che migliorano significativamente la vita dei pazienti con disturbi immunitari ed ematologici, cancro e malattie rare. La ricerca pionieristica di Rigel si concentra su percorsi di segnalazione che sono fondamentali per i meccanismi delle malattie. Il primo prodotto approvato dalla FDA dell'azienda è TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate), l'unico inibitore della tirosina chinasi (SYK) della milza orale, per il trattamento di pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento. I programmi clinici di Rigel includono uno studio di fase 3 su fostamatinib nell'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA); uno studio di fase 1 recentemente completato di R8351, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della chinasi (IRAK) associato al recettore dell'interleuchina; e uno studio di fase 1 in corso su R5521, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della proteina chinasi (RIP) che interagisce con i recettori. Inoltre, Rigel ha prodotto candidati nello sviluppo clinico con i partner Aclaris Therapeutics, AstraZeneca, BerGenBio ASA e Daiichi Sankyo.

1Il prodotto per questo uso o indicazione è in fase di sperimentazione e non è stato dimostrato sicuro o efficace da alcuna autorità di regolamentazione.

Dichiarazioni previsionali
Questa versione contiene dichiarazioni previsionali relative, tra l'altro, al successo commerciale di TAVALISSE negli Stati Uniti .; La capacità di Rigel di ampliare la propria pipeline di risorse destinate a malattie immuno-mediate; Gli sforzi di Rigel per espandere fostamatinib in Europa e per espandere la sua forza vendita nei mercati chiave; Gli sforzi normativi e collaborativi di Rigel in Europa rendere fostamatinib disponibile per i pazienti ITP a livello globale; l'utilità di fostamatinib in altre indicazioni, inclusa l'anemia emolitica autoimmune calda; Capacità di Rigel di raggiungere traguardi di sviluppo e commerciali; I risultati operativi previsti di Rigel per il trimestre conclusosi e al 31 dicembre 2019, comprese le vendite nette e liquidità, equivalenti di cassa e investimenti a breve termine; aspettative legate all'opportunità di mercato di ITP nel mercato europeo e alla progettazione, tempistica, iscrizione e risultati degli studi clinici di Rigel. Qualsiasi affermazione contenuta nel presente comunicato stampa che non sia affermazione di fatti storici può essere considerata una dichiarazione previsionale. Parole come “obiettivi”, “potenziale”, “preliminare”, “può”, “si aspetta” ed espressioni simili intendono identificare queste affermazioni lungimiranti. Queste dichiarazioni previsionali si basano sulle aspettative attuali di Rigel e implicano intrinsecamente rischi e incertezze significativi. I risultati effettivi e la tempistica degli eventi potrebbero differire materialmente da quelli previsti in tali dichiarazioni previsionali a seguito di tali rischi e incertezze, che includono, senza limitazione, i rischi e le incertezze associati alla commercializzazione e alla commercializzazione di TAVALISSE; rischi che FDA, EMA o altre autorità di regolamentazione possano prendere decisioni avverse in merito a fostamatinib; rischi che gli studi clinici TAVALISSE potrebbero non essere in grado di prevedere i risultati del mondo reale o dei risultati negli studi clinici successivi; rischi che TAVALISSE possa avere effetti collaterali indesiderati, reazioni avverse o incidenti di uso improprio; la disponibilità di risorse per sviluppare i candidati al prodotto Rigel; concorrenza sul mercato; nonché altri rischi dettagliati di volta in volta nelle relazioni di Rigel depositate presso la Securities and Exchange Commission, compresa la relazione trimestrale sul modulo 10-Q per il periodo chiuso 30 settembre 2019. Rigel non si assume alcun obbligo di aggiornare le dichiarazioni previsionali e declina espressamente qualsiasi obbligo o impegno a rilasciare pubblicamente eventuali aggiornamenti o revisioni alle dichiarazioni previsionali contenute nel presente documento.

Contatto IR: David Burke
Telefono: 650.624.1232
E-mail: dburke@rigel.com

Cision Visualizza il contenuto originale per scaricare file multimediali: http: //www.prnewswire.com/news-releases/rigel-pharmaceuticals-provides-business-update-300985425.html

FONTE Rigel Pharmaceuticals, Inc.

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SUD SAN FRANCISCO, California., 13 gennaio 2020 / PRNewswire / – Rigel Pharmaceuticals, Inc. (Nasdaq: RIGL) ha fornito oggi un aggiornamento aziendale, compresi i ricavi preliminari del prodotto e il totale TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) bottiglie per il trimestre; l'approvazione della Commissione Europea (CE) di fostamatinib disodio esaidrato (fostamatinib) per pazienti adulti con trombocitopenia immune cronica (ITP); e progressi nell'arruolamento nel suo studio pilota di Fase 3 per l'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA). Il presidente e CEO della società, Raul Rodriguez, fornirà una panoramica aziendale più dettagliata durante la sua presentazione in corso Giovedì 16 gennaio a 7:30 PT alla 38a Conferenza annuale J.P.Morgan Healthcare.

“Rigel ha costruito una solida base per una crescita continua, ancorata all'aumento dei ricavi delle nostre attività commerciali negli Stati Uniti. Con l'approvazione europea di fostamatinib, prevediamo di generare entrate dai pagamenti delle royalty a partire dalla seconda metà dell'anno e, soprattutto, riceveremo un' $ 20 milioni pietra miliare del nostro partner, Grifols, S.A. “, ha dichiarato Rodriguez, presidente e CEO di Rigel.” L'iscrizione alla nostra sperimentazione clinica di Fase 3 in caldo AIHA sta accelerando con l'attivazione in corso di siti di prova. Questo è un mercato estremamente interessante per Rigel data la mancanza di una terapia approvata dalla FDA e le sinergie con la nostra attività commerciale ITP. Inoltre, stiamo facendo progressi significativi con i nostri nuovi programmi IRAK 1/4 e RIP1 e siamo entusiasti del loro potenziale valore. “

Aggiornamento finanziario preliminare
Mentre Rigel è ancora in procinto di determinare i risultati finali per il quarto trimestre del 2019, la società prevede di segnalare vendite nette di prodotti di circa $ 13,8 milioni, rispetto a $ 7,3 milioni nello stesso periodo del 2018, con un incremento del 90%.

Entrate contrattuali da collaborazioni per il trimestre chiuso 31 dicembre 2019, dovrebbero essere approssimativamente $ 1,6 milioni, che consiste in a $ 1,5 milioni commissione guadagnata a seguito di una modifica in Ottobre 2019 del contratto di licenza e collaborazione con Aclaris datato 27 agosto 2015, nonché i ricavi differiti derivanti dalla sua collaborazione con Grifols in relazione all'esecuzione di determinati servizi di ricerca e sviluppo.

Per il quarto trimestre 2019, Rigel prevede di registrare ricavi totali di circa 15,4 milioni di dollari.

La società prevede di segnalare disponibilità liquide, mezzi equivalenti e investimenti a breve termine a partire dal 31 dicembre 2019 di circa $ 98,0 milioni, rispetto a $ 128,5 milioni come di 31 dicembre 2018.

Le informazioni di cui sopra sono preliminari, non sono state sottoposte a revisione contabile e sono soggette a modifiche al completamento della revisione contabile dei bilanci aziendali a partire da e per l'esercizio chiuso 31 dicembre 2019.

Aggiornamento commerciale
TAVALISSE in crescita nel mercato statunitense
Durante il quarto trimestre del 2019, negli Stati Uniti sono state vendute in totale 1.518 bottiglie di TAVALISSE di cui 1.422 spedite direttamente a pazienti e cliniche. Il tasso di ricarica al mese 4 è aumentato a circa il 54%, riflettendo il beneficio dei pazienti poiché TAVALISSE è usato più frequentemente nel trattamento di prima linea e i medici acquisiscono maggiore esperienza con il suo uso.

Verso il 2020, Rigel è pronta per un'ulteriore crescita con piani di espansione della sua forza vendita di sei persone nei mercati chiave. Inoltre, la società intende continuare le sue iniziative di dati in corso e sfruttare i dati post-hoc presentati di recente che mostrano un tasso di risposta del 78% nei pazienti ITP che hanno ricevuto TAVALISSE in seconda linea.

Approvazione CE di Fostamatinib e lancio del prodotto
Rigel ha annunciato oggi di aver ricevuto l'approvazione CE della sua domanda di autorizzazione all'immissione in commercio (MAA) per fostamatinib per il trattamento della trombocitopenia immunitaria cronica in pazienti adulti refrattari ad altri trattamenti. Con questa approvazione, l'azienda riceverà un pagamento cardine di $ 20 milioni basato sui termini della sua collaborazione con Grifols, S.A. Durante il processo di revisione normativa, Grifols ha iniziato a prepararsi a lanciare il prodotto nei principali mercati europei ed è ora in grado di avviare i processi regolatori per la commercializzazione nei singoli paesi. La società prevede di generare entrate incrementali dalle vendite europee di fostamatinib nella seconda metà di quest'anno sotto forma di pagamenti di royalty.

Aggiornamento del portafoglio
Prova di fase 3 in Warm AIHA
Dal lancio di FORWARD (Fostamatinib Research in Warm Antibody AIHA Disease), studio cardine di Fase 3 di Rigel in AIHA caldo, la società ha lavorato con cliniche e autorità regolatorie e ha creato la stragrande maggioranza degli oltre 100 siti di sperimentazione clinica pianificati su 22 paesi. Con il numero di siti aperti in rapida crescita, oltre 45 negli ultimi tre mesi, l'iscrizione alla sperimentazione è stata accelerata come previsto con 15 su 20 pazienti totali arruolati negli ultimi due mesi. Il processo rimane sulla buona strada per completare le iscrizioni a metà del 2020.

Pipeline di sviluppo clinico
Nel quarto trimestre del 2019, Rigel ha annunciato i risultati del suo studio clinico di Fase 1 su R8351, l'inibitore della chinasi 1/4 (IRAK1 / 4) associato al recettore dell'interleuchina-1. Questa nuova molecola è l'unica risorsa nello sviluppo clinico che è un doppio inibitore di IRAK1 e IRAK4 ed è stato dimostrato preclinicamente di bloccare la produzione di citochine infiammatorie in risposta al recettore toll-like (TLR) e al recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) segnalazione familiare. Lo studio di Fase 1 ha stabilito la dimostrazione del meccanismo dimostrando l'inibizione della produzione di citochine infiammatorie in una sfida LPS (lipopolisaccaride).

Inoltre, Rigel ha recentemente avviato uno studio di fase 1 sul suo inibitore della proteina chinasi recettore (RIP1), R5521. Si ritiene che RIP1 svolga un ruolo critico nella necroptosi, una forma di morte cellulare regolata implicata in malattie infiammatorie e neurodegenerative. I dati iniziali della Fase 1 in corso di Rigel suggeriscono che R552 ha un profilo farmacocinetico (PK) e di sicurezza attraente con un'emivita di circa 15 ore. In precedenti studi preclinici, la molecola ha dimostrato di prevenire l'infiammazione delle articolazioni e della pelle in un modello murino mediato dalla chinasi RIP1.

Entrambe le attività mirano a percorsi di grande interesse per l'industria biofarmaceutica e si ritiene che abbiano un potenziale significativo nel trattamento delle malattie infiammatorie e immuno-mediate.

38th Annuale J.P. Morgan Webcast Dettagli di presentazione
La presentazione di Rigel sarà trasmessa via web ed è programmata per aver luogo Giovedì 16 gennaio a 7:30 PT. Per accedere al webcast live e successivamente archiviato, visitare la sezione Investor Relations del sito Web della società all'indirizzo www.rigel.com. Si prega di connettersi al sito Web alcuni minuti prima dell'inizio del webcast live per garantire il tempo adeguato per qualsiasi download di software che potrebbe essere necessario.

Informazioni su ITP
Nei pazienti con ITP (trombocitopenia immunitaria), il sistema immunitario attacca e distrugge le piastrine del sangue, che svolgono un ruolo attivo nella coagulazione e nella guarigione del sangue. I sintomi più comuni di ITP sono lividi e sanguinamento eccessivi. Le persone che soffrono di ITP cronica possono vivere con un aumentato rischio di eventi emorragici gravi che possono causare gravi complicazioni mediche o persino la morte. Le attuali terapie per ITP includono steroidi, stimolatori della produzione di piastrine nel sangue (TPO-RA) e splenectomia. Tuttavia, non tutti i pazienti rispondono alle terapie esistenti. Di conseguenza, rimane una significativa necessità medica di ulteriori opzioni di trattamento per i pazienti con ITP.

Informazioni su AIHA
L'anemia emolitica autoimmune (AIHA) è una malattia rara e grave del sangue in cui il sistema immunitario produce anticorpi che provocano la distruzione dei globuli rossi del corpo. L'AIHA colpisce circa 45.000 pazienti adulti negli Stati Uniti e può essere una malattia grave e debilitante. Ad oggi, non esistono terapie mirate alla malattia approvate per AIHA, nonostante il bisogno medico insoddisfatto che esiste per questi pazienti. L'anticorpo caldo AIHA (wAIHA), la forma più comune di AIHA, è caratterizzato dalla presenza di anticorpi che reagiscono con la superficie dei globuli rossi a temperatura corporea.

Circa R8351
Il candidato in fase di sperimentazione, R835, è un inibitore disponibile, potente e selettivo per via orale di IRAK1 e IRAK4 che ha dimostrato preclinicamente di bloccare la produzione di citochine infiammatorie in risposta al recettore a pedaggio (TLR) e al recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) segnalazione familiare. TLR e IL-1R svolgono un ruolo critico nella risposta immunitaria innata e la disregolazione di questi percorsi può portare a una varietà di condizioni patologiche infiammatorie. Il trattamento R835 dimostra il miglioramento dei sintomi clinici in più modelli di roditori di malattia infiammatoria tra cui psoriasi, artrite, lupus, sclerosi multipla e gotta. La sicurezza e l'efficacia di R835 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Circa R5521
Il candidato sperimentale, R552, è un inibitore disponibile, potente e selettivo per via orale della proteina chinasi recettore-interagente (RIP1). Si ritiene che RIP1 svolga un ruolo critico nella necroptosi. La necroptosi è una forma di morte cellulare regolata in cui la rottura delle cellule porta alla dispersione del loro contenuto interno, che induce risposte immunitarie e migliora l'infiammazione. In studi preclinici, R552 ha prevenuto l'infiammazione delle articolazioni e della pelle in un modello murino mediato da RIP1 di infiammazione e danno tissutale. La sicurezza e l'efficacia di R552 non sono state stabilite dalla FDA o da alcuna autorità sanitaria.

Informazioni su TAVALISSE
Indicazione
TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate) compresse è indicato per il trattamento della trombocitopenia in pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica (ITP) che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento.

Informazioni importanti sulla sicurezza
Avvertenze e precauzioni

  • L'ipertensione può verificarsi con il trattamento TAVALISSE. I pazienti con ipertensione preesistente possono essere più sensibili agli effetti ipertesi. Monitorare la pressione sanguigna ogni 2 settimane fino a che non sia stabile, quindi mensilmente e regolare o avviare la terapia antiipertensiva per il mantenimento del controllo della pressione arteriosa durante la terapia. Se l'aumento della pressione sanguigna persiste, può essere necessaria l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • Con TAVALISSE possono verificarsi test elevati di funzionalità epatica (LFT), principalmente ALT e AST. Monitorare mensilmente le LFT durante il trattamento. Se ALT o AST aumentano a> 3 volte il limite superiore del normale, gestire l'epatotossicità usando l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • La diarrea si è verificata nel 31% dei pazienti e la diarrea grave si è verificata nell'1% dei pazienti trattati con TAVALISSE. Monitorare i pazienti per lo sviluppo di diarrea e gestirli utilizzando misure di terapia di supporto subito dopo l'insorgenza dei sintomi. Se la diarrea diventa grave (≥ 3 ° grado), interrompere, ridurre la dose o interrompere TAVALISSE.
  • La neutropenia si è verificata nel 6% dei pazienti trattati con TAVALISSE; neutropenia febbrile si è verificata nell'1% dei pazienti. Monitorare mensilmente l'ANC e l'infezione durante il trattamento. Gestire la tossicità con l'interruzione, la riduzione o l'interruzione di TAVALISSE.
  • TAVALISSE può causare danni al feto quando somministrato a donne in gravidanza. Consiglia alle donne in gravidanza il potenziale rischio per un feto. Consigliare alle donne in età fertile di usare un metodo contraccettivo efficace durante il trattamento e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose. Verificare lo stato di gravidanza prima di iniziare TAVALISSE. Non è noto se TAVALISSE o il suo metabolita siano presenti nel latte materno. A causa della possibilità di gravi reazioni avverse in un bambino allattato al seno, consiglia a una donna che allatta di non allattare durante il trattamento con TAVALISSE e per almeno 1 mese dopo l'ultima dose.

Interazioni farmacologiche

  • L'uso concomitante di TAVALISSE con potenti inibitori del CYP3A4 aumenta l'esposizione al principale metabolita attivo di TAVALISSE (R406), che può aumentare il rischio di reazioni avverse. Monitorare le tossicità che potrebbero richiedere una riduzione della dose di TAVALISSE.
  • Non è raccomandato l'uso di TAVALISSE con potenti induttori del CYP3A4, poiché l'uso concomitante riduce l'esposizione a R406.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di alcuni farmaci per substrato del CYP3A4 e può richiedere una riduzione della dose del farmaco per substrato del CYP3A4.
  • L'uso concomitante di TAVALISSE può aumentare le concentrazioni di farmaci substrato BCRP (ad es. Rosuvastatina) e farmaci substrato P-glicoproteina (P-gp) (ad esempio digossina), che possono richiedere una riduzione della dose del farmaco substrato BCRP e P-gp.

Reazioni avverse

  • Gravi reazioni avverse da farmaco negli studi in doppio cieco ITP sono state neutropenia febbrile, diarrea, polmonite e crisi ipertensiva, verificatesi nell'1% dei pazienti con TAVALISSE. Inoltre, si sono verificate gravi reazioni avverse tra cui dispnea e ipertensione (entrambi 2%), neutropenia, artralgia, dolore toracico, diarrea, vertigini, nefrolitiasi, dolore alle estremità, mal di denti, sincope e ipossia (tutto l'1%).
  • Reazioni avverse comuni (≥5% e più comuni rispetto al placebo) di FIT-1 e FIT-2 incluse: diarrea, ipertensione, nausea, vertigini, aumento di ALT e AST, infezione respiratoria, rash, dolore addominale, affaticamento, dolore toracico e neutropenia.

Consultare www.TAVALISSE.com per informazioni complete sulla prescrizione.

Per segnalare gli effetti collaterali dei farmaci da prescrizione alla FDA, visitare www.fda.gov/medwatch o chiamare il numero 1-800-FDA-1088 (800-332-1088).

TAVALISSE è un marchio commerciale di Rigel Pharmaceuticals, Inc.

Rigel Rigel (www.rigel.com)
Rigel Pharmaceuticals, Inc., è una società di biotecnologie dedicata alla scoperta, allo sviluppo e alla fornitura di nuovi farmaci a piccole molecole che migliorano significativamente la vita dei pazienti con disturbi immunitari ed ematologici, cancro e malattie rare. La ricerca pionieristica di Rigel si concentra su percorsi di segnalazione che sono fondamentali per i meccanismi delle malattie. Il primo prodotto approvato dalla FDA dell'azienda è TAVALISSE® (fostamatinib disodium hexahydrate), l'unico inibitore della tirosina chinasi (SYK) della milza orale, per il trattamento di pazienti adulti con trombocitopenia immunitaria cronica che hanno avuto una risposta insufficiente a un precedente trattamento. I programmi clinici di Rigel includono uno studio di fase 3 su fostamatinib nell'anemia emolitica autoimmune calda (AIHA); uno studio di fase 1 recentemente completato di R8351, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della chinasi (IRAK) associato al recettore dell'interleuchina; e uno studio di fase 1 in corso su R5521, una molecola proprietaria del suo programma inibitore della proteina chinasi (RIP) che interagisce con i recettori. Inoltre, Rigel ha prodotto candidati nello sviluppo clinico con i partner Aclaris Therapeutics, AstraZeneca, BerGenBio ASA e Daiichi Sankyo.

1Il prodotto per questo uso o indicazione è in fase di sperimentazione e non è stato dimostrato sicuro o efficace da alcuna autorità di regolamentazione.

Dichiarazioni previsionali
Questa versione contiene dichiarazioni previsionali relative, tra l'altro, al successo commerciale di TAVALISSE negli Stati Uniti .; La capacità di Rigel di ampliare la propria pipeline di risorse destinate a malattie immuno-mediate; Gli sforzi di Rigel per espandere fostamatinib in Europa e per espandere la sua forza vendita nei mercati chiave; Gli sforzi normativi e collaborativi di Rigel in Europa rendere fostamatinib disponibile per i pazienti ITP a livello globale; l'utilità di fostamatinib in altre indicazioni, inclusa l'anemia emolitica autoimmune calda; Capacità di Rigel di raggiungere traguardi di sviluppo e commerciali; I risultati operativi previsti di Rigel per il trimestre conclusosi e al 31 dicembre 2019, comprese le vendite nette e liquidità, equivalenti di cassa e investimenti a breve termine; aspettative legate all'opportunità di mercato di ITP nel mercato europeo e alla progettazione, tempistica, iscrizione e risultati degli studi clinici di Rigel. Qualsiasi affermazione contenuta nel presente comunicato stampa che non sia affermazione di fatti storici può essere considerata una dichiarazione previsionale. Parole come “obiettivi”, “potenziale”, “preliminare”, “può”, “si aspetta” ed espressioni simili intendono identificare queste affermazioni lungimiranti. Queste dichiarazioni previsionali si basano sulle aspettative attuali di Rigel e implicano intrinsecamente rischi e incertezze significativi. I risultati effettivi e la tempistica degli eventi potrebbero differire materialmente da quelli previsti in tali dichiarazioni previsionali a seguito di tali rischi e incertezze, che includono, senza limitazione, i rischi e le incertezze associati alla commercializzazione e alla commercializzazione di TAVALISSE; rischi che FDA, EMA o altre autorità di regolamentazione possano prendere decisioni avverse in merito a fostamatinib; rischi che gli studi clinici TAVALISSE potrebbero non essere in grado di prevedere i risultati del mondo reale o dei risultati negli studi clinici successivi; rischi che TAVALISSE possa avere effetti collaterali indesiderati, reazioni avverse o incidenti di uso improprio; la disponibilità di risorse per sviluppare i candidati al prodotto Rigel; concorrenza sul mercato; nonché altri rischi dettagliati di volta in volta nelle relazioni di Rigel depositate presso la Securities and Exchange Commission, compresa la relazione trimestrale sul modulo 10-Q per il periodo chiuso 30 settembre 2019. Rigel non si assume alcun obbligo di aggiornare le dichiarazioni previsionali e declina espressamente qualsiasi obbligo o impegno a rilasciare pubblicamente eventuali aggiornamenti o revisioni alle dichiarazioni previsionali contenute nel presente documento.

Contatto IR: David Burke
Telefono: 650.624.1232
E-mail: dburke@rigel.com

FONTE Rigel Pharmaceuticals, Inc.

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BRIDGEWATER, N.J., 13 gennaio 2020 / PRNewswire / – & nbsp; Bausch Health Companies Inc. (NYSE / TSX: BHC) e la sua attività di dermatologia, Ortho Dermatologics, una delle più grandi aziende sanitarie di dermatologia su prescrizione, hanno annunciato oggi che il Journal of Drugs in Dermatology (JDD) pubblicato risultati positivi da due grandi studi clinici di fase 3, multicentrici, in doppio cieco, controllati con placebo (studi 1 e 2) che dimostrano l'efficacia, la sicurezza e la tollerabilità di ARAZLOTM& nbsp; (tazarotene) Lozione, 0,045%, il primo tazarotene approvato dalla FDA in forma di lozione per pazienti con acne da moderata a grave.1 È stata anche pubblicata un'analisi post hoc di pazienti maschi nei due studi di Fase 3 JDD.2 La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato ARAZLO per il trattamento topico dell'acne vulgaris in pazienti di età pari o superiore a nove anni Dicembre 2019. “data-reactionid =” 13 “>BRIDGEWATER, N.J., 13 gennaio 2020 / PRNewswire / – Bausch Health Companies Inc. (NYSE / TSX: BHC) e la sua attività di dermatologia, Ortho Dermatologics, una delle più grandi aziende di assistenza sanitaria in dermatologia su prescrizione, ha annunciato oggi che il Journal of Drugs in Dermatology (JDD) pubblicato risultati positivi da due grandi studi clinici di fase 3, multicentrici, in doppio cieco, controllati con placebo (studi 1 e 2) che dimostrano l'efficacia, la sicurezza e la tollerabilità di ARAZLOTM (tazarotene) Lozione, 0,045%, il primo tazarotene approvato dalla FDA in forma di lozione per pazienti con acne da moderata a grave.1 È stata anche pubblicata un'analisi post hoc di pazienti maschi nei due studi di Fase 3 JDD.2 La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato ARAZLO per il trattamento topico dell'acne vulgaris in pazienti di età pari o superiore a nove anni Dicembre 2019.

Emil A. Tanghetti, M.D., capo investigatore e fondatore dello studio ARAZLO, Center for Dermatology and Laser Surgery, Sacramento, California. “Questi dati recentemente pubblicati mettono in luce l'utilità di ARAZLO, una nuova opzione di trattamento che presenta l'efficacia del tazarotene insieme a una migliore tollerabilità in un veicolo per lozioni, che è facilmente distribuibile ed esteticamente piacevole. Non vedo l'ora di offrire questo trattamento ai miei pazienti con l'acne nei prossimi mesi. “” data-reagid = “14”> “Nel trattamento dell'acne da moderata a grave, mi piace prescrivere un trattamento tazarotene a causa dell'efficacia del retinoide, ma trovo che i pazienti spesso lottano con problemi di tollerabilità, come la secchezza , pelle irritata “, ha detto Emil A. Tanghetti, M.D., capo investigatore e fondatore dello studio ARAZLO, Center for Dermatology and Laser Surgery, Sacramento, California. “Questi dati recentemente pubblicati mettono in luce l'utilità di ARAZLO, una nuova opzione di trattamento che presenta l'efficacia del tazarotene insieme a una migliore tollerabilità in un veicolo per lozioni, che è facilmente distribuibile ed esteticamente piacevole. Non vedo l'ora di offrire questo trattamento ai miei pazienti con l'acne nei prossimi mesi “.

1“data -eagid =” 15 “> Il primo endpoint primario negli studi cardine (Studi 1 e 2) è stato il successo del trattamento (definito come quelli con almeno un miglioramento di due gradi nel punteggio di gravità globale del valutatore (EGSS), e 'chiaro “o” pelle quasi chiara “) misurata alla settimana 12. I dati hanno mostrato che ARAZLO era più efficace, con il 25,5 percento e il 29,6 percento dei pazienti che avevano raggiunto il successo del trattamento rispetto al 13,0 percento e al 17,3 percento nei bracci placebo degli studi 1 e 2, rispettivamente (p <0,001 per entrambi gli studi).1

Bill Humphries, presidente, Ortho Dermatologics. “Non vediamo l'ora di lanciare il prodotto entro la fine dell'anno, fornendo ai dermatologi una minore concentrazione di lozione tazarotene che aiuta a eliminare efficacemente l'acne da moderata a grave.” “Data-reagid =” 18 “>” Questi dati, combinati con la nostra recente approvazione della FDA di ARAZLO, dimostrano il nostro costante impegno nel portare sul mercato le innovazioni terapeutiche che soddisfano le esigenze in continua evoluzione dei dermatologi e dei loro pazienti che lottano contro l'acne “, ha affermato Bill Humphries, presidente, Ortho Dermatologics. “Non vediamo l'ora di lanciare il prodotto entro la fine dell'anno, fornendo ai dermatologi una minore concentrazione di lozione tazarotene che aiuta a eliminare efficacemente l'acne da moderata a grave.”

La storia continua

I pazienti sono stati randomizzati a ricevere ARAZLO o lozione placebo e tutti i pazienti a cui è stato fornito il farmaco in studio sono stati inclusi nella popolazione intent-to-treat (ITT). Gli endpoint co-primari erano EGSS e riduzione assoluta del numero di lesioni infiammatorie e non infiammatorie. I pazienti che avevano avuto una riduzione di almeno due gradi dall'EGSS basale alla settimana 12 e un EGSS di “chiaro” o “quasi chiaro” sono stati considerati un successo del trattamento. Gli endpoint secondari includevano la variazione percentuale in entrambi i conteggi delle lesioni rispetto al basale ad ogni visita di studio e la variazione assoluta nei punteggi del dominio del questionario sulla qualità della vita specifica per l'acne (Acne-QoL). Sicurezza, eventi avversi (eventi avversi) e tollerabilità cutanea sono stati valutati durante lo studio.

gli Stati Uniti, che si verifica quando i follicoli piliferi vengono ostruiti con olio e cellule della pelle, causando la comparsa di punti bianchi, punti neri o brufoli su viso, fronte, petto, parte superiore della schiena e spalle.3,4 Fino a 50 milioni di americani hanno l'acne.3 A seconda della sua gravità, l'acne può causare disagio emotivo e cicatrici sulla pelle.4“data-reactionid =” 26 “>A proposito di acne vulgaris
L'acne è il problema di pelle più comune in gli Stati Uniti, che si verifica quando i follicoli piliferi vengono ostruiti con olio e cellule della pelle, causando la comparsa di punti bianchi, punti neri o brufoli su viso, fronte, petto, parte superiore della schiena e spalle.3,4 Fino a 50 milioni di americani hanno l'acne.3 A seconda della sua gravità, l'acne può causare disagio emotivo e cicatrici sulla pelle.4

  • ARAZLO può causare difetti alla nascita se usato durante la gravidanza.
  • Non devi essere incinta quando inizi a usare ARAZLO o rimani incinta durante il trattamento.
  • Utilizzare un efficace controllo delle nascite durante il trattamento.
  • Smetti di usare ARAZLO e informi immediatamente il medico se rimani incinta durante il trattamento.
  • ha eczema o altri problemi della pelle.
  • sta allattando o sta pianificando di allattare. Se usi ARAZLO durante l'allattamento, utilizzalo per il minor tempo necessario. Non applicare ARAZLO direttamente sul capezzolo e sull'area circostante per evitare di esporre il bambino al medicinale.
  • Evitare lampade solari, lettini abbronzanti e luce ultravioletta durante il trattamento con ARAZLO.
  • Ridurre al minimo l'esposizione alla luce solare; potresti avere gravi scottature.
  • Evitare di usare ARAZLO sulla pelle con eczema o pelle bruciata dal sole perché può causare gravi irritazioni.
  • Questi non sono tutti i possibili effetti collaterali di ARAZLO. Chiamate il vostro medico per un consiglio medico circa gli effetti collaterali. Puoi segnalare effetti collaterali a Bausch Health US, LLC al numero 1-800-321-4576 o FDA al numero 1-800-FDA-1088.

    Qui& nbsp; per informazioni complete sulla prescrizione, comprese le informazioni sul paziente. “data-reagid =” 54 “> Fai clic qui per informazioni complete sulla prescrizione, comprese le informazioni sul paziente.

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    Ortho Dermatologics è una delle più grandi aziende di dermatologia ed estetica su prescrizione dedicata ad aiutare i pazienti nel trattamento di una vasta gamma di aree terapeutiche, tra cui psoriasi, cheratosi attinica, acne, dermatite atopica e altre dermatosi. Il portafoglio di Ortho Dermatologics comprende diversi prodotti leader nel settore delle dermatosi sensibili all'acne, ai funghi e ai corticosteroidi. Ulteriori informazioni sono disponibili all'indirizzo www.ortho-dermatologics.com.

    www.bauschhealth.com. “data-reactionid =” 56 “>Informazioni su Bausch Health
    Bausch Health Companies Inc. (NYSE / TSX: BHC) è un'azienda globale la cui missione è migliorare la vita delle persone con i nostri prodotti sanitari. Sviluppiamo, produciamo e commercializziamo una gamma di prodotti farmaceutici, per dispositivi medici e da banco, principalmente nelle aree terapeutiche della salute degli occhi, della gastroenterologia e della dermatologia. Stiamo mantenendo i nostri impegni mentre costruiamo un'azienda innovativa dedicata a promuovere la salute globale. Ulteriori informazioni sono disponibili all'indirizzo www.bauschhealth.com.

  • Tanghetti EA, et al. Lozione Tazarotene 0,045% per il trattamento una volta al giorno dell'acne vulgaris da moderata a grave: risultati di due studi di fase 3. J Drugs Dermatol. 2020; 19 (1): DOI: 10,36,849 mila / JDD.2020.3977.
  • Cook-Bolden F, et al. Lozione Tazarotene 0,045% per il trattamento una volta al giorno dell'acne vulgaris da moderata a grave nei maschi adulti. J Drugs Dermatol. 2020; 19 (1): doi: 10,36,849 mila / JDD.2020.3979.
  • American Academy of Dermatology. (2019). Condizioni della pelle in base ai numeri. Estratto da https://www.aad.org/media/stats/conditions/skin-conditions-by-the-numbers. Accessed 6 gennaio 2020.
  • Mayo Clinic. (2018). Acne. Estratto da https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/acne/symptoms-causes/syc-20368047. Accessed 6 gennaio 2020.
  • Logo di Bausch Health (PRNewsfoto / Bausch Health Companies Inc.)

    http://www.prnewswire.com/news-releases/ortho-dermatologics-announces-publication-of-pivotal-phase-3-data-on-arazlo-tazarotene-lotion-0-045-in-the-journal- di-droga-in-dermatologico-JDD-300985477.html“data -eagid =” 116 “> Visualizza il contenuto originale per scaricare contenuti multimediali: http: //www.prnewswire.com/news-releases/ortho-dermatologics-announces-publication-of-pivotal-phase-3-data-on- arazlo-Tazarotene-lozione-0-045-in-the-journal-di-droga-in-dermatologico-JDD-300985477.html

    FONTE Bausch Health Companies Inc.

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    “When treating moderate to severe acne, I like to prescribe a tazarotene treatment due to the retinoid’s efficacy, but find patients often struggle with tolerability issues, such as dry, irritated skin,” said Emil A. Tanghetti , M.D., lead ARAZLO study investigator and founder, Center for Dermatology and Laser Surgery, Sacramento, Calif. “This newly published data sheds light on the utility of ARAZLO, a new treatment option that features the efficacy of tazarotene along with improved tolerability in a lotion vehicle, which is easily spreadable and aesthetically pleasing. I look forward to offering this treatment to my patients with acne in the coming months.”

    “These data, combined with our recent FDA approval of ARAZLO, demonstrate our continued commitment to bringing treatment innovations to market that meet the ever-evolving needs of dermatologists and their patients who struggle with acne,” said Bill Humphries , president, Ortho Dermatologics. “We look forward to launching the product later this year, providing dermatologists with a lower concentration of tazarotene lotion that helps effectively clear moderate to severe acne.”

    Story continues

    Patients were randomized to receive ARAZLO or placebo lotion, and all patients who were provided the study drug were included in the intent-to-treat (ITT) population. The co-primary endpoints were EGSS and absolute reduction in inflammatory and non-inflammatory lesion counts. Patients who had at least a two-grade reduction from baseline EGSS at week 12, and an EGSS of ‘clear’ or ‘almost clear’ were considered a treatment success. Secondary endpoints included percent change in both lesion counts from baseline at each study visit and absolute change in Acne-Specific Quality of Life questionnaire (Acne-QoL) domain scores. Safety, adverse events (AEs) and cutaneous tolerability were evaluated throughout the study.

  • ARAZLO may cause birth defects if used during pregnancy.
  • You must not be pregnant when you start using ARAZLO or become pregnant during treatment.
  • Use effective birth control during treatment.
  • Stop using ARAZLO and tell your healthcare provider right away if you become pregnant during treatment.
  • have eczema or any other skin problems.
  • are breastfeeding or plan to breastfeed. If you use ARAZLO while breastfeeding, use it for the shortest time needed. Do not apply ARAZLO directly to the nipple and surrounding area to avoid exposing your child to the medicine.
  • You should avoid sunlamps, tanning beds, and ultraviolet light during treatment with ARAZLO.
  • Minimize exposure to sunlight; you could get severe sunburn.
  • Avoid using ARAZLO on skin with eczema or sunburned skin because it may cause severe irritation.
  • These are not all the possible side effects of ARAZLO. Call your doctor for medical advice about side effects. You may report side effects to Bausch Health US, LLC at 1-800-321-4576 or FDA at 1-800-FDA-1088.

    here for full Prescribing Information, including Patient Information.” data-reactid=”54″>Please click here for full Prescribing Information, including Patient Information.

    www.ortho-dermatologics.com.” data-reactid=”55″>About Ortho Dermatologics
    Ortho Dermatologics is one of the largest prescription dermatology and aesthetics businesses dedicated to helping patients in the treatment of a range of therapeutic areas, including psoriasis, actinic keratosis, acne, atopic dermatitis and other dermatoses. The Ortho Dermatologics portfolio includes several leading acne, anti-fungal and corticosteroid-responsive dermatoses products. More information can be found at www.ortho-dermatologics.com.

    www.bauschhealth.com.” data-reactid=”56″>About Bausch Health
    Bausch Health Companies Inc. (NYSE/TSX: BHC) is a global company whose mission is to improve people’s lives with our health care products. We develop, manufacture and market a range of pharmaceutical, medical device and over-the-counter products, primarily in the therapeutic areas of eye health, gastroenterology and dermatology. We are delivering on our commitments as we build an innovative company dedicated to advancing global health. More information can be found at www.bauschhealth.com.

  • Tanghetti EA, et al. Tazarotene 0.045% Lotion for Once-Daily Treatment of Moderate-to-Severe Acne Vulgaris: Results from Two Phase 3 Trials. J Drugs Dermatol. 2020;19(1): doi:10.36849/JDD.2020.3977.
  • Cook-Bolden F, et al. Tazarotene 0.045% Lotion for the Once-Daily Treatment of Moderate-to-Severe Acne Vulgaris in Adult Males. J Drugs Dermatol. 2020;19(1): doi:10.36849/JDD.2020.3979.
  • American Academy of Dermatology. (2019). Skin conditions by the numbers. Retrieved from https://www.aad.org/media/stats/conditions/skin-conditions-by-the-numbers. Accessed Jan. 6, 2020 .
  • Mayo Clinic. (2018). Acne. Retrieved from https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/acne/symptoms-causes/syc-20368047. Accessed Jan. 6, 2020 .
  • Bausch Health logo (PRNewsfoto/Bausch Health Companies Inc.)

    http://www.prnewswire.com/news-releases/ortho-dermatologics-announces-publication-of-pivotal-phase-3-data-on-arazlo-tazarotene-lotion-0-045-in-the-journal-of-drugs-in-dermatology-jdd-300985477.html” data-reactid=”116″>View original content to download multimedia:http://www.prnewswire.com/news-releases/ortho-dermatologics-announces-publication-of-pivotal-phase-3-data-on-arazlo-tazarotene-lotion-0-045-in-the-journal-of-drugs-in-dermatology-jdd-300985477.html

    SOURCE Bausch Health Companies Inc.

    http://www.newswire.ca/en/releases/archive/January2020/13/c4192.html” data-reactid=”135″>View original content to download multimedia: http://www.newswire.ca/en/releases/archive/January2020/13/c4192.html

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    Affari e finanziamenti

    Apollomics di Hangzhou ha annunciato un accordo da 189 milioni di dollari per lo sviluppo di due nuove immunoterapie basate su E-selectina basate su GlycoMimetics (NASDAQ: GLYC) in Cina per la leucemia. L'apollomica, che è stata incubata da OrbiMed Asia, sarà responsabile dello sviluppo di upsolesanan e GMI-1687 nella Cina continentale, Hong Kong, Macao e Taiwan. GlycoMimetics riceverà un pagamento anticipato di $ 9 milioni e potrà beneficiare di $ 180 milioni di pietre miliari più royalties. Apollomics sta sviluppando cinque risorse: due nuovi mAb che ripristinano il sistema immunitario del corpo insieme a tre terapie che mirano ai percorsi di segnalazione della crescita.

    Zhiyun Health, un'azienda sanitaria online focalizzata sulla gestione del diabete, ha raccolto $ 142 milioni in un round combinato C + e D. Fondata nel 2014 da Kuang Ming, laureato all'Università di Cambridge, Zhiyun offre servizi di gestione della salute online completi, tra cui un'app che consente ai pazienti diabetici di registrare e tenere traccia dei propri dati sanitari. L'app offre consulenza da parte di medici e interazione visiva, consentendo ai medici di regolare i regimi di trattamento mentre il sito fornisce consigli su farmaci, dieta, esercizio fisico e centri commerciali online. Zhiyun ha raccolto oltre $ 280 milioni in nove finanziamenti.

    IOVaxis Therapeutics (OSE: TRVX) di Nantong ha acquisito un'opzione per ottenere in licenza maggiori diritti cinesi per due vaccini terapeutici RAS mutanti Targovax, TG01 e TG02. Se l'opzione viene esercitata, IOVaxis pagherà in anticipo $ 3 milioni per la licenza e Targovax, una società norvegese, avrà diritto a un massimo di $ 100 milioni in pietre miliari, oltre a royalties a doppia cifra. Le mutazioni della RAS si riscontrano in oltre il 90% dei casi di carcinoma del pancreas, nel 50% dei tumori del colon-retto e nel 20-30% di tutti i tumori. Targovax prevede che i suoi vaccini indurranno le risposte immunitarie delle cellule T in pazienti affetti da cancro con mutazioni RAS.

    Transcenta Holding di Suzhou ha completato un finanziamento di serie B + da $ 100 milioni per supportare le sue 10 molecole innovative in oncologia, disturbi ossei e nefrologia. L'anno scorso, Transcenta è stata costituita dalla fusione di Hangzhou Just Bio e MabSpace e la società ha concesso in licenza un portafoglio di nuovi bioterapici per malattie ossee di Eli Lilly (NYSE: LLY) tra cui Bloxozumab, un trattamento per l'osteoporosi che ha completato i test di Fase II. Da allora, ha adottato il processo continuo integrato e la produzione nel suo impianto di produzione di Hangzhou. CR-CP Life Science Fund e Fortune Capital hanno co-guidato il round B +.

    Adagene, una società di immunoterapia di Suzhou, ha raccolto $ 69 milioni in un finanziamento di serie D, di cui $ 50 milioni dall'investitore principale General Atlantic. L'azienda combina biologia computazionale e intelligenza artificiale per progettare nuovi anticorpi. Ritiene che la sua piattaforma offra nuovi bersagli drogabili e una maggiore precisione di legame, risultando in una pipeline di nuovi programmi di immunoterapia con potenziale primo o migliore della classe. La molecola di piombo di Adagene, ADG106, è un anticorpo IgG4 monoclonale anti-CD137 in fase di sperimentazione in studi di fase I su tumori solidi e liquidi. Dal 2014 Adagene ha raccolto oltre 150 milioni di dollari di capitale di rischio.

    L'ASK Pharm (Beijing Aosaikang Pharmaceutical) di Nanchino (SHZ: 002755) ha annunciato un accordo da $ 51 milioni per maggiori diritti della Cina su un trattamento per la carenza di ferro da Shield Therapeutics (OTCPK: SHIEF) del Regno Unito. Shield Feraccru / Accrufer è una terapia orale non salina con un nuovo meccanismo di assorbimento che era efficace quanto un trattamento IV standard per la condizione. CHIEDERE $ 11 milioni in anticipo per i diritti della Cina e verserà fino a $ 40 milioni in pagamenti milestone, oltre a royalties. Sarà responsabile di tutto lo sviluppo della Cina e avrà i diritti di fabbricazione del prodotto.

    3D Med Diagnosis, un recente spin-off diagnostico di 3D Medicines, ha raccolto $ 40 milioni nel suo finanziamento di debutto. 3D Medicines è stata fondata nel 2010 per concentrarsi sulla cura del cancro delle tre D: diagnostica, farmaci e dati. 3D Med Diagnosis possiede il portafoglio diagnostico dell'azienda che offre sequenziamento di nuova generazione per la diagnosi precoce del cancro e la diagnosi di medicina di precisione. La diagnostica del cancro include test genomici di istologia, biopsie liquide ctDNA e una biopsia liquida esosomiale. Il finanziamento è stato guidato dal China Investment Pharmaceutical Industry Investment Fund.

    RootPath, Cambridge, MA, biotecnologia con due siti di ricerca e sviluppo in Cina, ha chiuso un round della Serie A da 11 milioni di dollari per sviluppare una piattaforma che identifica i recettori delle cellule T reattive al tumore (TCR) altamente personalizzati per i tumori solidi del tumore. La piattaforma di immunologia sintetica dell'azienda utilizza uno screening ad altissima produttività per generare e selezionare TCR che diventano terapie personalizzate per le cellule T e saranno accessibili per individui o piccoli gruppi. RootPath ritiene che la sua tecnologia, che combina la medicina di precisione con l'immunoterapia, renderà efficaci le terapie cellulari nei tumori solidi del tumore.

    CarrierGene Biotech, una società di Suzhou che sviluppa test diagnostici riproduttivi, si è fusa con NuProbe Global di Cambridge, MA, una nuova società di diagnostica. Mr. Yingshuang Chai, co-fondatore ed ex CEO di CarrierGene, sarà CEO e Presidente del consiglio di amministrazione NuProbe. BioTrack Capital di Shanghai ha effettuato un investimento di dimensioni non specificate nella società incorporata per supportare la sua ricerca e sviluppo. La nuova società, che ha laboratori di ricerca e sviluppo a Houston e Shanghai e uno stabilimento di produzione GMP a Suzhou, opererà con il marchio inglese NuProbe Global e il marchio cinese Yue Er.

    Prove e approvazioni

    Bio-Thera Solutions, un biopharma di Guangzhou, ha riferito che il suo biosimilare Humira (adalimumab) è stato approvato per l'uso in Cina. Qletli, il primo prodotto Bio-Thera approvato per la commercializzazione e il secondo biosimilare approvato dalla NMPA cinese, è indicato per il trattamento di tre malattie autoimmuni: l'artrite reumatoide, la spondilite anchilosante e la psoriasi a placche. All'inizio del 2019, il biosimilare di Henlius al Rituxan (rituximab) di Genentech è stato approvato in Cina per il trattamento del linfoma non Hodgkin. Bio-Thera sta sviluppando un portafoglio di molecole biosimilari e innovative per l'immuno-oncologia e le malattie autoimmuni.

    Lo Zai Lab di Shanghai (NASDAQ: ZLAB) ha iniziato ad arruolare pazienti in uno studio di Fase II in Cina di Optune, il suo dispositivo Tumor Treating Fields, in combinazione con la chemioterapia per il trattamento dell'adenocarcinoma gastrico. La tecnologia TTF è un dispositivo indossabile che utilizza campi elettrici sintonizzati su frequenze specifiche per interrompere la divisione cellulare, inibendo la crescita tumorale e potenzialmente causando la morte delle cellule tumorali. In precedenza, Zai ha richiesto l'approvazione cinese della tecnologia come trattamento per il glioblastoma multiforme. Nel 2018, Zai ha pagato $ 15 milioni in anticipo per ottenere in licenza maggiori diritti cinesi per il dispositivo Optune di NovoCure (NASDAQ: NVCR) di Jersey.

    Suzhou Innovent Bio (HK: 01801) metterà alla prova una combinazione del suo approvato anti-PD-1, Tyvyt, con il candidato principale dell'RNAi STP705 (cotsiranib) di Sirnaomics per trattare i tumori solidi del tumore, in particolare i carcinomi epatocellulari (HCC). Tyvyt è approvato in Cina per il linfoma Hodgkin classico r / r. STP705 di Sirnaomics utilizza una consegna potenziata con nanoparticelle di polipeptidi (PNP) per abbattere l'espressione genica di TGF-β1 e COX-2. STP704 è in fase di test in Cina e negli Stati Uniti per il trattamento del colangiocarcinoma, del carcinoma cutaneo non melanoma e della cicatrice ipertrofica.

    Gracell Biotech, una società di Suzhou che sviluppa nuove terapie CAR-T, ha avviato una sperimentazione clinica di GC027, una terapia che utilizza la sua tecnologia TruUCAR CAR-T standard per trattare i pazienti con forme aggressive di leucemia linfoblastica acuta (TUTTI) . GC027 è costituito da cellule T di donatori sani, geneticamente modificate inserendo un recettore chimerico dell'antigene (CAR) ex vivo per legare ed eliminare le cellule T maligne bersaglio. GC027 utilizza l'editing del genoma CRISPR, che dovrebbe evitare la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD) e il rigetto del trapianto.

    CStone Pharma (HK: 2616) di Suzhou e Blueprint Medicines di Boston (NASDAQ: BPMC) hanno avviato uno studio di fase cinese Ib / II che combina una terapia di precisione con un'immunoterapia per trattare il carcinoma epatocellulare. Lo studio testerà il fisogatinib di Blueprint, un inibitore del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 4 (FGFR4), insieme al mAb anti-PD-L1 di CStone. In studi preclinici, il fisogatinib ha stimolato l'infiltrazione delle cellule T nel microambiente tumorale, il che suggerisce che la combinazione fisogatinib / PD-L1 può essere utile per i pazienti con HCC guidato da FGFR4. Nel 2018, CStone ha firmato un accordo da $ 386 milioni per i diritti della Cina a tre candidati di oncologia Blueprint.

    Yisheng Biopharma di Pechino ha annunciato una collaborazione con il Tavotek Bio del Maryland per sviluppare nuovi anticorpi multi-specifici per immunoterapia. In particolare, le due società hanno in programma di co-sviluppare terapie combinate di Yisheng YS-ON-001/002 e Tavo-Tavo-301/303 per il trattamento del cancro. YS-ON-001/002 sono candidati immunoterapici basati sulle vie di segnalazione TLR3 / RIG-I / MDA-5 della tecnologia PIKA. Tavo-301/303 è una serie di nuovi mAb immunoterapici multi-specifici sviluppati utilizzando la piattaforma TavoSelect proprietaria di Tavotek.

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    Nota dell'editore: I punti di sintesi per questo articolo sono stati scelti dagli editori di Seeking Alpha.

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    MANILA, Filippine – Se c'è una cosa di cui non rimpiango l'accumulo (a parte i reperti non letti della fiera del libro), sono gli oli essenziali.

    Oilbularyos sa cosa succede: impazziamo per le più recenti miscele e oli EO, con il prurito di avvicinare i nostri nasi al più nuovo aroma che aiuta il mal di testa e un profumo salvaspazio. Non posso stare senza uno (o due .. o tre …) nella mia borsa, sia che lavori a casa, in ufficio o in viaggio. Mi considereresti un oleolico? Vorrei.

    Hai i pruriti? Una tosse? Emicrania Pensieri nebbiosi? Sonno irrequieto? C'è una soluzione aromaterapica per questo. Un po 'di sfregamento sulle tempie, un profondo fiuto dai palmi delle mani – e all'improvviso, l'olio sta bene. (LEGGI: ​​La guida per principianti agli olii essenziali)

    Questa alternativa completamente naturale è un genio in una bottiglia per molti, quindi ecco alcuni marchi locali e internazionali da esplorare e annusare in negozio e online. Con questi balsami, oli e miscele completamente naturali, la magia può essere trovata proprio sotto il nostro naso – letteralmente. Balsami via!

    Zenutrients

    Questo marchio locale di proprietà della famiglia è cresciuto dal loro amore per l'olio di cocco vergine. Zenutrients hanno scoperto che l'olio di cocco è un elisir magico per la psoriasi, le eruzioni cutanee e altri problemi di pelle e capelli dei loro bambini, quindi comprensibilmente, hanno scelto le noci di cocco per questo tesoro di Pinoy, creando la propria linea benessere.

    Oli da massaggio, saponi, shampoo, scrub, lozioni, lo chiami – sono lì – e, naturalmente, le loro miscele e balsami di olio essenziale.

    Avviso best-seller: potente, portatile All Is Well Balm (P248) è uno dei miei preferiti (non scherzo, mi sorprenderò ad annusare da questa vasca come un drogato almeno una volta al giorno); una tregua di sollievo dai miei occasionali vertigini o rinite allergica.

    Come con la maggior parte dei balsami e degli oli, o strofino All Is Well sui palmi delle mani, mi coppa le mani e inspiro (questo si chiama “aroma dome”), lo applico sulle tempie o sulla nuca o lo uso come uno strofinamento sul petto per congestione. È ottimo anche per i muscoli doloranti e abbastanza corroborante da svegliarmi durante i giorni stressanti e assonnati.

    Puoi anche optare per il All Is Well Oil Roll-On (P140), se il modulo roll-on è più facile per te. C'è anche il mentolo Muscle Oil Roll-On (P140) per dolori doloranti post-esercizio e Olio di zenzero roll-on (P140) sia per l'olfatto che per il corpo, che è una variante di menta ma più piccante.

    Per problemi di pelle, prova il loro multiuso Balsamo all'olio di cocco vergine (P218), una vasca delle cose semplici e buone, la migliore per pelle secca, eczema, eruzioni cutanee e psoriasi.

    Per un'opzione più mite, c'è il Balsamo per bambini (P248), una crema idratante delicata per dermatite da pannolino, pelle sensibile, molto secca e labbra screpolate.

    Puoi controllare gli altri prodotti di Zenutrients su Instagram.

    Profumi reali

    Profumi reali è un marchio nostrano, fondato da mamme domestiche aziendali che vogliono illuminare il loro tempo a casa con i bambini.

    I loro prodotti di fragranze sono tutti realizzati con oli essenziali puri, privi di ftalati (plastificanti) e ingredienti dannosi, e sono curati per “elevare” lo spazio con profumi freschi.

    Profumi reali spray per ambienti e biancheria (P249) sono formulazioni originali con diverse “personalità” come la loro Naturali rilassanti, una miscela calmante di lavanda, menta piperita ed eucalpito. Mi piace spruzzarlo sulla mia camera da letto e sui miei cuscini prima di andare nel mondo dei sogni.

    Mi piace convertire anche il nostro salotto in una torta di mele appena sfornata con la famiglia Zucchero e spezie spray, un profumo che potresti voler mangiare (per favore, non farlo), preparato con mela dolce e oli di cannella speziati. Altri spray includono il Beach Escape (un odore fresco e luminoso), Bambù (pulito e nitido), Mattine luminose (piccante, dolce) e il Casa di charme (fruttato, floreale).

    Gli spray sono disponibili anche in 10 ml oli profumati (P179) anche, e può essere utilizzato per diffusori di aromi, diffusori reed, bruciatori e scaldabagni. Se stai cercando oli puri, i veri profumi oli essenziali (P199) linea fornisce le basi per i principianti: eucalpito, menta piperita e lavanda, tra gli altri.

    Puoi dare un'occhiata ai veri profumi su Instagram! Puoi anche visitarli presso le filiali di The Common Room.

    Opzioni salutari

    Sapevi che la drogheria per la salute e il benessere dei nostri sogni immaginari trasporta una varietà di marchi di oli essenziali?

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Healthy Options vende il Aura Cacia Oil Discovery Kit (P1375), un set di 4 oli essenziali per principianti – lavanda, menta piperita, eucalipto e tea tree – oltre a una guida di apprendimento su come usarli e mescolarli.

    Li vendono anche in singoli, come il Aura Cacia Rosemary (P1275) di origine sudafricana, che è un profumo meno intenso, più morbido, erbaceo, ideale per i capelli e la cura della pelle. Il suo profumo chiarificante aiuta anche con chiarezza e concentrazione mentale.

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Abbiamo sentito che l'olio dell'albero del tè è buono anche per le imperfezioni, quindi prendi a Raccolta ecologica dell'olio dell'albero del tè del deserto (P595), l'antisettico naturale che aiuta a ridurre l'infiammazione e il rossore.

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Le opzioni salutari hanno anche gli stimolanti Scentuals Oil Relax and Destress Set (P995), che viene fornito con 3 oli delicati: lavanda, arancia dolce e legno di cedro.

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Foto per gentile concessione di Healthy Options

    Preferirli come roll-on? Grida al pratico dandy Scentuals For The Body Set regalo roll-on (P995) e le sue 3 miscele di olio roll-on per dolori muscolari, mal di testa e problemi del sonno.

    Questi oli sono disponibili presso le filiali Healthy Options a livello nazionale. Per ulteriori informazioni, puoi visitare la pagina Instagram di Healthy Options.

    Auntiedote

    Dal produttore televisivo al confessato sostenitore di EO, la zia ha lasciato una vita di stress per la vita degli oli essenziali (non posso dire che la biasimiamo!) Auntiedote racchiude in sé un benessere naturale e in movimento per i momenti malati, stressati e non complicati in un packaging in movimento, elegante e minimalista.

    Auntiedote di facile da applicare Roller antistress (P300-10ml) è una miscela rilassante ma radicata di lavanda, arancia dolce, legno di cedro e incenso. Inoltre viene in una forma inalatoria conveniente, come il Inalatore di emicrania (P100), un mix detergente di incenso, bergamotto, lavanda e legno di cedro.

    Cavalcato con allergie? Auntiedote di Balsamo per la tosse e il naso (P100-10g, P300-50g) è un leggero sfregamento di eucalpito destinato a eliminare le muffe. Dolori muscolari e dolori articolari? Il Balsamo allo zenzero (P100-10g, 50g: P350-50g) può aiutare con l'uso quotidiano!

    Per graffi, tagli o ustioni, il multiuso Balsamo nero (P250-10g) può anche aiutare – è fatto con carbone attivo, calendula, argilla bentonitica, cera d'api, tea tree e lavanda.

    Puoi controllare gli altri articoli di Auntiedote su Instagram.

    Luna Maia

    Da non perdere Luna Maia's oggetti sullo scaffale: questi rulli sottili sono confezionati in una bellezza oro-bronzo. Ma è quello che c'è dentro che conta, giusto? Le miscele di olii curati di Luna Maia sono altrettanto piacevoli.

    Luna Maia fu costruita da una donna che cercava uno scopo durante una crisi di mezza età. Ha trovato un nuovo significato nella vita attraverso le proprietà curative degli olii essenziali, quindi è stata trovata Luna Maia.

    È tutto naturale Miscele Essential Roller (P399-10ml) servire a scopi diversi, come il Headache Helper, Dormi bene, e un preferito personale: il Mood Boost, un gusto vivace, energizzante, fatto con olio di mandorle dolci.

    Ti senti congestionato? Luna Maia ha un Breathe Easy Balm (P359), un emolliente delicato a base di cera d'api al 100%, olio di cocco vergine ed EO puri. Strofina sul petto o sotto il naso! Altri tipi di balsamo includono Rilievo della pelle e Via il dolore.

    Che ne dici di miscele per uomini? Luna Maia ne conosce la mancanza e ha curato una confezione in latta tascabile di due miscele da 5 ml per uomo: il Sollievo postumi di una sbornia e Sollievo dal dolore muscolare per P599.

    E se stai andando fuori città, non lasciare che le cimici dei non letti mordano! Luna Maia ha soluzioni completamente naturali per quei parassiti: il sicuro sulla pelle Spray per punture di insetti 50 ml (P329), che può anche raddoppiare come uno spray profumato per ambienti, e il Bug Bite Oil 10 ml (P399) per prurito alle punture di zanzara.

    Puoi ottenere il potere repellente di Luna Maia e il profumo profumato tramite la cera d'api al 100% Candela per aromaterapia (P299) anche a base di citronella e menta piperita.

    Puoi controllare il resto di Luna Maia online, presso le filiali della Sala Comune e Frankies and Friends.

    Risciacqua e ripeti

    Risciacqua e ripeti deve l'amore del proprietario per il sole, il surf e i suoi due gattini, Kitten e Mitten. Dai un'occhiata all'adorabile confezione: come puoi resistere a quei simpatici scarabocchi di gatto? Inoltre, la sua difesa di articoli pratici, riutilizzabili, a basso spreco e facili da usare sono un vantaggio!

    Risciacquare e ripetere Miscele di oli essenziali per l'umore 10ml (P280) non è difficile innamorarsi di nessuno dei due: sono utiliesaltatori di umore “sono qui per darti ciò di cui hai bisogno: dove è Sunshine liquido, gestione della rabbia, aumento del cervello, un abbraccio in una bottiglia, o fiorito, sognante Dormire miscela, realizzata con oli di lavanda e ylang-lang.

    Anche andare senza plastica? Rinse and Repeat offre anche shampoo bar senza balsamo, balsami e batuffoli di cotone riutilizzabili. Dai un'occhiata agli altri articoli su Instagram!

    The Olie Mixte

    Olie Mixte è un'impresa di oli essenziali fatta in casa che si avvale degli oli e delle miscele del marchio internazionale Young Living per creare la propria linea di comodi rulli per olio.

    Foto per gentile concessione di The Olie Mixte

    Foto per gentile concessione di The Olie Mixte

    I loro oli essenziali vanno per P129 (1 ml), P189 (5 ml) e P309 (10 ml), e soddisfare una varietà di occasioni, come il calmante Buona notte miscela (lavanda e incenso), energizzante Buongiorno (limone e menta piperita) miscela, il Tummy Tamer (usa l'olio Digize di YL), il Mal di testa (lavanda, menta piperita e incenso), Sollievo dal dolore (usa la mentalità di YL Panaway e il potente olio Valor) e il Rilassa Lang (limone, stress e valore).

    Puoi dare un'occhiata a Olie Mixte su Instagram.

    Pili Ani

    Pili Ani fai uso di pili ed olio di elemi biologici e locali, il che è una buona notizia: applicare quella miscela EO sulla tua pelle colpisce quasi tutti gli uccelli del benessere e della bellezza con una fava!

    Pili Ani presenta 5 principali miscele EO. Se non riesci a decidere quale, perché non ottenere tutto? Il Kit da viaggio per miscele di oli essenziali (P1350) trasporta tutti e 5 in un comodo pacchetto – Sogni d'oro, Bug Me Not, Stress Away, Breathe Easy, Rise and Shine.

    Puoi anche ottenerlo singolarmente all'indirizzo 6 ml per P265 e 10 ml per P375. Un solo fiuto e adorerai la potenza delle miscele di Pili. Prendi il Distogliere lo stress per esempio – il suo mix rigenerante di eucalipto, zenzero, cipresso, ginepro e mentolo risveglierà sia il cervello stanco che i muscoli doloranti.

    Anche alzarsi dal letto è reso leggermente più sopportabile con il Rise and Shine miscela, un profumo corroborante simile a entrare in un giardino fresco, grazie ai suoi oli di verde invernale, eucalipto, buccia d'arancia, limone e levender.

    Stai andando a letto? Strofina un po ' Sogni d'oro olio su nuca e tempie e inala una delicata miscela floreale di lavanda, bergamotto, basilico e ylang-ylang prima che la testa colpisca il cuscino.

    Puoi controllare gli altri articoli di Pili Ani su Instagram. – Rappler.com

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    Kim Kardashian potrebbe essere diventato famoso grazie alla E della sua famiglia! reality show Stare al passo con i Kardashians, ma da allora, ha creato un enorme impero di bellezza e shapewear, è diventata una mamma di quattro figli con il marito Kanye West, e attualmente sta studiando per diventare avvocato (ne parleremo più avanti). La sua vita è piena di cose buone, e nel corso degli anni ha condiviso i suoi consigli e trucchi per rimanere sana, felice e sana. Ecco 40 delle sue migliori abitudini di salute.

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    Si attiene a una dieta a base vegetale.

    “Vivo una vita sana e cerco di mangiare il più possibile a base vegetale e bere frullati di muschio di mare”, ha detto in precedenza Poosh.

    2

    Lei trova il tempo per se stessa.

    “Con tutto lo stress della vita, cerco di assicurarmi di prendermi del tempo per me stesso in modo da essere concentrato e ridurre al minimo lo stress”, ha detto in precedenza Poosh.

    3

    Rimane in cima alla sua malattia autoimmune.

    A Kim è stata diagnosticata la psoriasi a 13 anni e l'anno scorso le è stata diagnosticata l'artrite psoriasica.

    “È ancora doloroso e spaventoso, ma ero felice di avere una diagnosi. Indipendentemente dalle condizioni autoimmuni che avevo, lo avrei superato e sono tutti gestibili con le dovute cure”, ha detto Poosh.

    4

    Si concede il suo dessert preferito: il gelato.

    Kim crede nella moderazione e nel trattamento di se stessa. “Haagen-Dazs è la mia più grande indulgenza: il loro sapore Dulce de Leche è la mia cosa preferita nella vita”, Kim ha condiviso tramite E! Notizia.

    5

    Ha un trainer super-fit.

    Il suo nome è Melissa Alcantara e se la segui su Instagram @fitgurlmel, è chiaro perché Kim si fida di lei per metterla in forma fantastica.

    6

    Trascorre molto tempo sui suoi allenamenti.

    “Quando si tratta di bottino e gambe, di solito ci alleniamo da un'ora e mezza a un'ora e 45 minuti”, ha detto Alcantara in precedenza La salute delle donne. “Vuoi allenarti in modo efficiente ed essere intelligente al riguardo.”

    7

    È in palestra sei giorni alla settimana.

    8

    Fa delle pause in palestra.

    Kim ha condiviso sul suo Instagram che, ogni sei mesi, prenderà una pausa di due settimane in palestra.

    Ha detto: “Siamo tornati in palestra pesante! Direi che ogni sei mesi mi prendo due settimane di riposo dal sollevamento. A volte hai solo bisogno di una pausa per ricaricare e rilassarmi, ma poi mi manca così tanto e mi sento così bene di nuovo “.

    9

    Pratica la moderazione.

    Indipendentemente dalla dieta a cui sta cercando di attenersi, Kim ha sempre amato lo zucchero. Kim ha detto E! notizia nel 2010, “Adoro le caramelle. Adoro i biscotti. Adoro molto e cerco solo di controllarmi!”

    10

    Prende sul serio la sua cura della pelle.

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    Pensa alla nutrizione post-allenamento.

    Kim ha condiviso la sua app a pagamento nel 2018, tramite Harper's Bazaar: “Il mio allenatore Mel dice sempre che prima e dopo l'allenamento, dovresti mangiare carboidrati semplici, come patate dolci e piccole quantità di grassi e proteine, come il pollo. Dovresti anche avere verdure con i tuoi pasti, poiché hai bisogno di loro per aiutarti efficacemente abbattere e assorbire proteine, grassi e carboidrati “.

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    Mangia un pranzo salutare.

    Kim di solito pranza alle 13:00 “Preferisco che lo chef prepari il mio pranzo perché sarà più salutare”, ha ammesso. “Ultimamente è stato pesce e verdure, o pollo e verdure – qualcosa del genere”, ha condiviso via E! Notizia.

    13

    Si concentra sulle piccole cose del suo matrimonio.

    “È molto semplice”, secondo quanto riferito Kim ha pubblicato nel numero di novembre Stellare rivista, via Elite Daily. “Se gli porto un brownie caldo e un gelato, è molto felice, e questo mi farà guadagnare punti per una buona settimana … E mi lascia guardare i miei programmi TV che voglio di notte … Anche quando vuole guardare Rick And Morty tutta la notte e io voglio guardare Dateline, mi lascia guardare Dateline“.

    14

    Ha ascoltato il suo corpo durante le sue gravidanze.

    Kim ha avuto complicazioni con le sue prime gravidanze, tra cui pre-eclampsia ad esordio precoce e placenta accreta, una condizione imprevedibile che si verifica quando la placenta si attacca troppo in profondità nella parete dell'utero e può causare gravi emorragie.

    Kim ha detto che due medici le hanno detto che non sarebbe stata sicura per lei rimanere incinta per la terza volta (e ha finito per avere un surrogato per Salmo e Chicago).

    15

    Dedica interi allenamenti a lavorare sul suo core.

    16

    È super in allenamento con i pesi.

    L'allenatore di Kim in precedenza aveva detto a WH: “L'85% del nostro allenamento è l'allenamento con i pesi e gli altri 15 sono costituiti da cardio”.

    17

    Non annulla mai un allenamento.

    “Adora portare i suoi figli a scuola. È una mamma tosta. È super responsabile, non annulla mai, è la migliore cliente e atleta che puoi avere”, ha detto Alcantara in precedenza WH. “È solo la sua spinta”, dice l'allenatore delle celebrità. “Sa cosa vuole e deve adattarsi. È come, 'Devo allenarmi, questo fa parte della mia vita', è tutto basato sulla mentalità.”

    18

    Arriva in palestra molto presto.

    “Il suo programma è pazzo, e anche il mio è pazzo, quindi ci alleniamo molto presto la mattina alle 6 del mattino”, dice Alcantara.

    19

    Continua la sua educazione.

    Kim ha rivelato nel 2019 che sta lavorando per conseguire la laurea in legge.

    Attualmente sta facendo un apprendistato presso uno studio legale di San Francisco. È lungo quattro anni, quindi spera di sostenere l'esame di avvocato nel 2022.

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    Trova equilibrio nel suo matrimonio.

    Kim ha parlato del suo matrimonio con Kanye ELLE nel 2018, e disse: “Mi ha insegnato ad avere più di un'opinione. Gli ho insegnato a essere un po 'più calmo o cauto. Siamo in equilibrio”.

    21

    È in cardio allo stato stazionario.

    “Due giorni alla settimana faremo cardio allo stato stazionario”, ha detto in precedenza WH all'allenatore di Kim, “quindi camminando a un ritmo costante sul tapis roulant di solito per circa 20 minuti. Niente che la frequenza cardiaca sia troppo alta.”

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    Fa gli sprint.

    Alcantara in precedenza aveva detto a WH che aumenteranno l'intensità alcune volte alla settimana con 10 minuti di sprint. E, fatto divertente, questa è la parte meno preferita di Kim nella sua routine di allenamento. “Odia gli sprint”, ha detto Alcantara. “Ma li fa ancora, nessun problema. Sa che la cosa peggiore è la cosa che funziona.”

    23

    Si concentra sulla famiglia.

    “Ho un amore così incondizionato per i miei figli. Indipendentemente da cosa, li amerò sempre e li sosterrò in tutto ciò che scelgono di fare nella vita. La mia famiglia è cresciuta così da vicino; ora che sono una mamma, capisco il legame che mia madre e mio padre hanno provato con noi “, ha condiviso sul suo sito Web l'estate scorsa.

    “Ci possono essere alti e bassi con i bambini, ma in ogni caso, imparo sempre molto da loro. Essere una mamma è il lavoro più importante che ho”, ha detto via E! notizia.

    24

    Fa un allenamento per le gambe assassine.

    Alcantara in precedenza aveva condiviso un intero allenamento di testa a testa con WH, e Kim si concentra su sei mosse hardcore della parte inferiore del corpo: affondi a piedi, ponti di glutei elevati, squat elevati di calici, contraccolpi di glutei, squat di bulgarain e riccioli dei muscoli posteriori della coscia di manubri.

    25

    E fa le gambe due volte a settimana.

    Alcantara in precedenza aveva detto a WH di allenarsi solo due volte a settimana, ma che Kim * lo adorava *.

    “Kim adora lavorare la parte posteriore delle gambe: i muscoli posteriori della coscia e il bottino!” disse Alcantara.

    26

    Cerca di stare lontana dagli alimenti trasformati.

    “Voglio che lei mangi cibo vero che viene cucinato ogni giorno”, ha detto Alcantara Persone. “Molto probabilmente se esce da una scatola, non sarà buono per te.”

    27

    Scrive gli obiettivi di fitness.

    “Quando lavoro con Kim, ci piace fissare obiettivi che possiamo far sentire bene nel raggiungere”, ha detto Alcantara a WH. “Una volta stabilito un obiettivo, lo scriviamo. Ho scoperto che ti aiuta a renderti responsabile. Ed è fantastico quando finalmente raggiungi il tuo obiettivo! ”

    28

    Ha affrontato la sua ansia e attacchi di panico.

    Nel 2016, Kim ha aperto le sue lotte con ansia e attacchi di panico dopo essere stata derubata a Parigi. Durante un episodio di KUTWK, Kris Jenner ha assunto una terapista dell'ansia, Michelle Massi, per venire a casa di Kim e sedersi con lei, secondo ET online.

    29

    Era solita seguire la dieta Atkins.

    Kim ha detto Persone nel giugno 2017 ha seguito una dieta Atkins 40 (una dieta Atkins raccomandata per le persone che hanno meno di 40 chili da perdere, o sono in gravidanza o in allattamento) e non ha consumato più di 1.800 calorie al giorno.

    “Chiunque abbia avuto figli sa che il tuo corpo cambia, ed è difficile riavere il tuo corpo in forma”, ha detto. “Ci vuole tanta determinazione, potenza ed energia mentale e fisica.”

    30

    Non fa il punto delle opinioni della gente su di lei.

    “Non ci faccio più caso”, ha detto Voga nel 2019. “Adoro essere messo in una situazione in cui posso avere una conversazione con qualcuno che potrebbe non essere incline a pensare molto a me, perché posso garantire che avranno un'opinione diversa e capiranno cosa è importante per me dopo che” mi ho incontrato. “

    31

    È onesta con se stessa quando la sua routine di fitness è fuori.

    Kim ha rivelato nelle sue Storie di Instagram a novembre 2019 che era un po 'in una crisi di allenamento e aveva guadagnato un po' di peso.

    “E sì, voglio dire, a volte cadiamo e a volte devi davvero metterlo insieme, e questo è uno dei miei momenti in cui sono, penso, 18 libbre. rispetto a quello che ero circa un anno fa, un anno e mezzo fa. “

    32

    È diventata vegana nel 2019.

    Kardashian West ha rivelato per la prima volta che stava cambiando le sue abitudini alimentari nell'aprile 2019, secondo Persone. “Sto mangiando tutto a base vegetale quando sono a casa”, ha scritto il magnate KKW Beauty sulle sue Storie di Instagram a quel tempo, insieme a una foto di una patata dolce e un pasto pieno di avocado.

    33

    Pratica gratitudine.

    “Sono così grato per i miei bellissimi bambini, non importa come sono venuti da me, sono venuti da me. Sono così grato per i surrogati. Sono davvero grato per la mia famiglia. Sono cresciuto con così tanti fratelli. Ho adorato stare in un grande ambiente. Avrei attraversato lo stesso dolore e ritorno per il risultato di avere i miei bambini. Ne è valsa la pena “, ha detto Kim in un video di Instagram del 2019, via Persone.

    34

    Usa l'olio di CBD per aiutarla a dormire.

    “Come faccio a fare tutto? È estenuante. Dico solo CBD. (ride) Ma lo faccio. Penso davvero che mi abbia superato molto “, ha detto Persone ion settembre 2019.

    “Sono entrato nel CBD qualche mese fa. Mi ha salvato la vita. Anche dormire la notte. Mi piacciono le gummie. Userò solo un po 'e mi addormenterò (ride). Non credo che prenderei uno Xanax o di nuovo Ambien. “

    35

    Fa una colazione ricca di proteine.

    Ha condiviso via E! notizia, “Di solito avrò uova strapazzate o farina d'avena, o un frullato di proteine ​​con frutta.”

    36

    Si astiene principalmente dall'alcol.

    Una fonte ha detto Persone nel 2018 che Kim “ogni tanto beve qualcosa, ma a lei non piace molto il gusto dell'alcol”.

    37

    È super organizzata.

    “Tutto è super organizzato a casa mia – micromanaged al minuto. Come ho già detto prima, poserò i miei vestiti la sera prima, quindi quando dormo, mi sveglio alle 5:53 anziché alle 5:45, e So solo che il mio vestito è lì “, ha condiviso con lei Poosh. “Ho uno spazzolino da denti e il dentifricio tutti pronti per essere stesi dal mio lavandino. Devo solo lavarmi i denti e andare in palestra.”

    38

    Adora il tè freddo e lo addolcisce con Equal.

    Kim ha condiviso tramite E! Notizia: “Ero solito bere una tonnellata di tè freddo, ma ho tagliato. Avevo la dipendenza più folle di Equal: mettevo 10 uguali in ogni tè freddo. Mia sorella (Kourtney Kardashian) diceva sempre: 'Puoi avere così tanto dolcificante! Mi sono allenato a prendere solo un tè freddo alla settimana e sono sceso a tre pari “.

    39

    Adora andare a letto presto.

    Nel suo mondo dei sogni, sarebbe andata a letto prima. Ma da quando Kim ha iniziato a studiare per la facoltà di giurisprudenza, è rimasta vicino alle 11, con cui ha condiviso Poosh. “La maggior parte delle sere ho finito dopo cena e preparo i bambini a letto, leggo libri e li faccio dormire. Poi torna a studiare per me fino alle 23:00 circa.”

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    Mentre sembra che un nuovo ingrediente di tendenza stia spuntando ogni settimana, il retinolo è diventato un punto fermo nel mercato della cura della pelle come standard di riferimento.

    Da decenni uno dei dermatologi preferiti, il retinolo ha visto un enorme aumento di popolarità sia all'interno del settore che da parte dei consumatori che sperano di raccogliere i frutti di questo ingrediente del Santo Graal supportato dalla scienza. Ma con questa formulazione avanzata altamente reattiva, dovresti procedere con cautela.

    Nella nostra ricerca di una pelle perfetta, stiamo decodificando tutto ciò che devi sapere sul retinolo, da quando, dove e come usarlo, al prodotto perfetto per il tuo tipo di pelle o preoccupazioni.

    Che cos'è il retinolo?

    Il retinolo è una forma di vitamina A ed è disponibile in molti derivati ​​come retinil palmitato, retinil acetato e retinil linoleato. A livello di prescrizione, vedrai Retin-A che è molto più forte delle alternative da banco.

    Il retinolo fa bene alla pelle?

    “I prodotti retinolo possono aiutare a ridurre l'aspetto di linee sottili e rughe, aumentare l'aspetto della compattezza, migliorare il tono della pelle irregolare, levigare e affinare la superficie della pelle e aiutare a mitigare gli effetti dei fattori di stress ambientale”, spiega Wei Chen, Senior Manager Research e sviluppo presso DCL Skincare.

    Quando applicato sulla pelle, il retinolo viene scomposto in acido retinoide, che è una forma attiva di Vitamina A. Gli ingredienti della centrale elettrica agiscono sia sull'epidermide di superficie sia sul livello più profondo del derma per dare davvero un pugno. Ha proprietà esfolianti e di lotta contro i radicali liberi che lavorano per migliorare la produzione di collagene e accelerare il ricambio cellulare, migliorando così l'aspetto di danni del sole, linee sottili, rughe, macchie scure e lasciando la pelle più grassoccia. Può anche essere usato per combattere l'acne grave.

    Chi può usare il retinolo ed è sicuro il retinolo?

    È un'idea sbagliata comune che il retinolo debba essere usato solo sulla pelle più vecchia. Puoi aggiungere questo ingrediente alla tua routine di cura della pelle dalla tua metà degli anni Venti come misura preventiva a causa dei suoi benefici anti-invecchiamento.

    Detto questo, quelli con rosacea, eczema e psoriasi dovrebbero evitare il retinolo poiché può peggiorare i loro effetti. Sebbene non vi sia alcun legame definitivo, può anche comportare un rischio minore per l'embrione durante la gravidanza e dovrebbe essere evitato da chiunque sia incinta.

    Il retinolo può anche influenzare la pelle sensibile e non deve essere miscelato con AHA o BHA in quanto ciò può causare irritazione.

    Quando dovresti usare il retinolo?

    La dott.ssa Stefanie Williams, dermatologa e direttrice di Eudelo, spiega che non è necessario smettere di usare i retinoidi in estate, “aiutano a riparare i danni del sole, quindi sono molto utili. Tuttavia, i retinoidi topici come il retinolo o la retinaldeide possono rendere la pelle leggermente più sensibile al sole, quindi è importante combinali sempre con SPF 30-50“. Continua,” L'unica volta che consiglierei di fermare i retinoidi è quando l'esposizione al sole è estrema, come ad esempio in una vacanza al mare al sole “.

    Applicare di notte e dare seguito a un SPF ad ampio spettro ad alta frequenza il giorno successivo (e ogni). Questo non può essere sottolineato abbastanza. Quando si viaggia in climi più caldi o più freddi, può valere la pena stratificarsi con un idratante più pesante per prevenire la disidratazione.

    È possibile che si verifichino alcuni sfaldamenti, desquamazioni o secchezza quando si utilizza per la prima volta l'ingrediente. Attendi in media 12 settimane che il tuo retinoide abbia un effetto evidente. La pelle di tutti reagisce in modo diverso ma l'irritazione è normale nelle prime settimane quando la pelle inizia ad adattarsi. Resisti, ma se persiste più a lungo, sostituiscilo con una concentrazione più bassa o chiedi il parere di un dermatologo professionista.

    Quale concentrazione di retinolo dovresti usare?

    Gli studi hanno dimostrato che anche una quantità molto piccola di retinolo usato regolarmente per un periodo prolungato può mostrare miglioramenti. Ma la forza e la concentrazione che scegli dovrebbero dipendere dal tipo di pelle, dalla tolleranza e dalla preoccupazione.

    “Il retinolo può essere irritante per alcuni tipi di pelle”, spiega il dott. Dennis Gross, fondatore della cura della pelle del dott. Dennis Gross. Raccomanda formule con basse concentrazioni di retinolo (fino allo 0,04% se si ha sensibilità) e optando per quelle che presentano ingredienti lenitivi come l'acido ferulico.

    La potenza è di solito raffigurata sulla parte anteriore del prodotto, ma c'è più da considerare di quanto sembri. Anche il peso molecolare e la formulazione svolgono un ruolo più retinolo viene utilizzato, non significa che sia sempre la formula più concentrata.

    Introduci gradualmente il retinolo nel tuo regime. Dovresti iniziare con solo una piccola quantità e bassa concentrazione (meno dell'uno per cento). Usa solo una o due volte a settimana per iniziare e costruire col passare del tempo.

    Quali sono i migliori prodotti di retinolo?

    Quando scegli il tuo retinolo, non è solo l'interno che conta. Poiché l'ingrediente è sensibile all'aria e alla luce, deve essere conservato in un imballaggio opaco. L'esposizione alla luce solare la rende meno attiva e potente, quindi efficace. Per lo stesso motivo e come menzionato sopra, dovresti usare solo di notte e indossare SPF il giorno seguente.

    Applicare su una pelle appena detersa e tonica e prima di sieri, creme idratanti, oli o creme. Non dimenticare la zona degli occhi dove tende ad essere il maggior danno.

    Abbiamo raccolto i migliori prodotti a base di retinolo per cambiare la tua routine di cura della pelle.

    Migliori creme e sieri al retinolo 2020

    Il volto della celebrità Shani Darden è responsabile di uno dei prodotti più ambiti e acclamati nella cura della pelle: Texture Reform. I devoti aderenti includono Chrissy Teigen, Jessica Alba e Rosie Huntington-Whiteley, ma l'appoggio delle celebrità a parte ecco cosa devi sapere: questa è una formula delicata con risultati powerhouse, perfetta per la pelle sensibile ma non meno efficace su carnagioni che non sono altrettanto reattive .

    Texture Reform utilizza un retinolo delicato per contrastare la grana della pelle e le rughe sottili, la formula include anche acido latico per l'esfoliazione e il ravvivamento della pelle, la niacinamide per aiutare a restringere e perfezionare i pori e calmare l'aloe vera.

    Mentre potresti essere tentato di andare all-in con un retinolo super concentrato e ad alte dosi, potresti potenzialmente bruciare la pelle prima di vedere i risultati. Il retinolo richiede pazienza e buone pratiche (non combinarlo con altre formule AHA, usa SPF e non indossare prodotti a base di retinolo alla luce diretta del sole) ma se usato correttamente vedrai assolutamente i risultati.

    Questa crema sottile leggermente lattiginosa dovrebbe essere applicata la sera usando solo una o due pompe: è sufficiente per darti una carnagione evidente e luminosa in circa un mese, con linee sottili sbiadite in circa 6-8 settimane.

    Le carnagioni con iperpigmentazione o un tono della pelle molto irregolare possono aspettarsi che le macchie scure diminuiscano in circa 12 settimane. Questa formula davvero

    £ 80 | Cult Cult | Compralo Ora

    Questo è un retinolo con un seguito di culto e ci sono buone ragioni per farlo. La gamma proposta è all'altezza del suo nome con un prodotto che racchiude un pugno contenente una combinazione vincente di retinolo con una concentrazione dell'1%.

    Combinato con estratti nutrienti di frutto della passione, albicocca, cavolo nero e ciliegia invernale, che sono ricchi di antiossidanti, proprietà idratanti e proteggeranno dagli stress ambientali. Il prodotto contiene anche peptidi che lavorano in tandem con il retinolo per offrire maggiore elasticità attraverso un aumento della produzione di collagene.

    Sebbene sia un prodotto efficace per ridurre al minimo l'aspetto di linee sottili e macchie scure e rivitalizzare la pelle, ha una potente formulazione che può irritare e portare a desquamazione se si applica eccessivamente o si applica troppo spesso.

    Dovresti usare una quantità di piselli su una pelle pulita e asciutta e iniziare il trattamento, ma usandolo due volte a settimana, lavorando fino a ogni altra notte e poi ogni notte per gli utenti di retinolo stagionati.

    Come per l'intera gamma Drunk Elephant, il prodotto è privo di alcoli, siliconi, schermi chimici, fragranze o coloranti e SLS.

    £ 62 | Cult Cult | Compralo Ora

    Questa è una formula concentrata con una delle forme più alte e biodisponibili di vitamina A che puoi acquistare al banco – e tuttavia, in qualche modo è in grado di ridurre alcuni degli effetti collaterali più indesiderati come desquamazione, arrossamento e irritazione meglio dei suoi contemporanei. Usa il 6,5 per cento di estratti botanici stabilizzati di retinoidi e retinoidi per trasformare la tua carnagione e trasformarla.

    Nel caso di questa formula particolare: alto retinolo, alta ricompensa. Questo siero funziona anche efficacemente per combattere le imperfezioni, ridurre la comparsa di rughe e rughe sottili e invertire i danni UV.

    Utilizzare come siero applicato dopo aver pulito e tonificato. Applicare una o due pompe come parte del regime di cura della pelle della sera. Questo è un prodotto eccellente e degno di un posto prezioso in qualsiasi routine di cura della pelle.

    £ 70 per 30 ml | Space NK | Compralo Ora

    Disponibile anche da Cult Cult e Net-a-Porter

    Introduci il retinolo nel tuo regime di cura della pelle in un modo più sottile attraverso questo tonico Pixi – e per un prezzo accessibile. Potresti già essere un fan del tonico Glow o Rose del marchio, ma questa formulazione è diventata uno dei nostri preferiti in quanto utilizza un retinolo a rilascio di tempo per rivitalizzare la pelle e lasciarti con un bagliore naturale.

    Combina inoltre l'ingrediente del retinolo con il fiore di gelsomino per lenire e guarire, nonché i peptidi che lavorano insieme al retinolo per aumentare la produzione di collagene. Usa come toner dopo aver pulito: questa formula delicata può essere utilizzata quotidianamente ed è perfetta per chiunque sia titubante nel provare una formula più forte con un prezzo più elevato. Non otterrai gli stessi benefici

    £ 10 | M&S | Compralo Ora

    Disponibile anche da Cult Cult (100ml), Sembra fantastico(100 ml) e Stivali(£ 18 per 250 ml)

    Per questo siero notturno del retinolo, il retinolo combinato con ceramidi che agiscono per ridurre i segni dell'invecchiamento e aumentare l'umidità, è particolarmente utile poiché il retinolo è noto per seccare la pelle. Le capsule monodose sono sigillate in un involucro opaco che assicura che siano più potenti delle formule non incapsulate (76% in più secondo il marchio). Sono inoltre completamente biodegradabili e adatti al bagaglio a mano.

    Per usare, torcere e stringere la capsula in mano e applicare il siero su tutto il viso e il collo. Inizierai a notare i risultati in solo un mese in cui la tua pelle apparirà più luminosa, più uniforme e una notevole riduzione della visibilità delle macchie scure o dello scolorimento.

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    Kate Somerville ha unito il retinolo con un altro ingrediente potente, la vitamina C, per creare un super siero che utilizza il retinolo per aumentare la compattezza della pelle e ridurre i segni dell'invecchiamento e la vitamina C per rendere la pelle più luminosa e uniforme. Insieme, questo duetto di ingredienti ti lascerà con una pelle luminosa e giovane in pochi usi. È forte ma funziona.

    Questa è una formula molto leggera che si assorbe rapidamente ed è particolarmente utile per chiunque combatte l'iperpigmentazione.

    Applicare su viso e collo, evitando la zona degli occhi e seguire con idratante idratante. Usa la crema solare e non combinarla con altri prodotti a base di retinolo.

    £ 84 | Space NK | Compralo Ora

    Il Dr. Dennis Gross è rinomato per i prodotti che si esibiscono e questo non è diverso. La pelle sensibile dovrebbe provare questo siero setoso grazie al suo acido ferulico aggiunto, che lenisce e assicura che il retinolo del prodotto venga assorbito delicatamente.

    La formula è leggermente cremosa con un colore biancastro e schiarisce le macchie scure in circa un mese, con maggiori benefici più a lungo lo usi. Alcuni dei nostri tester per la pelle matura hanno preferito questo prodotto per la sua texture ultra setosa e il tempo di rotazione rapido dalla prima applicazione. “È come un pisolino per la mia pelle”, dice uno dei nostri più recenti convertiti. E chi non vuole apparire come se avesse un regolare salto?

    £ 74 per 100 ml | Amazon | Compralo Ora * Miglior prezzo

    Disponibile anche presso Cult Beauty per £ 89

    Un'aggiunta popolare alla linea Clinique, il Fresh Pressed Overnight Booster si trova accanto al booster di vitamina C più venduto di Clinique (meglio utilizzato in AM). Quelli che diffidano di aggiungere ancora un altro entrare nella loro routine gioirà; tutto quello che devi fare è aggiungere alcune gocce del booster durante la notte nella crema da notte e mescolare. Il prodotto è brillante anche per i principianti di retinolo e le pelli più giovani, poiché la quantità di prodotto può essere controllata e costruita facilmente.

    £ 30 | Clinique | Compralo Ora

    Re Kong dal potente retinolo e amato dagli addetti ai lavori di bellezza, la crema di Medik8 è una formula sovralimentata che smentisce l'affermazione che vedrai risultati visibili fino a 11 volte più veloci grazie al principio attivo Retinal.

    Retina e Retinolo ottengono gli stessi risultati ma la differenza sta nel tempo impiegato per arrivarci. Questo è un prodotto forte e le persone con pelle sensibile dovrebbero camminare leggermente, ma la pelle matura lo troverà come una combinazione ideale – dovresti comunque iniziare con una pelle matura a basso dosaggio, non garantisce che la tua carnagione non sia sensibile ma WOW questa formula si mette al lavoro veloce.

    £ 40 per 30 ml | Beauty Flash | Compralo Ora

    Proprio come la maggior parte della linea Skinceuticals, questo prodotto offre davvero in modo semplice e senza fronzoli. Contiene retinolo puro allo 0,3 per cento, quindi è efficace ma abbastanza gestibile per i principianti o per quelli di livello moderato. Un po 'fa molta strada, e il prezzo non lo è pure intimidatorio.

    Questo prodotto è adatto alle persone con acne, pelle più giovane e chiunque abbia iperpigmentazione. Abbiamo visto le macchie scure svanire con l'uso continuato, dopo quattro mesi un tester ha affermato che era “il miglior prodotto che ho scoperto per caso”.

    £ 55 per 30 ml | Skinceuticals | Compralo Ora

    Adoro questo prodotto, a parte i benefici previsti alimentati dal retinolo e da un estratto di alghe rosse ricco di peptidi, questa crema ridurrà un'imperfezione in pochissimo tempo. Se sento il minimo la protrusione inizia a formare questo è il mio prodotto preferito, non come trattamento spot ma come correttore generale. Inonda la pelle con proprietà anti-invecchiamento e illumina la carnagione delicatamente ma con risultati che puoi vedere.

    Qualsiasi prodotto di bellezza con una pompa ottiene punti di bellezza extra per impedire alle dita potenzialmente sporche di immergere nella pentola e ossigeno lontano dalla formula.

    Pelle matura, pelle giovane, acne, niente acne – molte persone scopriranno che questo prodotto funziona davvero molto bene.

    £ 70 per 50 ml | Murad | Compralo Ora

    £ 65 per 50 ml a John Lewis

    Verdetto:

    Tutte queste formule sono un potenziale Migliore ma la nostra scelta migliore va a La vera riforma di Shani Darden per la sua azione equilibrante esperta che combina ingredienti delicati con retinolo di alta qualità. Offre risultati sinceri e visibili ed è adatto a tutti i tipi di pelle. Se sei più un utente esperto di retinolo, Crystal Retinal di Medik8 3 è una scelta potente e pensiamo che Retinol Youth Cream di Murad merita di essere considerato il tuo nuovo preferito.

    Le recensioni dei prodotti ESBest sono consigli imparziali e indipendenti di cui ti puoi fidare. In alcune occasioni, guadagniamo entrate se fai clic sui link e acquisti i prodotti, ma non permettiamo mai che ciò pregiudichi la nostra copertura. Le recensioni sono compilate attraverso un mix di opinioni di esperti e test del mondo reale.

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    Psorilax:Prevenire |migliore crema o gel per la cura della psoriasi

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    Psorilax: prezzo, funziona, recensioni, opinioni, dove si compra

    INTRODUZIONE

    La psoriasi è un disturbo infiammatorio cutaneo frequente che colpisce circa il 3% della popolazione mondiale (1). La psoriasi vulgaris è il tipo più comune ed è caratterizzata da placche eritematose e squamose della pelle. La psoriasi vulgaris si verifica in genere nelle regioni dei gomiti, delle ginocchia o del cuoio capelluto. Oltre alle lesioni cutanee, nella psoriasi possono essere interessati diversi altri organi, tra cui l'artrite, la sindrome metabolica o la malattia infiammatoria intestinale, che contribuiscono tutti al carico della malattia (1). Istologicamente, la psoriasi è caratterizzata da un hyperthickening dell'epidermide cutanea con aumento della vascolarizzazione e infiltrazione immunitaria del derma (2). Sebbene la psoriasi sia una malattia autoimmune, l'epidermide cutanea è anche un attore importante nella patogenesi iniziale della psoriasi e contribuisce al reclutamento di cellule infiammatorie e il cross-talk tra cellule epidermiche e cellule immunitarie è probabilmente importante per la patogenesi di psoriasi (2).

    Il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA), il principale fattore proangiogenico, è sovraespresso nella pelle della psoriasi umana ed è correlato alla gravità della malattia (3). È stato suggerito un ruolo per VEGFA nella psoriasi VEGF posizione genomica nelle immediate vicinanze di PSORS1, uno dei locus di suscettibilità alla psoriasi e la correlazione del polimorfismo a singolo nucleotide in VEGF con gravità della psoriasi (4). La somministrazione di bevacizumab, un anticorpo monoclonale destinato al VEGFA, per il trattamento dei tumori solidi è stata associata al miglioramento delle lesioni psoriasiche (5). Studi sperimentali hanno anche dimostrato l'efficacia della terapia con blocco VEGFA nel miglioramento del fenotipo cutaneo nei modelli murini di malattia simil-psoriasi (68).

    Modelli di topo transgenico che sovraesprimono VEGF nei cheratinociti porta allo sviluppo di una condizione infiammatoria della pelle che ricapitola i principali segni distintivi della psoriasi umana, supportando un ruolo chiave di VEGF espresso dai cheratinociti nel promuovere la malattia simile alla psoriasi (810). Tuttavia, i ruoli precisi svolti da VEGFA nella mediazione della psoriasi sono scarsamente compresi. VEGFA media i suoi effetti legandosi ai recettori tirosina chinasi Flt1 (VEGFR1) e Flk1 (VEGFR2) (11). La neuropilina 1 (Nrp1) agisce come un corecettore VEGFA amplificando la segnalazione VEGFA promuovendo la segnalazione del recettore VEGFR nelle stesse cellule (effetto cis) o presentando VEGFA alle cellule vicine (effetto trans) (12).

    Nonostante il ruolo ben noto di VEGFA nella psoriasi, il meccanismo molecolare con cui VEGA promuove la psoriasi non è ben compreso. Non è chiaro su quali cellule il VEGFA agisca per promuovere la psoriasi e i meccanismi molecolari a valle del VEGFA in questo processo. VEGFA agisce solo su vasi sanguigni o macrofagi, come è stato precedentemente suggerito (13), che a sua volta media il reclutamento di cellule infiammatorie e causa il difetto di differenziazione dei cheratinociti, oppure VEGFA agisce direttamente anche sulle cellule epidermiche in modo autocrino o paracrino per orchestrare i cambiamenti associati alla psoriasi, come è stato suggerito durante la tumorigenesi (14, 15)?

    Utilizzando modelli murini di psoriasi geneticamente modificati, abbiamo valutato il ruolo dell'espressione Nrp1 o Flt1 da parte delle cellule epidermiche per indurre lo sviluppo della psoriasi in modo autonomo cellulare. Inaspettatamente, abbiamo riscontrato che la cancellazione di NRP1 o Flt1 nella pelle l'epidermide impedisce completamente lo sviluppo della psoriasi seguente VEGF sovraespressione. Inoltre, la cancellazione epidermica di Flt1 nei topi con c-Jun / JunB eliminazione, uno dei modelli di topo meglio studiati della psoriasi (16), porta anche a un notevole miglioramento delle lesioni della psoriasi. Abbiamo dimostrato che la somministrazione terapeutica di anticorpi bloccanti Nrp1 ripristina lo sviluppo di lesioni psoriasiche indotte da Vegfa.

    Combinazione di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile dalla trasposasi (ATAC-seq) su cellule epidermiche isolate a selezione di fluorescenza (FACS) VEGF sovraespressione in presenza o in assenza di Flt1 o NRP1 ha permesso l'identificazione della rete regolatrice genica a valle di Flt1 / Nrp1 nei cheratinociti che controllano lo sviluppo della psoriasi indotta da Vegfa. Insieme, i nostri risultati svelano una nuova funzione cellulare autonoma di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche che promuove la psoriasi indotta da Vegfa e apre la strada a nuove opportunità terapeutiche per il trattamento della malattia psoriasica.

    RISULTATI

    L'espressione epidermica autonoma di Flt1 è essenziale per lo sviluppo della psoriasi indotta da Vegfa

    Come precedentemente riportato, VEGF sovraespressione nell'epidermide di topo con K14-Cre / Rosa-VEGF (K14-VEGF) induce una malattia simil-psoriasica (8), che appare 1 mese dopo la nascita e caratterizzato macroscopicamente da pelle rossa, lesioni squamose nell'orecchio e nella coda, nonché eritema grave ed edema della mucosa orale (fig. S1, A e B) e microscopicamente dall'iperplasia epidermide, differenziazione dei cheratinociti anormale, aumento della proliferazione delle cellule epidermiche, infiltrazione immunitaria e densità dei vasi sanguigni (fig. S1, da C a J). Queste caratteristiche macroscopiche e microscopiche rappresentano il segno distintivo delle lesioni cutanee psoriasiche nell'uomo (17). In questo modello di topo, diverse popolazioni di cellule esprimono recettori e corecettori di Vegfa. Le cellule endoteliali (EC) esprimono VEGFR2 / Flk1 (18), VEGFR1 / Flt1 (19) e il suo coreceptor Nrp1 (20). Flt1 è anche espresso da diverse cellule immunitarie (21), ma i recettori Vegfa espressi dai cheratinociti sono ancora oggetto di discussione (22, 23). Nrp1 è un corecettore di Vegfa, che promuove la segnalazione di Vegfa in trans presentando Vegfa ad altri immunitari ed EC, o in cis promuovendo la segnalazione di Vegfa in modo autonomo cellulare (12). Usando l'RNA-seq o la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), abbiamo scoperto che i cheratinociti basali esprimevano VEGFR1 / Flt1 e Nrp1, ma non VEGFR2 / Flk1 (fig. S1K).

    Valutare il ruolo autonomo cellulare dell'espressione di Flt1 da parte dei cheratinociti VEGFpsoriasi mediata, abbiamo eliminato Flt1 esclusivamente nell'epidermide usando K14-Cre / Rosa-Topi Vegfa / Flt1 flox / flox (K14-Vegfa / Flt1 cKO) (Fig. 1A). VEGF espressione di mRNA era comparabile in K14-VEGF e K14-Vegfa / Flt1 cKO topi (Fig. 1B), mentre Flt1 espressione è stata praticamente abolita ai livelli di mRNA e proteine ​​in K14-VEGF / Flt1 epidermide di cKO (Fig. 1, da B a D). Spessore epidermico, che è stato aumentato di tre volte in K14-VEGF epidermide, è stata normalizzata al livello di controllo in K14-Vegfa / Flt1 cKO epidermide (Fig. 1, F e G).

    Fig. 1 L'espressione di Flt1 da parte dei cheratinociti è essenziale per la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN) Strategia per l'attivazione costitutiva VEGF e inibire Flt1. (B) VEGF e Flt1 espressione di mRNA da qRT-PCR su cheratinociti isolati da FACS (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (C) Espressione di Flt1 valutata mediante Western blot su cheratinociti basali isolati FACS. (D) Espressione della proteina Flt1 (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (E) Naso-regione orale, orecchio e coda. (F) Ematossilina ed eosina (H&E) sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (sol) Spessore epidermico della coda misurato al microscopio (n = 10) (significa ± SEM, di Student t test). (H) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (io) Percentuale di cellule basali EdU-positive (BCs) nell'epidermide interfollicolare (IFE) (n = 398 (Ctrl), n = 436 (K14-Vegfa), n = 422 (K14-Vegfa / Flt1 cKO) BC totali, n = 10 topi) (media ± SEM, di Student t test). (J) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (K) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea (rappresenta l'area cutanea appena sotto l'IFE) di 300.565 μm2 (Ctrl), 289.678 μm2 (K14-VEGF) e 278.767 μm2 (K14-Vegfa / Flt1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). (L) Colorazione K14 / CD31. Barre di scala, 50 micron. (M) Numero di cellule CD31 positive (densità microvascolare) calcolate nell'area IFE cutanea di 324.567 μm2 (Ctrl), 345.234 μm2 (K14-VEGF) e 342.356 μm2 (K14-Vegfa / Flt1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD31 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    L'iperplasia dell'epidermide nella pelle psoriasica è associata ad un aumento della proliferazione dei cheratinociti basali (2). Mentre VEGF la sovraespressione ha aumentato la proliferazione basale dei cheratinociti (51% delle cellule positive a EdU (5′-etinil-2′-desossiuridina) in K14-VEGF contro il 17% per i topi di controllo), la cancellazione di Flt1 impedito l'aumento della proliferazione cellulare indotto da VEGF (19% di cellule positive a EdU) (Fig. 1, H e I).

    Pelle psoriasica indotta da VEGF la sovraespressione è anche caratterizzata da un'infiltrazione di cellule immunitarie (2). Per definire se Flt1 l'espressione nei cheratinociti controlla l'infiltrazione immunitaria indotta da VEGF sovraespressione, abbiamo eseguito l'immunocolorazione del CD45, un marcatore pan-leucocitario nell'epidermide cutanea di controllo, K14-VEGFe K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi. Flt1 la delezione nell'epidermide ha impedito completamente l'aumento del seguente infiltrato immunitario cutaneo VEGF sovraespressione (Fig. 1, J e K). Linfociti B CD19-positivi e macrofagi F4 / 80 sono stati le principali popolazioni di cellule immunitarie aumentate nel derma di K14-VEGF topi e sono diminuiti dopo epidermico Flt1 cancellazione (fig. S2, B e C).

    La neoangiogenesi è un'altra importante caratteristica che caratterizza la pelle psoriasica (24). Per determinare il ruolo dell'epidermide Nrp1 nella regolazione della neoangiogenesi indotta da VEGF espressione da cheratinociti, abbiamo eseguito immunocolorazione CD31 nell'epidermide cutanea e quantificato la densità microvascolare nei topi che esprimono o non esprimono Flt1 nell'epidermide. Mentre VEGF l'espressione da parte delle cellule epidermiche ha aumentato la densità microvascolare, la cancellazione di Flt1 nei cheratinociti ha normalizzato la densità microvascolare al livello riscontrato nei topi di controllo (Fig. 1, L e M).

    L'espressione epidermica di Nrp1 è necessaria per lo sviluppo della psoriasi mediata da Vegfa

    Per indagare se l'espressione di Nrp1 da parte delle cellule epidermiche regola la malattia simile alla psoriasi mediata da Vegfa, abbiamo sovraespresso VEGF e cancellato NRP1 specificamente ed esclusivamente nell'epidermide della pelle usando K14-Cre / Rosa-VEGF/Nrp1flox / flox topi (K14-Vegfa / Nrp1 cKO) (Fig. 2A). Il livello di VEGF L'espressione dell'mRNA nelle cellule epidermiche basali era comparabile tra K14-VEGF e K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi (Fig. 2B), mentre l'espressione di Nrp1 era praticamente non rilevabile nell'epidermide di K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi sia a livello di mRNA che di proteine ​​(Fig. 2, da B a D). La cancellazione di NRP1 nei cheratinociti in K14-Vegfa / Nrp1 cKO i topi erano sufficienti a bloccare completamente lo sviluppo del fenotipo della psoriasi macroscopica (eritema e pelle squamosa) nella coda e nell'epidermide dell'orecchio indotta da VEGF sovraespressione (Fig. 2E). La cancellazione di NRP1 nell'epidermide ha anche impedito lo sviluppo di alterazioni microscopiche che hanno caratterizzato la pelle psoriasica, tra cui l'ipertensione epidermica, l'aumento della proliferazione dei cheratinociti basali, l'infiltrazione immunitaria e la densità microvascolare associata a VEGF sovraespressione (Fig. 2, da F a I).

    Fig.2 La funzione autonoma delle cellule di Nrp1 nell'epidermide è fondamentale per la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN) Strategia per l'attivazione costitutiva VEGF ed elimina NRP1 espressione nell'epidermide. (B) VEGF e NRP1 espressione di mRNA da qRT-PCR su cheratinociti isolati da FACS (n = 3) (significa ± SEM, test di Mann-Whitney). (C) Espressione Nrp1 valutata mediante Western blot eseguita su cheratinociti basali isolati FACS. (D) Espressione della proteina Nrp1 (n = 3) (significa ± SEM, test di Mann-Whitney). (E) Naso-regione orale, orecchio e coda. (F) H&E sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (sol) Spessore epidermico della coda misurato al microscopio (n = 10) (media ± SEM, di Student t test). (H) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (io) Percentuale di BC positivi per EdU (n = 507 (Ctrl), n = 487 (K14-Vegfa), n = 490 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO) BC totali; n = 10 topi) (significa ± SEM, di Student t test). (J) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (K) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea di 344.965 μm2 (Ctrl), 449.687 μm2 (K14-VEGF) e 423.876 μm2 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO); n = 10 topi. Cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). (L) Colorazione K14 / CD31. Barre di scala, 50 micron. (M) Numero di cellule CD31 positive calcolate in un'area cutanea IFE di 409.560 μm2 (Ctrl), 432.890 μm2 (K14-VEGF) e 428.532 μm2 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD31 positive per 10000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    La malattia simile alla psoriasi indotta da VEGF non è stato influenzato dalla cancellazione di un singolo allele di nessuno dei due NRP1 o Flt1, mentre i topi eterozigoti composti (K14-VEGF / NRP1 + / CKO / Flt1 + / CKO) non presentava un fenotipo psoriasico ed erano indistinguibili dal completo NRP1 o Flt1 cKO (fig. S3, da A a H), che mostra quello Flt1 e NRP1 interagire geneticamente in modo epistatico per promuovere la psoriasi indotta da Vegfa. Insieme, questi dati dimostrano chiaramente la funzione autonoma cellulare essenziale di Flt1 e Nrp1 nel promuovere lo sviluppo della psoriasi indotta dalla sovraespressione di Vegfa.

    La somministrazione di anticorpi anti-Nrp1 bloccanti la funzione migliora il fenotipo della psoriasi indotto dalla sovraespressione di Vegfa

    Per valutare se inibire l'interazione Nrp1 / Vegfa può essere di rilevanza terapeutica per il trattamento della psoriasi, abbiamo somministrato a K14-VEGF topi un anticorpo anti-Nrp1 che blocca il legame di Vegfa (anticorpo Nrp1b) o il legame di semaforo (anticorpo Nrp1a) (Fig. 3, da A a C) (25, 26).

    Fig. 3 Gli anticorpi anti-Nrp1 bloccanti la funzione migliorano la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN per C) Regione nasale, orecchio e coda (D) H&E sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (E) Misure di spessore epidermico (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (F) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (sol) Percentuale di BC positivi per EdU (n = 387 (isotipo, giorno 0), n = 354 (isotipo, giorno 15), n = 424 (Nrp1b AB, giorno 0), n = 409 (Nrp1b AB, giorno 15), n = 391 (Nrp1a AB, giorno 0), n = 421 (Nrp1a AB, giorno 15) BC totali, n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (H) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (io) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea di 254.342 μm2 (isotipo, giorno 0), 298.567 μm2 (isotipo, giorno 15), 267.890 μm2 (Nrp1b AB, giorno 0), 287.908 μm2 (Nrp1b AB, giorno 15), 257.560 μm2 (Nrp1a AB, giorno 0), 294.901 μm2 (Nrp1a AB, giorno 15); n = 10. Numero di cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, Mann-Whitney). (J) Colorazione K14 / CD31. Barra della scala, 50 micron. (K) Densità microvascolare nell'area IFE dermica di 267.980 μm2 (isotipo, giorno 0), 234.589 μm2 (isotipo, giorno 15), 222.370 μm2 (Nrp1b AB, giorno 0), 223.456 μm2 (Nrp1b AB, giorno 15), 200.154 μm2 (Nrp1a AB, giorno 0) e 212.980 μm2 (Nrp1a AB al giorno 15). Numero di cellule CD31 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, Mann-Whitney). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    Lo spessore epidermico è stato rapidamente normalizzato in seguito alla somministrazione dell'anticorpo anti-Nrp1 che blocca l'interazione Nrp1 / Vegfa (Fig. 3, D ed E). Allo stesso modo, iperproliferazione dei cheratinociti, infiltrazione immunitaria e aumento della densità microvascolare indotta da VEGF anche la sovraespressione è stata rapidamente normalizzata in seguito alla somministrazione dell'anticorpo anti-Nrp1 che blocca l'interazione di Vegfa, mentre non è stato osservato alcun miglioramento della psoriasi dopo la somministrazione dell'anticorpo Nrp1 che blocca l'interazione di semaforo (Fig. 3, da F a K). Questi dati dimostrano il beneficio terapeutico del blocco dell'interazione di Vegfa / Nrp1 per il trattamento della psoriasi.

    L'espressione epidermica autonoma di Flt1 è essenziale per lo sviluppo della psoriasi indotta da c-Jun / JunB cancellazione

    Abbiamo quindi valutato se il ruolo essenziale di Flt1 nelle cellule epidermiche sia conservato in diversi modelli murini di psoriasi. A tal fine, abbiamo indotto la cancellazione di Flt1 nella pelle epidermide di c-Jun / JunB topi cKO, uno dei modelli di topo più comunemente usati della psoriasi (16, 27). In questo modello, i topi sviluppano una forte malattia simile alla psoriasi 2 settimane dopo c-Jun / JunB cancellazione condizionale (fig. S4, A e B) (16).

    Delezione epidermica di Flt1 in questo modello (c-Jun / JunB / Flt1 triple cKO) ha ridotto la gravità delle lesioni della psoriasi sia macroscopicamente che microscopicamente con una diminuzione dello spessore epidermico (fig. S4, C e D). L'infiltrato immunitario all'interno dell'epidermide, che consiste principalmente di neutrofili in questo modello, è stato normalizzato sull'epidermide Flt1 cancellazione (fig. S4, da E a G). La densità microvascolare è stata anche normalizzata alla delezione di Flt1 (fig. S4, da G a I). Questi dati dimostrano la funzione conservata di Flt1 nelle cellule epidermiche per mediare lo sviluppo della psoriasi attraverso diversi modelli di topo psoriasi.

    Paesaggio trascrizionale associato alla segnalazione di Vegf / Flt1 / Nrp1 nella psoriasi

    Per definire i meccanismi molecolari che regolano la funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche per avviare la formazione della psoriasi, abbiamo prima definito la firma trascrizionale delle cellule epidermiche indotte da Vegfa in presenza o assenza di Flt1 e Nrp1. A tal fine, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA su cheratinociti basali isolati FACS dal controllo, K14-VEGF, K14-Vegfa / Nrp1 cKOe K14-Vegfa / Flt1 cKO topi.

    La maggior parte dei geni è regolata da VEGF (382 di 968 geni (40%), P = 10-17) non sono stati più sottoposti a up-regolazioni neanche dopo Flt1 o NRP1 eliminazione, dimostrando che il nucleo dei cambiamenti trascrizionali che si verificano dopo la sovraespressione di Vegfa nelle cellule epidermiche è coregulato da Flt1 e Nrp1 (Fig. 4A). Al contrario, 243 dei 968 geni up-regolati da Vegfa (25%, P = 10-12) sono stati up-regolati da Vegfa in tutte le condizioni indipendentemente dall'espressione di Nrp1 e Flt1 da parte dei cheratinociti, e quindi rappresentano i geni che sono regolati da Vegfa nei cheratinociti indipendentemente dall'espressione di Flt1 / Nrp1 nelle cellule epidermiche (Fig. 4A). Infine, 226 di 968 geni (23%, P = 10-12) up-regolato da Vegfa non era più up-regolato da Vegfa in seguito Flt1 cancellazione in K14-Vegfa / Flt1 cKO ma normalmente erano sotto-regolati in seguito NRP1 eliminazione e 117 di 968 geni (12%, P = 10-11) non erano più sovraregolati in assenza di NRP1 ma normalmente regolato in assenza di Flt1 (Fig. 4A). Questi dati indicano che la stragrande maggioranza dei geni sovraregolati da Vegfa nell'epidermide dipendevano dall'espressione di Flt1 e Nrp1 da parte dei cheratinociti.

    Fig. 4 Paesaggio trascrizionale associato alla segnalazione Nrp1 / Flt1 / Vegfa nella psoriasi.

    (UN) Grafico a torta che mostra la percentuale di geni up-regolati totali in K14-VEGF e a seconda del comune Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 espressione dipendente). Sono stati rappresentati anche geni con espressione invariata dopo ablazione epidermica Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1-geni indipendenti). (B) Analisi GO di geni up-regolati in VEGF sovraespressione in modo dipendente da Nrp1 e Flt1. (C) espressione relativa di mRNA di geni up-regolati da RNA-seq in VEGF sovraespressione nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (D) Grafico a torta che mostra la percentuale di geni down-regolati totali in K14-VEGF e in base all'espressione Nrp1 / Flt1 comune (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 espressione dipendente). Sono stati rappresentati anche geni con espressione invariata dopo l'ablazione epidermica Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1-geni giù indipendenti). (E) Analisi GO di geni down-regolati in VEGF sovraespressione in modo dipendente da Nrp1 e Flt1. (F) espressione relativa di mRNA di geni down-regolati da RNA-seq in VEGFtopi che esprimono iperespressione e che dipendono dall'espressione di Nrp1 o Flt1 nei cheratinociti isolati da FACS (n = 2) (significa ± SEM).

    L'ontologia genica (GO) dei geni sovraregolata da più del doppio della sovraespressione di Vegfa e in base all'espressione di Flt1 e Nrp1 da parte dei cheratinociti (382 di 968 geni) ha mostrato un arricchimento delle trascrizioni che regolano l'immunità (P = 108), proliferazione (P = 10-8) e differenziazione epidermica (P = 10-6), come precedentemente riportato nella psoriasi umana e in altri modelli murini di malattia simil-psoriasi (Fig. 4B). Abbiamo riassunto i geni top-regolati nella tabella S1. Alcuni di questi geni erano noti per essere coinvolti nella psoriasi, mentre molti altri non sono stati precedentemente implicati nella psoriasi ma regolano le funzioni cellulari potenzialmente rilevanti per lo sviluppo della psoriasi, come la regolazione della proliferazione e la differenziazione epidermica.

    Oltre ai geni up-regolati, anche la nostra analisi lo ha dimostrato VEGF la sovraespressione ha anche indotto la down-rule di 1225 geni di oltre due volte. La maggior parte dei geni down-regolati (602 dei 1225 geni (49%), P = 10-17) dipendevano dall'espressione di entrambi i Nrp1 e Flt1 da parte dei cheratinociti e di altri 227 su 1225 geni (19%, P = 10-10) dei geni down-regolati da Vegfa erano dipendenti da Flt1 ma indipendenti da Nrp1 (Fig. 4D). Solo l'8% (P = 10-7) dei geni down-regolati sono stati bloccati da NRP1 cancellazione, ma non Flt1 cancellazione (Fig. 4D). Inoltre, il 24% di questi geni (296 di 1225, P = 10-9) sono stati down-regolati da Vegfa indipendentemente dall'espressione di Nrp1 o Flt1 (Fig. 4D). GO dei geni down-regolati di oltre due volte da Vegfa in modo dipendente da Flt1 e Nrp1 (602 di 1225 geni) hanno mostrato arricchimento per le trascrizioni che inibiscono la proliferazione (P = 10-21), che regola la matrice extracellulare (ECM) (P = 10-9) e differenziazione epidermica (P = 10-6) (Fig. 4E). Abbiamo riassunto i principali geni down-regolati nella tabella S2.

    Insieme, i nostri dati hanno dimostrato che la maggior parte dei geni iper-regolati e sotto-regolati dalla sovraespressione di Vegfa nelle cellule epidermiche dipendevano dall'espressione di Flt1 e Nrp1 nei cheratinociti, suggerendo che il nucleo dei cambiamenti trascrizionali associati allo sviluppo della psoriasi indotto da Vegfa sia dipendente da una funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche.

    Rimodellamento della cromatina associato alla segnalazione di Vegfa / Flt1 / Nrp1 nella psoriasi

    Per comprendere più a livello globale i cambiamenti nel panorama della cromatina che si verificano durante la malattia simile alla psoriasi mediata da Vegfa e identificare i fattori di trascrizione (TF) e le reti di regolazione genica che controllano i cambiamenti nell'espressione genica associata allo sviluppo della psoriasi, abbiamo cheratinociti basali isolati FACS dal controllo, K14-VEGF, K14-Vegfa / Nrp1 cKOe K14-Vegfa / Flt1 cKO topi ed eseguito ATAC-seq, una tecnica che consente la mappatura delle regioni aperte della cromatina ad alta definizione e prevede i TF che regolano il rimodellamento della cromatina (28). Abbiamo prima definito il rimodellamento della cromatina associato alla psoriasi mediata da Vegfa valutando le regioni della cromatina (picchi di ATAC-seq) che sono cambiate di più del doppio tra K14-VEGF e controllare i topi. Abbiamo scoperto che 16.863 regioni della cromatina erano più aperte (P = 10-11) e 5829 regioni di cromatina erano più chiuse VEGF sovraespressione (P = 10-11). Tra i picchi sovraregolati dalla sovraespressione di Vegfa, abbiamo scoperto che 9964 picchi (59%, P = 10-15) non erano più regolamentati Flt1 o NRP1 cancellazione, 2703 picchi (16%, P = 10-10) non erano più regolamentati Flt1 solo eliminazione, 2366 picchi (14%, P = 10-11) non erano più regolamentati NRP1 solo cancellazione e 1830 picchi (11%, P = 10-7) sono rimasti invariati a seguito NRP1 o Flt1 cancellazione (Fig. 5A).

    Fig. 5 Paesaggio della cromatina associato alla segnalazione Nrp1 / Flt1 / Vegfa nella psoriasi.

    (UN) Percentuale dei picchi up-regolati totali in K14-VEGF e in base a Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 dipendente) o indipendente dall'espressione Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1 indipendente). (B) Percentuale di picchi down-regolati e loro distribuzione nelle diverse categorie. (C) Motivi arricchiti di TF trovati nei picchi che erano regolati verso l'alto o verso il basso (D) in modo dipendente da Nrp1 / Flt1. P valore di arricchimento del motivo in picchi rispetto allo sfondo e percentuale di picchi contenenti il ​​motivo. (E) Percentuale dei picchi up-regolati totali in K14-VEGF sovrapposti con geni up-regolati e dipendenti dall'espressione Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 dipendente) o indipendente dall'espressione Nrp1 o Flt1 (=Flt1 / NRP1 indipendente). (F) espressione di mRNA di geni up-regolati da RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (sol) Arricchito i motivi della trascrizione TF nei picchi sovraregolati in modo n. 1 / Flt1. (H) Percentuale di geni down-regolati totali e loro distribuzione nelle diverse categorie. (io) espressione di mRNA di geni down-regolati da RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (J) Arricchito i motivi TF nei picchi down-regolati in modo Nrp1 / Flt1-dipendente.

    Tra i picchi che erano sotto-regolati sulla sovraespressione di Vegfa, abbiamo scoperto che i picchi del 1723 (30%, P = 10-15) non erano più soggetti a down-regolazioni Flt1 e NRP1 eliminazione, 1444 picchi (25%, P = 10-13) non erano più regolamentati Flt1 solo eliminazione, 595 (picchi del 10%, P = 10-8) non erano più regolamentati NRP1 solo eliminazione e 2067 picchi (35%, P = 10-13) sono rimasti invariati NRP1 o Flt1 cancellazione (Fig. 5B). Abbiamo eseguito l'analisi del motivo del sito di legame TF sui picchi sovraregolati sulla sovraespressione di Vegfa in modo dipendente da Flt1 / Nrp1. Abbiamo trovato un arricchimento nei motivi TF corrispondente a Gata TF (26%, P = 10-185), TEAD TF (28%, P = 10-41), Egr1 (14%, P = 10-32), AP-1 (32%, P = 10-26), elica-elica-anello-elica (bHLH) TF (38%, P = 1 × 10-21) e Lumaca (14%, P = 10-11) (Fig. 5C). Tra i picchi che sono stati down-regolati sulla sovraespressione di Vegfa in modo dipendente da Flt1 / Nrp1, abbiamo trovato un arricchimento nei motivi di TF corrispondente a Klf TF (33%, P = 10-19) e homeobox TF (30%, P = 10-16) (Fig. 5D).

    Dopo aver assegnato i geni associati a ciascuno di questi picchi, abbiamo valutato da quale di questi picchi è sovraregolato VEGF sono stati associati ad un aumento dell'espressione genica di oltre due volte (picchi su / geni su) (Fig. 5E). Abbiamo scoperto che 937 geni si sentivano in questa categoria. Abbiamo quindi valutato quali di questi geni presentano ancora rimodellamento della cromatina dopo la delezione di Nrp1 o Flt1. La grande maggioranza di questi geni (70%, 660 su 937, P = 10-8) non ha presentato cambiamenti significativi in ​​queste regioni della cromatina in assenza di Flt e Nrp1, e solo il 5% (P = 10-5) di questi geni (48/937) presentavano il seguente rimodellamento della cromatina VEGF sovraespressione in assenza di Flt1 e Nrp1 (Fig. 5E), che mostra il ruolo chiave di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche per mediare il rimodellamento della cromatina indotto da VEGF sovraespressione. L'analisi GO dei picchi up-regolati / geni up-regolati che sono Nrp1 / Flt1 dipendenti ha rivelato che questi geni erano associati all'induzione delle fasi iniziali delle risposte immunitarie e ai geni indotti dall'interferone di tipo I (P = 10-7) (Fig. 5F e tabella S3).

    Per ottenere ulteriori approfondimenti sulla rete di regolazione genica che controlla la psoriasi, abbiamo eseguito analisi di arricchimento dei motivi delle regioni della cromatina che sono diventate più aperte durante lo sviluppo della psoriasi mediata da Vegfa. Tra i geni per i quali i picchi di ATAC-seq nelle loro regioni regolatorie sono stati aperti e accompagnati da un aumento dell'espressione genica in modo dipendente da Flt1 / Nrp1, abbiamo scoperto che i motivi TF più arricchiti in questi picchi erano i TF AP-1 ( 32% delle vette, P = 10-23), NF1 (18% dei picchi, P = 10-13), TF GATA (34% dei picchi, P = 10-11), P63 (18% delle vette, P = 10-11), Fattore di legame CCCTC (CTCF) (9% dei picchi, P = 10-11), TEAD (35%, P = 10-10), TFH bHLH (23%, P = 10-10), coerente con i motivi trovati su tutto il picco (Fig. 5G).

    Abbiamo quindi valutato quale dei picchi down-regolati in K14-VEGF l'epidermide è stata associata a una down-regolazione dell'espressione genica di oltre due volte (picchi giù / geni giù) (Fig. 5, H e I). Tra questi 467 geni, la stragrande maggioranza di essi non era più sotto-regolata Flt1 o Nrp1 cKO (60%, 279 su 467 per entrambi cKO, P = 10-8), 26% (123 di 467, P = 10-7) dopo l'eliminazione di Flt1 e il 4% (P = 10-7) a seguito della cancellazione di Nrp1, mentre solo il 10% di questi geni presentava rimodellamento della cromatina sull'espressione di Vegfa indipendentemente da Nrp1 e Flt1 (43 di 490, P = 10-6) (Fig. 5H).

    L'analisi della scoperta del motivo nei picchi down-regolati associati alla down-regolazione dell'espressione genica in modo dipendente da Flt1 / Nrp1 ha rivelato che i TF di Klf (26% dei picchi, P = 10-20), TF AP-1 (33% dei picchi, P = 10-14) e p63 (23% dei picchi, P = 10 × 10-13) erano i motivi di TF statisticamente più significativi arricchiti in questi picchi down-regolati (Fig. 5J).

    Insieme, questi dati dimostrano che la maggior parte del rimodellamento della cromatina associato all'attivazione o repressione genica indotta da Vegfa è mediata dalla funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche e identifica i TF associati al Vegfa rimodellante mediato dalla cromatina in un Flt1 – e modo Nrp1-dipendente.

    Fosl1 agisce a valle della segnalazione Vegfa / Flt1 nel promuovere la psoriasi

    I siti di legame dell'AP-1 erano tra i motivi di TF più significativamente arricchiti trovati nelle regioni della cromatina dei geni che erano sovraregolati in modo dipendente dalla Flt1 e dal Nrp1 durante la malattia simile alla psoriasi indotta da Vegfa. AP-1 rappresenta una famiglia di TF composta da Jun e Fos che funzionano come omo- o eterodimero e cancellazione epidermica di c-Jun / JunB porta a una malattia simile alla psoriasi nei topi (16).

    Molte delle regioni della cromatina di questi geni regolati da Vegfa che presentano siti di legame AP-1 non sono più state rimodellate quando Flt1 o Nrp1 sono stati eliminati dall'epidermide (32%, 211 su 660 dei geni sovraregolati; 33%, 92 di 279 dei geni down-regolati), coerentemente con un ruolo chiave per Flt1 / Nrp1 nella regolazione del rimodellamento della cromatina associato ai TF AP-1. L'analisi GO eseguita su geni up-regolati / picchi up-regolati e contenente motivi AP-1 ha mostrato arricchimento di geni correlati all'immunità (ad es. TLR4, art3, Ikzf2, Alox5ap, e Nlrc5) (fig. S5A). L'analisi GO eseguita su geni down-regolati / picchi down-regolati e contenente motivi AP-1 ha mostrato arricchimento di geni correlati all'ECM (ad es. Tgfb2, MMP13, Angioptl7, Ism1, e tnfrsf19) (fig. S5B).

    Questi geni erano similmente up-regolati o down-regolati dalla segnalazione di Vegfa nei cheratinociti in vitro-coltivati ​​e nell'epidermide cutanea in vivo (fig. S5, da C a F), sostenendo ulteriormente l'importanza di una cellula autonoma Vegfa / Flt1 / AP -1 segnalazione nei cheratinociti che media la psoriasi. Abbiamo confermato la sovraregolazione del recettore Toll-like 4 (TLR4) e la down-regolazione di Ism1 a livello proteico mediante immunofluorescenza sulle sezioni della pelle della coda (fig. S5G). Per determinare quali TF AP-1 trasmettono la segnalazione Vegfa per indurre il rimodellamento della cromatina e il cambiamento nell'espressione genica associata alla psoriasi, abbiamo valutato quali membri della famiglia AP-1 sono up o down-regolati in seguito VEGF sovraespressione. Abbiamo scoperto che tra i TF AP-1, solo Fosl1 era up-regolato da VEGF sovraespressione (Fig. 6A). La sovraespressione di Fosl1 non era più soggetta a regolamentazione eccessiva Flt1 cancellazione in K14-Vegfa / Flt1 cKO topi, mostrando l'importanza della segnalazione autonoma delle cellule Vegfa / Flt1 nel promuovere la sovraespressione di Fosl1. Inoltre, abbiamo anche dimostrato la sovraespressione di Fosl1 nelle cellule epidermiche mediante immunoistochimica sulla sezione della pelle nel K14-VEGF e cK-giu / giuB cKO modelli di psoriasi (fig. S6, B e C).

    Fig.6 Fosl1 agisce a valle della segnalazione Vegfa / Flt1 nella regolazione del rimodellamento della cromatina e del cambiamento trascrizionale associato alla psoriasi.

    (UN) espressione di mRNA di membri AP-1 da parte di RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (B) IHC (immunohistochemistry) of Fosl1 nuclear staining in tail epidermis. Scale bars, 10 μm. (C) IHC of Folsl1 in ear epidermis. Scale bars, 10 μm. (D) Fosl1 expression assessed by Western blot on primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa after transduction with control (sh Ctrl) or Fosl1-specific shRNA (sh Fosl1).(E) Protein expression of Fosl1 (n = 3). Histogram represents means ± SEM. (F) Vegfa e Fosl1 mRNA expression measured par qRT-PCR on primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fols1 (n = 3) (means ± SEM, Mann-Whitney). (G) Relative chromatin accessibility measured by ATAC qPCR of chromatin regions presenting AP-1 binding sites in the regulatory regions of up- or down-regulated genes (H) in primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fosl1 (n = 3). Primers were designed around the control region (c) and peak region (p) (means ± SEM, Mann-Whitney). (I) mRNA expression by qRT-PCR of up- or down-regulated genes (J) presenting AP-1 binding sites in their regulatory regions in primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fosl1 (n = 3) (means ± SEM, Mann-Whitney test).

    To directly and functionally assess the importance of Fosl1 in the cell autonomous Vegfa/Flt1 signaling that promotes psoriasis development, we performed short hairpin RNA (shRNA) knockdown of Fosl1 in mouse cultured keratinocytes in vitro and assessed the impact of Fosl1 down-regulation on chromatin remodeling and change in gene expression mediated by Vegfa signaling. Primary culture of keratinocytes from epidermis was infected with lentiviruses expressing shRNA against Fosl1, stimulated or not with Vegfa (50 ng/ml) (Fig. 6, D to F) and then assessed for change in gene expression and chromatin accessibility using real-time ATAC-PCR and qRT-PCR (Fig. 6, G to J). It is important to note that the addition of Vegfa to primary cultured keratinocytes is important, as the level of Vegfa by the Rosa promoter may not be strong enough to promote angiogenesis in the absence of secretion of other angiocrine factors by the keratinocytes in response to autocrine Vegfa signaling in those cells. In addition, Vegfa induced the phosphorylation of Flt1 in 293T cells transfected with Flt1-Flag expression plasmids and in keratinocytes in vitro (fig. S6, A to C), similarly to what has been reported in tumor cells (15, 29). Western blot analysis showed that Fosl1 shRNA down-regulated Fosl1 efficiently (Fig. 6, D and F). ATAC-PCR showed that Fosl1 knockdown blocked the chromatin remodeling associated with Vegfa/Flt1/AP-1 signaling in keratinocytes in vitro (Fig. 6, G and H), resulting in the absence of up- or down-regulation of these genes upon Vegfa signaling in vitro (Fig. 6, I and J). Together these results demonstrate the key role of Fosl1 in mediating chromatin remodeling and changes in gene expression associated with Vegfa/Flt1/AP-1 signaling during psoriasis development.

    DISCUSSION

    Our study uncovers the essential epidermal autonomous functions of Flt1 and Nrp1 in promoting Vegfa-induced psoriasis-like disease (fig. S7). Several case studies have previously reported the improvement of psoriatic disease in patients with cancer treated with anti-VEGFA antibodies or anti-VEGFA receptor small-molecule inhibitors (30, 31). Likewise, the use of anti-VEGFA inhibitors in different mouse models of psoriasis (K14-Vegfa, epidermal deletion of c-Jun/JunB) induced regression of the psoriasis phenotypes including epidermal hyperproliferation, thickness, altered differentiation, dermal immune infiltration, and increased angiogenesis (7, 8, 32, 33). In these studies, it was thought that anti-VEGFA therapy acts by targeting ECs and immune cells located in the dermis. In sharp contrast, our study shows that most of the psoriasis phenotypes mediated by Vegfa on keratinocytes, immune cells, and ECs are the consequences of Vegfa signaling in keratinocytes in an Flt1/Nrp1-dependent manner. The cell autonomous role of Flt1 and Nrp1 in Vegfa-induced psoriasis is reminiscent of the autocrine or paracrine role of Vegfa in promoting skin tumor progression and cancer stem cell function (14, 15).

    The decrease in neoangiogenesis and immune cell infiltration in the absence of Nrp1e Flt1 expression in the epidermis suggests that the keratinocytes are essential to orchestrate the vascular remodeling and immune cell infiltration. RNA-seq showed that upon Vegfa signaling, keratinocytes expressed chemoattractants for immune cells (e.g., S100A8/A9) and proangiogenic molecules (e.g., Adm), which together with Vegfa regulate the neoangiogenesis and immune infiltration associated with the psoriasis phenotype.

    By performing RNA-seq and ATAC-seq of FACS-isolated basal keratinocytes in the presence of Vegfa overexpression and in the presence or absence of Nrp1 or Flt1 expression, we defined the changes in the chromatin and transcriptional landscape associated with the cell autonomous signaling of Vegfa in mediating psoriatic-like disease. Our bioinformatics analysis of these molecular changes uncovers Fosl1 in regulating gene expression mediated by Vegfa/Flt1 signaling in keratinocytes. Moreover, the Vegfa/Flt1/Nrp1 keratinocyte cell autonomous epigenetic and transcriptional signatures uncovered here may represent novel biomarkers to predict the response of antipsoriatic treatments. The rapid improvement of psoriatic-like disease following the administration of anti-Nrp1 blocking antibodies that specifically target the interaction between Nrp1 and Vegfa demonstrates the therapeutic potential of blocking the Nrp1/Vegfa interaction in psoriasis.

    In conclusion, our study demonstrates a keratinocyte autonomous function of Nrp1 and Flt1 in mediating Vegfa signaling in the epidermis and the development of psoriatic-like disease in mice. These results have important implications for our understanding of the pathogenesis of psoriasis and open new avenues for psoriasis treatment.

    MATERIAL AND METHODS

    Study design

    The study was conducted on mouse models as described in the “Experimental models” section to perform in vivo and in vitro laboratory experiments. The sample size was not predetermined. We used a sample size allowing statistical significance to be reached between the different groups. No animals were excluded from the analysis. No technical replicates were used to calculate statistics. No randomization and no blinding were used in this study. For each experiment, we used biological-independent replicates per condition, and the number of replicate has been reported in the legends.

    Experimental models

    K14-Cre (34) mice were mated with Rosa26-VEGF-164 (35), Nrp1fl/fl (36), and Flt1fl/fl (37) mice. All mice used in this study were composed of males and females with mixed genetic background. Mouse colonies were maintained in a certified animal facility in accordance with the European guidelines and with approved ethical protocol (no. 526N).

    Primary cell culture

    Tail skin was removed from the tail bone and incubated overnight at 4°C in Hanks’ balanced salt solution (HBSS) (Gibco) and 0.25% trypsin (Gibco). The epidermis was then separated from the dermis and incubated on a rocking plate (100 rpm) at room temperature for 5 min. Basal cells were mechanically separated from the epidermis by flushing 10 times under the epidermis. Trypsin was then neutralized by adding Dulbecco’s modified Eagle’s medium. (DMEM) (Gibco) supplemented with 5% Chelex fetal calf serum (FCS) and filtrated on a 70-μm filter (Falcon). Cells were cultured in MEM supplemented with 10% FBS, hydrocortisone (0.4 μg/ml), epidermal growth factor (10 ng/ml), 2 × 10−9 MT3, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamine and incubated at 37°C with 20% O2 and 5% CO2. Twenty-four hours later, the cells were treated with recombinant vascular endothelial growth factor (VEGF) (50 ng/ml; R&D).

    Virus production, infection, and selection

    Stable knockdown cell lines were generated using lentiviral pLKO/PuroR vectors (Sigma-Aldrich) after puromycin selection (2.5 μg/ml). Knockdown was confirmed by qRT-PCR and Western blot. Three different shRNAs (NM_010235.1-664s1c1, NM_010235.1-1050s1c1, and NM_010235.1-851s1c1) were used to target the same gene.

    For virus production, 5 × 106 human embryonic kidney (HEK) 293T cells were seeded into 10-cm dishes and transfected with the vector of interest and appropriate packaging plasmids psPax2 and pMD2.G (12260 and 12259, respectively; Addgene). Medium was changed 24 hours later, and supernatants were collected at 48 hours and passed through a 0.45-μm filter. Keratinocytes were plated in six-well plate cells and incubated with viruses (40 μl/ml) when they reach 50% of confluence in the presence of polybrene (5 μg/ml). Medium was changed 24 hours later, and infected cells were selected by puromycin (5 μg/ml) for at least 1 week.

    Antibodies

    The following primary antibodies were used: anti-Ki67 (rabbit, 1:200, Abcam, catalog number ab15580), anti-K14 (rabbit, 1:1.000, Thermo Fisher Scientific, catalog number PA5-28002), anti-Nrp1 (goat, 1:100, R&D, catalog number AF 566), anti-CD31 (rat, 1:200, BD Biosciences, Clone MEC13.3, catalog number 550274), anti-CD45 (rat, 1:500, BD Biosciences, clone 30F11, catalog number 12-0451/553081), anti-Fosl1 (mouse, 1:500,Santa Cruz, clone C12, catalog number sc-28310), CD4 (rat, 1:100, BD Biosciences, clone RM4-5, catalog number 565650), CD8 (rabbit, 1:100, Abcam, catalog number ab203035), CD19 (rat, 1:100, BD Biosciences, clone 1D3, catalog number 561737), Ly6G (rat, 1:100, BioLegend, clone 1A8, catalog number 177603), F4/80 (rat, 1:500, Serotec, clone A3-1, catalog number MCA497 GA), TLR4 (rabbit, 1:100, Abcam, ab22048), and ISM1 (rabbit, 1:100, Abcam ab103338). The following secondary antibodies were used: anti-rabbit, anti-rat, and anti-chicken conjugated to Alexa Fluor 488 (1:400, Molecular Probes), to Rhodamine Red-X, or to Cy5 (1:400, Jackson ImmunoResearch).

    Western blot analysis

    Keratinocytes were lysed in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer for 4 hours on ice and then centrifuged for 10 min at 14.000 rpm at 4°C. Forty micrograms of cell lysate was loaded in 4/12% bis/tris-acrylamide gel (Invitrogen) and separated by electrophoresis. Proteins were transferred on polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes. The membranes were incubated overnight with anti-Nrp1 (goat, 1:200, R&D, catalog number AF 566) or anti-Flt1 (mouse, 1:1000, Santa Cruz, clone H-225, catalog number sc-9029) or anti-Fosl1 (mouse, 1:1000, Santa Cruz, clone C12, catalog number sc-28310) or Flt1 (rabbit, 1:1000, Abcam, ab3252) or anti–phospho-Flt1 Y1213 (rabbit, 1:1000, R&D, catalog number AF4170), (mouse, 1:1.000, Cell Signaling, catalog number 9106), anti–HA (human influenza hemagglutinin tag) (mouse, 1:1000, Sigma-Aldrich, catalog number: 11583816001), and anti–β-actin (1:3000, Abcam, catalog number ab8227). Anti-mouse or anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (1:3000 or 1:10,000; Healthcare) was used as the secondary antibody.

    Immunoprecipitation assay

    hFlt1-HEK293 lysates were immunoprecipitated by incubation with anti-HA (1 μg of antibody per 1.5 mg of protein, rabbit,, Abcam, ab9110) coupled to Protein G Dynabeads (Invitrogen, catalog number 10003D) overnight at 4°C. Proteins were eluted in sample buffer by heating to 70°C for 10 min. For Western blot analysis, equal amounts of total protein were loaded and resolved on a NuPAGE 4/12% bis/tris gel (Invitrogen) and transferred to a PVDF membrane. Blots were probed with specific antibodies for HA-tag (mouse, 1:1000, Sigma, catalog number 11583816001), Flt1 (rabbit, 1:1000, Abcam, ab3252), and anti-PFlt1 (rabbit, 1:1.000, R&D, Y1213). Enhanced chemiluminesence anti-mouse or anti-rabbit IgG conjugated with HRP (1:3000 or 1:10,000; Healthcare) was used as the secondary antibody.

    Phosphorylation assay for Flt1

    Cells were serum starved for 12 hours and stimulated either by rVEGFA (50 ng/ml; R&D, catalog number 293 CF) or by hPLGF (human placental growth factor) (50 ng/ml; R&D, catalog number 264-PGB). We used as control condition nonstimulated transfected hFlt1-HEK293 cells as previously described (13).

    Nrp1 antibody treatment

    Mice were treated by Nrp1-blocking antibodies: anti-Nrp1a, which blocks binding of semaphorins, and anti-Nrp1b, which blocks binding of Vegfa (Genentech, 10 mg/kg) by intraperitoneal injection, two times per week during 15 days as described previously for tumor models (14, 26). The antibodies were generated and provided by Genentech.

    Histology and immunostaining

    Skin was embedded in OCT (optimal cutting temperature) (Tissue-Tek). Samples were sectioned at 4- to 6-μm sections using CM3050S cryostat (Leica Microsystems GmbH). For the staining on frozen sections, tissues were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature, and then washed in phosphate-buffered saline (PBS). Nonspecific antibody binding was blocked with 5% horse serum, 1% bovine serum albumin, and 0.2% Triton X-100 during 1 hour at room temperature. Primary antibodies were incubated overnight at 4°C in blocking buffer. Sections were rinsed in PBS and incubated with secondary antibodies during 1 hour at room temperature. Nuclei were stained with Hoechst (4 mM). Slides were mounted using Glycergel (Dako) supplemented with 2.5% DABCO (Sigma-Aldrich). For the staining on paraffin sections, 4-μm paraffin sections were deparaffinized and rehydrated. Antigen unmasking was performed in citrate buffer (pH 6) at 98°C for 20 min using the PT (pre-treatment) module. Endogenous peroxidase was blocked using 3% H2O2 (Merck) in methanol for 20 min at room temperature. Endogenous avidin and biotin were blocked using the Endogenous Blocking kit (Invitrogen) for 20 min at room temperature. Primary antibodies were incubated overnight at 4°C. Anti-mouse biotinylated secondary antibodies, as well as Standard ABC kit, and ImmPACT DAB (Vector Laboratories) were used for the detection of HRP activity. Slides were mounted using SafeMount (Labonord).

    Image acquisition

    Microscopic imaging was performed on a Zeiss Axio Imager M1 (Thornwood) fluorescence microscope with a Zeiss Axiocam MR3 camera and a Zeiss Axiocam MRC5 camera for bright-field microscopy using the Axiovision release 4.6 software. Brightness, contrast, and picture size were adjusted using Photoshop CS6 (Adobe). Macroscopic imaging were performed using a Leica DFC 420C camera with an objective Leica 10446261 0.63×.

    FACS isolation of epithelial cells for RNA sequencing

    Tail skin was removed from the tail bone and incubated overnight at 4°C in HBSS (Gibco) and 0.25% trypsin (Gibco).The epidermis was then separated from the dermis and incubated on a rocking plate (100 rpm) at room temperature for 5 min. Basal cells were mechanically separated from the epidermis by flushing 10 times under the epidermis. Tissues were then cut into small pieces with a scalpel and incubated again for 5 min on a rocking plate (100 rpm) at room temperature. Trypsin was then neutralized by adding DMEM (Gibco) supplemented with 5% Chelex-treated FCS, and the cells were mechanically separated by pipetting 10 times and filtrated on a 70-μm filter (Falcon). Cells were incubated in 2% FCS/PBS with primary antibodies for 30 min on ice. Cells were washed with 10 ml of 2% FCS/PBS and then incubated for 30 min in APC (allophycocyanin)–conjugated streptavidin (BD Biosciences), and then washed again and resuspended in 200 μl of 2% FCS/PBS with Hoechst (10 mg/ml) diluted at 1:4000. Living epidermal cells were gated by forward scatter, side scatter, and negative for Hoechst. Basal interfollicular epidermis keratinocytes were stained using fluorescein isothiocyanate–conjugated anti–α6 integrin (clone GoH3, 1:200, eBioscience, catalog number MAB1378) and biotinylated CD34 (clone RAM34, 1:50, BD Biosciences, catalog number 13-0341), followed by avidin/APC-streptavidin used to stain and exclude hair follicle stem cells. Basal keratinocytes were isolated on the basis of α6 integrin expression with exclusion of CD34-positive cells. In Vegfa overexpression conditions, basal keratinocytes expressing the transgene are GFP positive, and we labeled basal keratinocytes using PE-conjugated anti–α6 integrin (clone GoH3, 1:200, eBioscience, catalog number MAB1378), and bulge cells were labeled with biotinylated CD34 (clone RAM34, 1:50, BD Biosciences). We used PE-conjugated anti-CD45 (clone 30-f11, 1:200, eBioscience, catalog number 12-0451/553081), PE-conjugated anti-CD31 (clone MEC13.3; 1:100, BD PharMingen, catalog number 550274), and PE-conjugated anti-Pdgfrα (clone APA-5, 1:200 eBioscience, catalog number12-1401/624049) to exclude dermal cells and avoid dermal contamination, and anti-mouse/human CD11b (clone M1/70, BioLegend), anti-mouse CD16/32 (clone 93, BioLegend), anti-mouse Ly6C (HK1.4, BioLegend), and anti-mouse Ly6G (1A8, BioLegend) were used to gate for neutrophils, macrophages, and monocytes. FACS analysis was performed using FACSAria I at high pressure (70 psi) and FACSDiva software (BD Biosciences). Sorted cells were collected into lysis buffer for RNA extraction.

    RNA extraction and real-time RT-PCR

    RNA extraction from FACS-isolated cells was performed using the RNAeasy Micro Kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s recommendations with DNAse (deoxyribonuclease) treatment. After NanoDrop RNA quantification, the first-strand cDNA was synthesized using Superscript II (Invitrogen) and random hexamer (Roche) in 50 μl of final volume. Control of genomic contamination was measured for each sample by performing the same procedure with or without reverse transcriptase. qPCR assays were performed using 1 ng of cDNA as template, SYBR Green Mix (Applied Bioscience) and a LightCycler 96 (Roche) real-time PCR system. β-Actin housekeeping gene was used for normalization. Primers were designed using the Roche Universal Probe library assay design center: https://lifescience.roche.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?tab=Assay+Design+Center&identifier=Universal+Probe+Library&langId=-1. qPCR analysis was performed using LightCycler 96 (Roche) real-time PCR system and the DDCT (Delta Delta CT) method with β-actin as a reference.

    List of primers

    Primers used for RT-qPCR are listed in Table 1.

    Table 1 List of qPCR primers for mouse.

    ATAC-seq and library preparation

    ATAC followed by sequencing was performed as follows: 100,000 sorted cells were collected in 1 ml of PBS and 3% FBS at 4°C. Cells were centrifuged, and then cell pellets were resuspended in 100 μl of lysis buffer (10 mM tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, and IGEPAL 0.1%) and centrifuged (500g) for 25 min at 4°C. Supernatant was discarded, and nuclei were resuspended in 50 μl of reaction buffer (2.5 μl of Tn5 transposase, 22.5 μl of tagmentation DNA buffer, and 25 μl of H2O-Nextera DNA Sample Preparation Kit, Illumina). The reaction was performed for 30 min at 37°C and then blocked by the addition of 5 μl of clean-up buffer (900 mM NaCl and 300 mM EDTA). DNA was purified using the minElute purification kit (QIAGEN) following the manufacturer’s protocol. DNA libraries were PCR amplified (Nextera DNA Sample Preparation Kit, Illumina) and size selected from 200 to 800 base pairs (bp) (BluePippin, Sage Sciences) following the manufacturer’s recommendations.

    Samples for the ATAC qPCR experiment were processed in the same manner, and primers were designed around the control region and peak region. Primers are listed in Table 2.

    Table 2 List of ATAC qPCR primers.

    ATAC-seq analysis

    Two samples of control, K14-Vegfa and K14-Vegfa/Nrp1 cKO, and one sample of K14-Vegfa/Flt1 cKO were sequenced. ATAC-seq paired-end reads of 50 bp were trimmed for adaptor sequences using Trimmomatic. ATAC-seq paired-end reads were then aligned to the mouse GRCm38 genome using Bowtie2 (version 2.2.6) using options “-X 2000 –fr –very- sensitive –no-discordant –no-unal –no-mixed –non-deterministic.” More than 18 million reads were mapped to mouse genomic DNA in each condition (between 18 and 86 millions). Mitochondrial reads and reads aligned to scaffolds and undefined chromosomes were excluded from downstream analysis.

    Reads with a mapping quality lower than 20 were eliminated with samtools, and duplicated reads were removed by Picard tools (http://broadinstitute.github.io/picard/). Read start sites were adjusted to represent the center of the transposon binding event as described in (38). Peak calling was performed on each individual sample using Macs2 (version 2.1.0.20151222) with parameter setting of “callpeak -f BAMPE -g mm -q 0.05 –nomodel –call-summits -B – SPMR.” Peaks from all ATAC-seq samples were merged for downstream analysis using bedtools. Pileup bedgraph files generated by MACS2 were transformed to tdf files with Integrative Genomics Viewer (IGV) tools, allowing the visualization of alignment data tracks by IGV. Read counts of each merged peaks for each individual sample were calculated by HTSeq-count using options “-s no -m intersection-nonempty.” These counts were normalized for 1 million of mapped reads in merged peaks, and fold of change was computed for all pairwise comparisons on the means of read counts (for control, K14-Vegfa, and K14-Vegfa/Nrp1 cKO) or on the read count (for K14-Vegfa/Flt1 cKO). Peaks up-regulated were defined as those having at least a twofold change, and merged peaks nonintersecting a peak called with a q value of 0.05 in the up-regulated condition were removed. Peaks were associated to genes with the GREAT software with the following association rules: “basal plus extension” with parameters 5.0 kb in proximal upstream, 1.0 kb in proximal downstream, and 100.0 kb in distal.

    Motif analysis

    De novo motif search was performed using the findMotifsGenome.pl program in the HOMER package with parameter setting of “-size -250,250 -S 15 -len 6,8,10,12,16.” Incidences of specific motif were examined by the program of annotatePeaks.pl in the HOMER package with default parameters.

    GO analysis

    Genes up- or down-regulated between were tested for enrichment in each GO class using the DAVID web server. Statistically significant enrichments correspond to those presenting a Benjamini-corrected P value less than or equal to 0.05.

    Quantification and statistical analysis

    All the statistical analyses were based on biological replicates (n is indicated in the text, figures, or figure legends). The statistical tests used for each experiment have been added to the corresponding figure legends. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 7.00 for Windows (GraphPad Software). Before performing the statistical analysis, we checked the distribution of the data by performing the Shapiro-Wilkinson test, and we checked the equality of variances between two comparisons by performing the Fisher-Snedecor test. Comparisons between two groups were carried out using an unpaired two-tailed Student’s t test if the data were normally distributed and if the variances were equal between the two comparisons. Comparisons between two groups were carried out using the Welsh test if the data were normally distributed and if the variances were not equal between the two comparisons. If the data were not normally distributed, Mann-Whitney test was performed. Data are presented as the arithmetic means ± SEM. The normality of the distribution of the data and the equality of the variances between the groups were verified. Based on this, the means of the groups were compared using the most appropriate comparison tests as summarized in Table 3.

    Table 3 Statistical analysis performed for each experiment.

    Acknowledgments: We thank the ULB animal facility and ULB genomic core facility. We thank F. Willaert and N. Cuylits for providing human samples. Funding: F.B. was supported by the Fond Erasme. B.S. is supported by the FNRS. Y.S. is supported by the TELEVIE. C.B. is supported by the WELBIO, FNRS, ULB Foundation, the Foundation Baillet Latour, and the European Research Council (EXPAND). M.S. is supported by grants from the Austrian Science Fund (FWF, PhD program W1212 “Inflammation and Immunity”), the European Research Council (ERC) Advanced grant (ERC-2015-AdG TNT-Tumors 694883), the WWTF-project LS16-025, and the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement no. 766214 (Meta-Can). Author contributions: C.B. and F.B. designed the experiments and performed the data analysis. F.B. performed most of the experiments. E.G. and M.S. designed and performed the experiments in the c-Jun/JunB psoriasis model. A.B., B.S., and Y.S. performed the bioinformatics analysis. V.d.M. cosupervised the study. M.R. and C.P. provided technical support. C.D. performed FACS isolation. C.B. and F.B. wrote the manuscript. Competing interests: The authors have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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    INTRODUZIONE

    La psoriasi è un disturbo infiammatorio cutaneo frequente che colpisce circa il 3% della popolazione mondiale (1). La psoriasi vulgaris è il tipo più comune ed è caratterizzata da placche eritematose e squamose della pelle. La psoriasi vulgaris si verifica in genere nelle regioni dei gomiti, delle ginocchia o del cuoio capelluto. Oltre alle lesioni cutanee, nella psoriasi possono essere interessati diversi altri organi, tra cui l'artrite, la sindrome metabolica o la malattia infiammatoria intestinale, che contribuiscono tutti al carico della malattia (1). Istologicamente, la psoriasi è caratterizzata da un hyperthickening dell'epidermide cutanea con aumento della vascolarizzazione e infiltrazione immunitaria del derma (2). Sebbene la psoriasi sia una malattia autoimmune, l'epidermide cutanea è anche un attore importante nella patogenesi iniziale della psoriasi e contribuisce al reclutamento di cellule infiammatorie e il cross-talk tra cellule epidermiche e cellule immunitarie è probabilmente importante per la patogenesi di psoriasi (2).

    Il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA), il principale fattore proangiogenico, è sovraespresso nella pelle della psoriasi umana ed è correlato alla gravità della malattia (3). È stato suggerito un ruolo per VEGFA nella psoriasi VEGF posizione genomica nelle immediate vicinanze di PSORS1, uno dei locus di suscettibilità alla psoriasi e la correlazione del polimorfismo a singolo nucleotide in VEGF con gravità della psoriasi (4). La somministrazione di bevacizumab, un anticorpo monoclonale destinato al VEGFA, per il trattamento dei tumori solidi è stata associata al miglioramento delle lesioni psoriasiche (5). Studi sperimentali hanno anche dimostrato l'efficacia della terapia con blocco VEGFA nel miglioramento del fenotipo cutaneo nei modelli murini di malattia simil-psoriasi (68).

    Modelli di topo transgenico che sovraesprimono VEGF nei cheratinociti porta allo sviluppo di una condizione infiammatoria della pelle che ricapitola i principali segni distintivi della psoriasi umana, supportando un ruolo chiave di VEGF espresso dai cheratinociti nel promuovere la malattia simile alla psoriasi (810). Tuttavia, i ruoli precisi svolti da VEGFA nella mediazione della psoriasi sono scarsamente compresi. VEGFA media i suoi effetti legandosi ai recettori tirosina chinasi Flt1 (VEGFR1) e Flk1 (VEGFR2) (11). La neuropilina 1 (Nrp1) agisce come un corecettore VEGFA amplificando la segnalazione VEGFA promuovendo la segnalazione del recettore VEGFR nelle stesse cellule (effetto cis) o presentando VEGFA alle cellule vicine (effetto trans) (12).

    Nonostante il ruolo ben noto di VEGFA nella psoriasi, il meccanismo molecolare con cui VEGA promuove la psoriasi non è ben compreso. Non è chiaro su quali cellule il VEGFA agisca per promuovere la psoriasi e i meccanismi molecolari a valle del VEGFA in questo processo. VEGFA agisce solo su vasi sanguigni o macrofagi, come è stato precedentemente suggerito (13), che a sua volta media il reclutamento di cellule infiammatorie e causa il difetto di differenziazione dei cheratinociti, oppure VEGFA agisce direttamente anche sulle cellule epidermiche in modo autocrino o paracrino per orchestrare i cambiamenti associati alla psoriasi, come è stato suggerito durante la tumorigenesi (14, 15)?

    Utilizzando modelli murini di psoriasi geneticamente modificati, abbiamo valutato il ruolo dell'espressione Nrp1 o Flt1 da parte delle cellule epidermiche per indurre lo sviluppo della psoriasi in modo autonomo cellulare. Inaspettatamente, abbiamo riscontrato che la cancellazione di NRP1 o Flt1 nella pelle l'epidermide impedisce completamente lo sviluppo della psoriasi seguente VEGF sovraespressione. Inoltre, la cancellazione epidermica di Flt1 nei topi con c-Jun / JunB eliminazione, uno dei modelli di topo meglio studiati della psoriasi (16), porta anche a un notevole miglioramento delle lesioni della psoriasi. Abbiamo dimostrato che la somministrazione terapeutica di anticorpi bloccanti Nrp1 ripristina lo sviluppo di lesioni psoriasiche indotte da Vegfa.

    Combinazione di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile dalla trasposasi (ATAC-seq) su cellule epidermiche isolate con ordinamento a fluorescenza (FACS) VEGF sovraespressione in presenza o in assenza di Flt1 o NRP1 ha permesso l'identificazione della rete regolatrice genica a valle di Flt1 / Nrp1 nei cheratinociti che controllano lo sviluppo della psoriasi indotta da Vegfa. Insieme, i nostri risultati svelano una nuova funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche che promuove la psoriasi indotta da Vegfa e apre la strada a nuove opportunità terapeutiche per il trattamento della malattia psoriasica.

    RISULTATI

    L'espressione epidermica autonoma di Flt1 è essenziale per lo sviluppo della psoriasi indotta da Vegfa

    Come precedentemente riportato, VEGF sovraespressione nell'epidermide di topo con K14-Cre / Rosa-VEGF (K14-VEGF) induce una malattia simil-psoriasica (8), che appare 1 mese dopo la nascita e caratterizzato macroscopicamente da pelle rossa, lesioni squamose nell'orecchio e nella coda, nonché eritema grave ed edema della mucosa orale (fig. S1, A e B) e microscopicamente dall'iperplasia epidermide, differenziazione dei cheratinociti anormale, aumento della proliferazione delle cellule epidermiche, infiltrazione immunitaria e densità dei vasi sanguigni (fig. S1, da C a J). Queste caratteristiche macroscopiche e microscopiche rappresentano il segno distintivo delle lesioni cutanee psoriasiche nell'uomo (17). In questo modello di topo, diverse popolazioni di cellule esprimono recettori e corecettori di Vegfa. Le cellule endoteliali (EC) esprimono VEGFR2 / Flk1 (18), VEGFR1 / Flt1 (19) e il suo coreceptor Nrp1 (20). Flt1 è anche espresso da diverse cellule immunitarie (21), ma i recettori Vegfa espressi dai cheratinociti sono ancora oggetto di discussione (22, 23). Nrp1 è un corecettore di Vegfa, che promuove la segnalazione di Vegfa in trans presentando Vegfa ad altri immunitari ed EC o in cis promuovendo la segnalazione di Vegfa in modo autonomo cellulare12). Usando l'RNA-seq o la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), abbiamo scoperto che i cheratinociti basali esprimevano VEGFR1 / Flt1 e Nrp1, ma non VEGFR2 / Flk1 (fig. S1K).

    Valutare il ruolo autonomo cellulare dell'espressione di Flt1 da parte dei cheratinociti VEGFpsoriasi mediata, abbiamo eliminato Flt1 esclusivamente nell'epidermide usando K14-Cre / Rosa-Topi Vegfa / Flt1 flox / flox (K14-Vegfa / Flt1 cKO) (Fig. 1A). VEGF espressione di mRNA era comparabile in K14-VEGF e K14-Vegfa / Flt1 cKO topi (Fig. 1B), mentre Flt1 espressione è stata praticamente abolita ai livelli di mRNA e proteine ​​in K14-VEGF / Flt1 epidermide di cKO (Fig. 1, da B a D). Spessore epidermico, che è stato aumentato di tre volte in K14-VEGF epidermide, è stata normalizzata al livello di controllo in K14-Vegfa / Flt1 cKO epidermide (Fig. 1, F e G).

    Fig. 1 L'espressione di Flt1 da parte dei cheratinociti è essenziale per la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN) Strategia per l'attivazione costitutiva VEGF e inibire Flt1. (B) VEGF e Flt1 espressione di mRNA da qRT-PCR su cheratinociti isolati da FACS (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (C) Espressione di Flt1 valutata mediante Western blot su cheratinociti basali isolati FACS. (D) Espressione della proteina Flt1 (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (E) Naso-regione orale, orecchio e coda. (F) Ematossilina ed eosina (H&E) sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (sol) Spessore epidermico della coda misurato al microscopio (n = 10) (significa ± SEM, di Student t test). (H) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (io) Percentuale di cellule basali EdU-positive (BCs) nell'epidermide interfollicolare (IFE) (n = 398 (Ctrl), n = 436 (K14-Vegfa), n = 422 (K14-Vegfa / Flt1 cKO) BC totali, n = 10 topi) (media ± SEM, di Student t test). (J) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (K) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea (rappresenta l'area cutanea appena sotto l'IFE) di 300.565 μm2 (Ctrl), 289.678 μm2 (K14-VEGF) e 278.767 μm2 (K14-Vegfa / Flt1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). (L) Colorazione K14 / CD31. Barre di scala, 50 micron. (M) Numero di cellule CD31 positive (densità microvascolare) calcolate nell'area IFE cutanea di 324.567 μm2 (Ctrl), 345.234 μm2 (K14-VEGF) e 342.356 μm2 (K14-Vegfa / Flt1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD31 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    L'iperplasia dell'epidermide nella pelle psoriasica è associata ad un aumento della proliferazione dei cheratinociti basali (2). Mentre VEGF la sovraespressione ha aumentato la proliferazione basale dei cheratinociti (51% delle cellule positive a EdU (5′-etinil-2′-desossiuridina) in K14-VEGF contro il 17% per i topi di controllo), la cancellazione di Flt1 impedito l'aumento della proliferazione cellulare indotto da VEGF (19% di cellule positive a EdU) (Fig. 1, H e I).

    Pelle psoriasica indotta da VEGF la sovraespressione è anche caratterizzata da un'infiltrazione di cellule immunitarie (2). Per definire se Flt1 l'espressione nei cheratinociti controlla l'infiltrazione immunitaria indotta da VEGF sovraespressione, abbiamo eseguito l'immunocolorazione del CD45, un marcatore pan-leucocitario nell'epidermide cutanea di controllo, K14-VEGFe K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi. Flt1 la delezione nell'epidermide ha impedito completamente l'aumento del seguente infiltrato immunitario cutaneo VEGF sovraespressione (Fig. 1, J e K). Linfociti B CD19-positivi e macrofagi F4 / 80 sono stati le principali popolazioni di cellule immunitarie aumentate nel derma di K14-VEGF topi e sono diminuiti dopo l'epidermide Flt1 cancellazione (fig. S2, B e C).

    La neoangiogenesi è un'altra importante caratteristica che caratterizza la pelle psoriasica (24). Per determinare il ruolo dell'epidermide Nrp1 nella regolazione della neoangiogenesi indotta da VEGF espressione da cheratinociti, abbiamo eseguito immunocolorazione CD31 nell'epidermide cutanea e quantificato la densità microvascolare nei topi che esprimono o non esprimono Flt1 nell'epidermide. Mentre VEGF l'espressione da parte delle cellule epidermiche ha aumentato la densità microvascolare, la delezione di Flt1 nei cheratinociti ha normalizzato la densità microvascolare al livello riscontrato nei topi di controllo (Fig. 1, L e M).

    L'espressione epidermica di Nrp1 è necessaria per lo sviluppo della psoriasi mediata da Vegfa

    Per indagare se l'espressione di Nrp1 da parte delle cellule epidermiche regola la malattia simile alla psoriasi mediata da Vegfa, abbiamo sovraespresso VEGF e cancellato NRP1 specificamente ed esclusivamente nell'epidermide della pelle usando K14-Cre / Rosa-VEGF/Nrp1flox / flox topi (K14-Vegfa / Nrp1 cKO) (Fig. 2A). Il livello di VEGF L'espressione dell'mRNA nelle cellule epidermiche basali era comparabile tra K14-VEGF e K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi (Fig. 2B), mentre l'espressione di Nrp1 era praticamente non rilevabile nell'epidermide di K14-Vegfa / Nrp1 cKO topi sia a livello di mRNA che di proteine ​​(Fig. 2, da B a D). La cancellazione di NRP1 nei cheratinociti in K14-Vegfa / Nrp1 cKO i topi erano sufficienti a bloccare completamente lo sviluppo del fenotipo della psoriasi macroscopica (eritema e pelle squamosa) nella coda e nell'epidermide dell'orecchio indotta da VEGF sovraespressione (Fig. 2E). La cancellazione di NRP1 nell'epidermide ha anche impedito lo sviluppo di alterazioni microscopiche che hanno caratterizzato la pelle psoriasica, tra cui l'ipertensione epidermica, l'aumento della proliferazione dei cheratinociti basali, l'infiltrazione immunitaria e la densità microvascolare associata a VEGF sovraespressione (Fig. 2, da F a I).

    Fig.2 La funzione autonoma delle cellule di Nrp1 nell'epidermide è fondamentale per la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN) Strategia per l'attivazione costitutiva VEGF ed elimina NRP1 espressione nell'epidermide. (B) VEGF e NRP1 espressione di mRNA da qRT-PCR su cheratinociti isolati da FACS (n = 3) (significa ± SEM, test di Mann-Whitney). (C) Espressione Nrp1 valutata mediante Western blot eseguita su cheratinociti basali isolati FACS. (D) Espressione della proteina Nrp1 (n = 3) (significa ± SEM, test di Mann-Whitney). (E) Naso-regione orale, orecchio e coda. (F) H&E sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (sol) Spessore epidermico della coda misurato al microscopio (n = 10) (media ± SEM, di Student t test). (H) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (io) Percentuale di BC positivi per EdU (n = 507 (Ctrl), n = 487 (K14-Vegfa), n = 490 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO) BC totali; n = 10 topi) (significa ± SEM, di Student t test). (J) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (K) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea di 344.965 μm2 (Ctrl), 449.687 μm2 (K14-VEGF) e 423.876 μm2 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO); n = 10 topi. Cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). (L) Colorazione K14 / CD31. Barre di scala, 50 micron. (M) Numero di cellule CD31 positive calcolate in un'area cutanea IFE di 409.560 μm2 (Ctrl), 432.890 μm2 (K14-VEGF) e 428.532 μm2 (K14-Vegfa / Nrp1 cKO); n = 10 topi. Numero di cellule CD31 positive per 10000 μm2 (significa ± SEM, di Student t test). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    La malattia simile alla psoriasi indotta da VEGF non è stato influenzato dalla cancellazione di un singolo allele di nessuno dei due NRP1 o Flt1, mentre i topi eterozigoti composti (K14-VEGF / NRP1 + / CKO / Flt1 + / CKO) non presentava un fenotipo psoriasico ed erano indistinguibili dal completo NRP1 o Flt1 cKO (fig. S3, da A a H), che mostra quello Flt1 e NRP1 interagire geneticamente in modo epistatico per promuovere la psoriasi indotta da Vegfa. Insieme, questi dati dimostrano chiaramente la funzione autonoma cellulare essenziale di Flt1 e Nrp1 nel promuovere lo sviluppo della psoriasi indotta dalla sovraespressione di Vegfa.

    La somministrazione di anticorpi anti-Nrp1 bloccanti la funzione migliora il fenotipo della psoriasi indotto dalla sovraespressione di Vegfa

    Per valutare se inibire l'interazione Nrp1 / Vegfa può essere di rilevanza terapeutica per il trattamento della psoriasi, abbiamo somministrato a K14-VEGF topi un anticorpo anti-Nrp1 che blocca il legame di Vegfa (anticorpo Nrp1b) o il legame di semaforo (anticorpo Nrp1a) (Fig. 3, da A a C) (25, 26).

    Fig. 3 Gli anticorpi anti-Nrp1 bloccanti la funzione migliorano la psoriasi indotta da Vegfa.

    (UN per C) Regione nasale, orecchio e coda (D) H&E sulla pelle della coda. Barre di scala, 50 micron. (E) Misure di spessore epidermico (n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (F) Colorazione K14 / EdU. Barre di scala, 50 micron. (sol) Percentuale di BC positivi per EdU (n = 387 (isotipo, giorno 0), n = 354 (isotipo, giorno 15), n = 424 (Nrp1b AB, giorno 0), n = 409 (Nrp1b AB, giorno 15), n = 391 (Nrp1a AB, giorno 0), n = 421 (Nrp1a AB, giorno 15) BC totali, n = 3) (significa ± SEM, Mann-Whitney). (H) Colorazione K14 / CD45. Barre di scala, 50 micron. (io) Densità di cellule CD45 positive nell'area IFE cutanea di 254.342 μm2 (isotipo, giorno 0), 298.567 μm2 (isotipo, giorno 15), 267.890 μm2 (Nrp1b AB, giorno 0), 287.908 μm2 (Nrp1b AB, giorno 15), 257.560 μm2 (Nrp1a AB, giorno 0), 294.901 μm2 (Nrp1a AB, giorno 15); n = 10. Numero di cellule CD45 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, Mann-Whitney). (J) Colorazione K14 / CD31. Barra della scala, 50 micron. (K) Densità microvascolare nell'area IFE dermica di 267.980 μm2 (isotipo, giorno 0), 234.589 μm2 (isotipo, giorno 15), 222.370 μm2 (Nrp1b AB, giorno 0), 223.456 μm2 (Nrp1b AB, giorno 15), 200.154 μm2 (Nrp1a AB, giorno 0) e 212.980 μm2 (Nrp1a AB al giorno 15). Numero di cellule CD31 positive per 10.000 μm2 (significa ± SEM, Mann-Whitney). Credito fotografico: Benhadou Farida, Laboratorio di cellule staminali e cancro.

    Lo spessore epidermico è stato rapidamente normalizzato in seguito alla somministrazione dell'anticorpo anti-Nrp1 che blocca l'interazione Nrp1 / Vegfa (Fig. 3, D ed E). Allo stesso modo, iperproliferazione dei cheratinociti, infiltrazione immunitaria e aumento della densità microvascolare indotta da VEGF anche la sovraespressione è stata rapidamente normalizzata in seguito alla somministrazione dell'anticorpo anti-Nrp1 che blocca l'interazione di Vegfa, mentre non è stato osservato alcun miglioramento della psoriasi dopo la somministrazione dell'anticorpo Nrp1 che blocca l'interazione di semaforo (Fig. 3, da F a K). Questi dati dimostrano il beneficio terapeutico del blocco dell'interazione di Vegfa / Nrp1 per il trattamento della psoriasi.

    L'espressione epidermica autonoma di Flt1 è essenziale per lo sviluppo della psoriasi indotta da c-Jun / JunB cancellazione

    Abbiamo quindi valutato se il ruolo essenziale di Flt1 nelle cellule epidermiche sia conservato in diversi modelli murini di psoriasi. A tal fine, abbiamo indotto la cancellazione di Flt1 nella pelle epidermide di c-Jun / JunB topi cKO, uno dei modelli di topo più comunemente usati della psoriasi (16, 27). In questo modello, i topi sviluppano una forte malattia simile alla psoriasi 2 settimane dopo c-Jun / JunB cancellazione condizionale (fig. S4, A e B) (16).

    Delezione epidermica di Flt1 in questo modello (c-Jun / JunB / Flt1 triple cKO) ha ridotto la gravità delle lesioni della psoriasi sia macroscopicamente che microscopicamente con una diminuzione dello spessore epidermico (fig. S4, C e D). L'infiltrato immunitario all'interno dell'epidermide, che consiste principalmente di neutrofili in questo modello, è stato normalizzato sull'epidermide Flt1 cancellazione (fig. S4, da E a G). La densità microvascolare è stata anche normalizzata alla delezione di Flt1 (fig. S4, da G a I). Questi dati dimostrano la funzione conservata di Flt1 nelle cellule epidermiche per mediare lo sviluppo della psoriasi attraverso diversi modelli di topi della psoriasi.

    Paesaggio trascrizionale associato alla segnalazione di Vegf / Flt1 / Nrp1 nella psoriasi

    Per definire i meccanismi molecolari che regolano la funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche per avviare la formazione della psoriasi, abbiamo prima definito la firma trascrizionale delle cellule epidermiche indotte da Vegfa in presenza o assenza di Flt1 e Nrp1. A tal fine, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA su cheratinociti basali isolati FACS dal controllo, K14-VEGF, K14-Vegfa / Nrp1 cKOe K14-Vegfa / Flt1 cKO topi.

    La maggior parte dei geni è regolata da VEGF (382 di 968 geni (40%), P = 10-17) non sono stati più sottoposti a up-regolazioni neanche dopo Flt1 o NRP1 eliminazione, dimostrando che il nucleo dei cambiamenti trascrizionali che si verificano dopo la sovraespressione di Vegfa nelle cellule epidermiche è coregulato da Flt1 e Nrp1 (Fig. 4A). Al contrario, 243 dei 968 geni up-regolati da Vegfa (25%, P = 10-12) erano up-regolati da Vegfa in tutte le condizioni indipendentemente dall'espressione di Nrp1 e Flt1 da parte dei cheratinociti, e quindi rappresentano i geni che sono regolati da Vegfa nei cheratinociti indipendentemente dall'espressione di Flt1 / Nrp1 nelle cellule epidermiche (Fig. 4A). Infine, 226 di 968 geni (23%, P = 10-12) up-regolato da Vegfa non era più up-regolato da Vegfa in seguito Flt1 cancellazione in K14-Vegfa / Flt1 cKO ma normalmente erano sotto-regolati in seguito NRP1 eliminazione e 117 di 968 geni (12%, P = 10-11) non erano più sovraregolati in assenza di NRP1 ma normalmente regolato in assenza di Flt1 (Fig. 4A). Questi dati indicano che la stragrande maggioranza dei geni sovraregolati da Vegfa nell'epidermide dipendevano dall'espressione di Flt1 e Nrp1 da parte dei cheratinociti.

    Fig. 4 Paesaggio trascrizionale associato alla segnalazione Nrp1 / Flt1 / Vegfa nella psoriasi.

    (UN) Grafico a torta che mostra la percentuale di geni up-regolati totali in K14-VEGF e a seconda del comune Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 espressione dipendente). Sono stati rappresentati anche geni con espressione invariata dopo ablazione epidermica Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1-geni indipendenti). (B) Analisi GO di geni up-regolati in VEGF sovraespressione in modo dipendente da Nrp1 e Flt1. (C) espressione relativa di mRNA di geni up-regolati da RNA-seq in VEGF sovraespressione nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (D) Grafico a torta che mostra la percentuale di geni down-regolati totali in K14-VEGF e in base all'espressione Nrp1 / Flt1 comune (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 espressione dipendente). Sono stati rappresentati anche geni con espressione invariata dopo l'ablazione epidermica Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1-geni giù indipendenti). (E) Analisi GO di geni down-regolati in VEGF sovraespressione in modo dipendente da Nrp1 e Flt1. (F) espressione relativa di mRNA di geni down-regolati da RNA-seq in VEGFtopi che esprimono iperespressione e in base all'espressione di Nrp1 o Flt1 nei cheratinociti isolati da FACS (n = 2) (significa ± SEM).

    L'ontologia genica (GO) dei geni sovraregolata da più del doppio della sovraespressione di Vegfa e in base all'espressione di Flt1 e Nrp1 da parte dei cheratinociti (382 di 968 geni) ha mostrato un arricchimento delle trascrizioni che regolano l'immunità (P = 108), proliferazione (P = 10-8) e differenziazione epidermica (P = 10-6), come precedentemente riportato nella psoriasi umana e in altri modelli murini di malattia simil-psoriasi (Fig. 4B). Abbiamo riassunto i geni top-regolati nella tabella S1. Alcuni di questi geni erano noti per essere coinvolti nella psoriasi, mentre molti altri non sono stati precedentemente implicati nella psoriasi ma regolano le funzioni cellulari potenzialmente rilevanti per lo sviluppo della psoriasi, come la regolazione della proliferazione e la differenziazione epidermica.

    Oltre ai geni up-regolati, anche la nostra analisi lo ha dimostrato VEGF la sovraespressione ha anche indotto la down-rule di 1225 geni di oltre due volte. La maggior parte dei geni down-regolati (602 dei 1225 geni (49%), P = 10-17) dipendevano dall'espressione di entrambi i Nrp1 e Flt1 da parte dei cheratinociti e di altri 227 su 1225 geni (19%, P = 10-10) dei geni down-regolati da Vegfa erano dipendenti da Flt1 ma indipendenti da Nrp1 (Fig. 4D). Solo l'8% (P = 10-7) dei geni down-regolati sono stati bloccati da NRP1 cancellazione, ma non Flt1 cancellazione (Fig. 4D). Inoltre, il 24% di questi geni (296 di 1225, P = 10-9) sono stati down-regolati da Vegfa indipendentemente dall'espressione di Nrp1 o Flt1 (Fig. 4D). GO dei geni down-regolati di oltre due volte da Vegfa in modo dipendente da Flt1 e Nrp1 (602 di 1225 geni) hanno mostrato arricchimento per le trascrizioni che inibiscono la proliferazione (P = 10-21), che regola la matrice extracellulare (ECM) (P = 10-9) e differenziazione epidermica (P = 10-6) (Fig. 4E). Abbiamo riassunto i principali geni down-regolati nella tabella S2.

    Insieme, i nostri dati hanno dimostrato che la maggior parte dei geni iper-regolati e sotto-regolati dalla sovraespressione di Vegfa nelle cellule epidermiche dipendevano dall'espressione di Flt1 e Nrp1 nei cheratinociti, suggerendo che il nucleo dei cambiamenti trascrizionali associati allo sviluppo della psoriasi indotto da Vegfa sia dipendente da una funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche.

    Rimodellamento della cromatina associato alla segnalazione di Vegfa / Flt1 / Nrp1 nella psoriasi

    Per comprendere più a livello globale i cambiamenti nel panorama della cromatina che si verificano durante la malattia simile alla psoriasi mediata da Vegfa e identificare i fattori di trascrizione (TF) e le reti di regolazione genica che controllano i cambiamenti nell'espressione genica associata allo sviluppo della psoriasi, abbiamo cheratinociti basali isolati FACS dal controllo, K14-VEGF, K14-Vegfa / Nrp1 cKOe K14-Vegfa / Flt1 cKO topi ed eseguito ATAC-seq, una tecnica che consente la mappatura delle regioni aperte della cromatina ad alta definizione e prevede i TF che regolano il rimodellamento della cromatina (28). Abbiamo prima definito il rimodellamento della cromatina associato alla psoriasi mediata da Vegfa valutando le regioni della cromatina (picchi di ATAC-seq) che sono cambiate di più del doppio tra K14-VEGF e controllare i topi. Abbiamo scoperto che 16.863 regioni della cromatina erano più aperte (P = 10-11) e 5829 regioni di cromatina erano più chiuse VEGF sovraespressione (P = 10-11). Tra i picchi sovraregolati dalla sovraespressione di Vegfa, abbiamo scoperto che 9964 picchi (59%, P = 10-15) non erano più regolamentati Flt1 o NRP1 cancellazione, 2703 picchi (16%, P = 10-10) non erano più regolamentati Flt1 solo eliminazione, 2366 picchi (14%, P = 10-11) non erano più regolamentati NRP1 solo cancellazione e 1830 picchi (11%, P = 10-7) sono rimasti invariati a seguito NRP1 o Flt1 cancellazione (Fig. 5A).

    Fig. 5 Paesaggio della cromatina associato alla segnalazione Nrp1 / Flt1 / Vegfa nella psoriasi.

    (UN) Percentuale dei picchi up-regolati totali in K14-VEGF e in base a Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 dipendente) o indipendente dall'espressione Nrp1 o Flt1 (= NRP1 / Flt1 indipendente). (B) Percentuale di picchi down-regolati e loro distribuzione nelle diverse categorie. (C) Motivi arricchiti di TF trovati nei picchi che erano regolati verso l'alto o verso il basso (D) in modo dipendente da Nrp1 / Flt1. P valore di arricchimento del motivo in picchi rispetto allo sfondo e percentuale di picchi contenenti il ​​motivo. (E) Percentuale dei picchi up-regolati totali in K14-VEGF sovrapposti con geni up-regolati e dipendenti dall'espressione Nrp1 / Flt1 (=NRP1 / Flt1 dipendente) o in particolare su Nrp1 (=NRP1 dipendente) o Flt1 (Flt1 dipendente) o indipendente dall'espressione Nrp1 o Flt1 (=Flt1 / NRP1 indipendente). (F) espressione di mRNA di geni up-regolati da RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (sol) Arricchito i motivi della trascrizione TF nei picchi sovraregolati in modo n. 1 / Flt1. (H) Percentuale di geni down-regolati totali e loro distribuzione nelle diverse categorie. (io) espressione di mRNA di geni down-regolati da RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (J) Arricchito i motivi TF nei picchi down-regolati in modo Nrp1 / Flt1-dipendente.

    Tra i picchi che erano sotto-regolati sulla sovraespressione di Vegfa, abbiamo scoperto che i picchi del 1723 (30%, P = 10-15) non erano più soggetti a down-regolazioni Flt1 e NRP1 eliminazione, 1444 picchi (25%, P = 10-13) non erano più regolamentati Flt1 solo eliminazione, 595 (picchi del 10%, P = 10-8) non erano più regolamentati NRP1 solo eliminazione e 2067 picchi (35%, P = 10-13) sono rimasti invariati NRP1 o Flt1 cancellazione (Fig. 5B). Abbiamo eseguito l'analisi del motivo del sito di legame TF sui picchi sovraregolati sulla sovraespressione di Vegfa in modo dipendente da Flt1 / Nrp1. Abbiamo trovato un arricchimento nei motivi TF corrispondente a Gata TF (26%, P = 10-185), TEAD TF (28%, P = 10-41), Egr1 (14%, P = 10-32), AP-1 (32%, P = 10-26), elica-elica-anello-elica (bHLH) TF (38%, P = 1 × 10-21) e Lumaca (14%, P = 10-11) (Fig. 5C). Tra i picchi che sono stati down-regolati sulla sovraespressione di Vegfa in modo dipendente da Flt1 / Nrp1, abbiamo trovato un arricchimento nei motivi di TF corrispondente a Klf TF (33%, P = 10-19) e homeobox TF (30%, P = 10-16) (Fig. 5D).

    Dopo aver assegnato i geni associati a ciascuno di questi picchi, abbiamo valutato da quale di questi picchi è sovraregolato VEGF sono stati associati ad un aumento dell'espressione genica di oltre due volte (picchi su / geni su) (Fig. 5E). Abbiamo scoperto che 937 geni si sentivano in questa categoria. Abbiamo quindi valutato quali di questi geni presentano ancora rimodellamento della cromatina dopo la delezione di Nrp1 o Flt1. La grande maggioranza di questi geni (70%, 660 su 937, P = 10-8) non ha presentato cambiamenti significativi in ​​queste regioni della cromatina in assenza di Flt e Nrp1, e solo il 5% (P = 10-5) di questi geni (48/937) presentavano il seguente rimodellamento della cromatina VEGF sovraespressione in assenza di Flt1 e Nrp1 (Fig. 5E), che mostra il ruolo chiave di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche per mediare il rimodellamento della cromatina indotto da VEGF sovraespressione. L'analisi GO dei picchi up-regolati / geni up-regolati che sono Nrp1 / Flt1 dipendenti ha rivelato che questi geni erano associati all'induzione delle fasi iniziali delle risposte immunitarie e ai geni indotti dall'interferone di tipo I (P = 10-7) (Fig. 5F e tabella S3).

    Per ottenere ulteriori approfondimenti sulla rete di regolazione genica che controlla la psoriasi, abbiamo eseguito analisi di arricchimento dei motivi delle regioni della cromatina che sono diventate più aperte durante lo sviluppo della psoriasi mediata da Vegfa. Tra i geni per i quali i picchi di ATAC-seq nelle loro regioni regolatorie sono stati aperti e accompagnati da un aumento dell'espressione genica in modo dipendente da Flt1 / Nrp1, abbiamo scoperto che i motivi TF più arricchiti in questi picchi erano i TF AP-1 ( 32% delle vette, P = 10-23), NF1 (18% dei picchi, P = 10-13), TF GATA (34% dei picchi, P = 10-11), P63 (18% delle vette, P = 10-11), Fattore di legame CCCTC (CTCF) (9% dei picchi, P = 10-11), TEAD (35%, P = 10-10), TFH bHLH (23%, P = 10-10), coerente con i motivi trovati su tutto il picco (Fig. 5G).

    Abbiamo quindi valutato quale dei picchi down-regolati in K14-VEGF l'epidermide è stata associata a una down-regolazione dell'espressione genica di oltre due volte (picchi giù / geni giù) (Fig. 5, H e I). Tra questi 467 geni, la stragrande maggioranza di essi non era più sotto-regolata Flt1 o Nrp1 cKO (60%, 279 su 467 per entrambi cKO, P = 10-8), 26% (123 di 467, P = 10-7) dopo l'eliminazione di Flt1 e il 4% (P = 10-7) a seguito della cancellazione di Nrp1, mentre solo il 10% di questi geni presentava rimodellamento della cromatina sull'espressione di Vegfa indipendentemente da Nrp1 e Flt1 (43 di 490, P = 10-6) (Fig. 5H).

    L'analisi della scoperta del motivo nei picchi down-regolati associati alla down-regolazione dell'espressione genica in modo dipendente da Flt1 / Nrp1 ha rivelato che i TF di Klf (26% dei picchi, P = 10-20), TF AP-1 (33% dei picchi, P = 10-14) e p63 (23% dei picchi, P = 10 × 10-13) erano i motivi di TF statisticamente più significativi arricchiti in questi picchi down-regolati (Fig. 5J).

    Insieme, questi dati dimostrano che la maggior parte del rimodellamento della cromatina associato all'attivazione o repressione genica indotta da Vegfa è mediata dalla funzione autonoma cellulare di Flt1 e Nrp1 nelle cellule epidermiche e identifica i TF associati al Vegfa rimodellante mediato dalla cromatina in un Flt1 – e modo Nrp1-dipendente.

    Fosl1 agisce a valle della segnalazione Vegfa / Flt1 nel promuovere la psoriasi

    I siti di legame dell'AP-1 erano tra i motivi di TF più significativamente arricchiti trovati nelle regioni della cromatina dei geni che erano sovraregolati in modo dipendente dalla Flt1 e dal Nrp1 durante la malattia simile alla psoriasi indotta da Vegfa. AP-1 rappresenta una famiglia di TF composta da Jun e Fos che funzionano come omo- o eterodimero e cancellazione epidermica di c-Jun / JunB porta a una malattia simile alla psoriasi nei topi (16).

    Molte delle regioni della cromatina di questi geni regolati da Vegfa che presentano siti di legame AP-1 non sono più state rimodellate quando Flt1 o Nrp1 sono stati eliminati dall'epidermide (32%, 211 su 660 dei geni sovraregolati; 33%, 92 di 279 dei geni down-regolati), coerentemente con un ruolo chiave per Flt1 / Nrp1 nella regolazione del rimodellamento della cromatina associato ai TF AP-1. L'analisi GO eseguita su geni up-regolati / picchi up-regolati e contenente motivi AP-1 ha mostrato arricchimento di geni correlati all'immunità (ad es. TLR4, art3, Ikzf2, Alox5ap, e Nlrc5) (fig. S5A). L'analisi GO eseguita su geni down-regolati / picchi down-regolati e contenente motivi AP-1 ha mostrato un arricchimento dei geni correlati all'ECM (ad es. Tgfb2, MMP13, Angioptl7, Ism1, e tnfrsf19) (fig. S5B).

    Questi geni erano similmente up-regolati o down-regolati dalla segnalazione di Vegfa nei cheratinociti in vitro-coltivati ​​e nell'epidermide cutanea in vivo (fig. S5, da C a F), sostenendo ulteriormente l'importanza di una cellula autonoma Vegfa / Flt1 / AP -1 segnalazione nei cheratinociti che media la psoriasi. Abbiamo confermato la sovraregolazione del recettore Toll-like 4 (TLR4) e la down-regolazione di Ism1 a livello proteico mediante immunofluorescenza sulle sezioni della pelle della coda (fig. S5G). Per determinare quali TF AP-1 trasmettono la segnalazione Vegfa per indurre il rimodellamento della cromatina e il cambiamento nell'espressione genica associata alla psoriasi, abbiamo valutato quali membri della famiglia AP-1 sono up o down-regolati in seguito VEGF sovraespressione. Abbiamo scoperto che tra i TF AP-1, solo Fosl1 era up-regolato da VEGF sovraespressione (Fig. 6A). La sovraespressione di Fosl1 non era più soggetta a regolamentazione eccessiva Flt1 cancellazione in K14-Vegfa / Flt1 cKO topi, mostrando l'importanza della segnalazione autonoma delle cellule Vegfa / Flt1 nel promuovere la sovraespressione di Fosl1. Inoltre, abbiamo anche dimostrato la sovraespressione di Fosl1 nelle cellule epidermiche mediante immunoistochimica sulla sezione della pelle nel K14-VEGF e cK-giu / giuB cKO modelli di psoriasi (fig. S6, B e C).

    Fig.6 Fosl1 agisce a valle della segnalazione Vegfa / Flt1 nella regolazione del rimodellamento della cromatina e del cambiamento trascrizionale associato alla psoriasi.

    (UN) espressione di mRNA di membri AP-1 da parte di RNA-seq nei cheratinociti basali isolati FACS (n = 2) (significa ± SEM). (B) IHC (immunohistochemistry) of Fosl1 nuclear staining in tail epidermis. Scale bars, 10 μm. (C) IHC of Folsl1 in ear epidermis. Scale bars, 10 μm. (D) Fosl1 expression assessed by Western blot on primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa after transduction with control (sh Ctrl) or Fosl1-specific shRNA (sh Fosl1).(E) Protein expression of Fosl1 (n = 3). Histogram represents means ± SEM. (F) Vegfa e Fosl1 mRNA expression measured par qRT-PCR on primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fols1 (n = 3) (means ± SEM, Mann-Whitney). (G) Relative chromatin accessibility measured by ATAC qPCR of chromatin regions presenting AP-1 binding sites in the regulatory regions of up- or down-regulated genes (H) in primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fosl1 (n = 3). Primers were designed around the control region (c) and peak region (p) (means ± SEM, Mann-Whitney). (I) mRNA expression by qRT-PCR of up- or down-regulated genes (J) presenting AP-1 binding sites in their regulatory regions in primary cultured keratinocytes from K14-Vegfa transduced with sh Ctrl or sh Fosl1 (n = 3) (means ± SEM, Mann-Whitney test).

    To directly and functionally assess the importance of Fosl1 in the cell autonomous Vegfa/Flt1 signaling that promotes psoriasis development, we performed short hairpin RNA (shRNA) knockdown of Fosl1 in mouse cultured keratinocytes in vitro and assessed the impact of Fosl1 down-regulation on chromatin remodeling and change in gene expression mediated by Vegfa signaling. Primary culture of keratinocytes from epidermis was infected with lentiviruses expressing shRNA against Fosl1, stimulated or not with Vegfa (50 ng/ml) (Fig. 6, D to F) and then assessed for change in gene expression and chromatin accessibility using real-time ATAC-PCR and qRT-PCR (Fig. 6, G to J). It is important to note that the addition of Vegfa to primary cultured keratinocytes is important, as the level of Vegfa by the Rosa promoter may not be strong enough to promote angiogenesis in the absence of secretion of other angiocrine factors by the keratinocytes in response to autocrine Vegfa signaling in those cells. In addition, Vegfa induced the phosphorylation of Flt1 in 293T cells transfected with Flt1-Flag expression plasmids and in keratinocytes in vitro (fig. S6, A to C), similarly to what has been reported in tumor cells (15, 29). Western blot analysis showed that Fosl1 shRNA down-regulated Fosl1 efficiently (Fig. 6, D and F). ATAC-PCR showed that Fosl1 knockdown blocked the chromatin remodeling associated with Vegfa/Flt1/AP-1 signaling in keratinocytes in vitro (Fig. 6, G and H), resulting in the absence of up- or down-regulation of these genes upon Vegfa signaling in vitro (Fig. 6, I and J). Together these results demonstrate the key role of Fosl1 in mediating chromatin remodeling and changes in gene expression associated with Vegfa/Flt1/AP-1 signaling during psoriasis development.

    DISCUSSION

    Our study uncovers the essential epidermal autonomous functions of Flt1 and Nrp1 in promoting Vegfa-induced psoriasis-like disease (fig. S7). Several case studies have previously reported the improvement of psoriatic disease in patients with cancer treated with anti-VEGFA antibodies or anti-VEGFA receptor small-molecule inhibitors (30, 31). Likewise, the use of anti-VEGFA inhibitors in different mouse models of psoriasis (K14-Vegfa, epidermal deletion of c-Jun/JunB) induced regression of the psoriasis phenotypes including epidermal hyperproliferation, thickness, altered differentiation, dermal immune infiltration, and increased angiogenesis (7, 8, 32, 33). In these studies, it was thought that anti-VEGFA therapy acts by targeting ECs and immune cells located in the dermis. In sharp contrast, our study shows that most of the psoriasis phenotypes mediated by Vegfa on keratinocytes, immune cells, and ECs are the consequences of Vegfa signaling in keratinocytes in an Flt1/Nrp1-dependent manner. The cell autonomous role of Flt1 and Nrp1 in Vegfa-induced psoriasis is reminiscent of the autocrine or paracrine role of Vegfa in promoting skin tumor progression and cancer stem cell function (14, 15).

    The decrease in neoangiogenesis and immune cell infiltration in the absence of Nrp1e Flt1 expression in the epidermis suggests that the keratinocytes are essential to orchestrate the vascular remodeling and immune cell infiltration. RNA-seq showed that upon Vegfa signaling, keratinocytes expressed chemoattractants for immune cells (e.g., S100A8/A9) and proangiogenic molecules (e.g., Adm), which together with Vegfa regulate the neoangiogenesis and immune infiltration associated with the psoriasis phenotype.

    By performing RNA-seq and ATAC-seq of FACS-isolated basal keratinocytes in the presence of Vegfa overexpression and in the presence or absence of Nrp1 o Flt1 expression, we defined the changes in the chromatin and transcriptional landscape associated with the cell autonomous signaling of Vegfa in mediating psoriatic-like disease. Our bioinformatics analysis of these molecular changes uncovers Fosl1 in regulating gene expression mediated by Vegfa/Flt1 signaling in keratinocytes. Moreover, the Vegfa/Flt1/Nrp1 keratinocyte cell autonomous epigenetic and transcriptional signatures uncovered here may represent novel biomarkers to predict the response of antipsoriatic treatments. The rapid improvement of psoriatic-like disease following the administration of anti-Nrp1 blocking antibodies that specifically target the interaction between Nrp1 and Vegfa demonstrates the therapeutic potential of blocking the Nrp1/Vegfa interaction in psoriasis.

    In conclusion, our study demonstrates a keratinocyte autonomous function of Nrp1 and Flt1 in mediating Vegfa signaling in the epidermis and the development of psoriatic-like disease in mice. These results have important implications for our understanding of the pathogenesis of psoriasis and open new avenues for psoriasis treatment.

    MATERIAL AND METHODS

    Study design

    The study was conducted on mouse models as described in the “Experimental models” section to perform in vivo and in vitro laboratory experiments. The sample size was not predetermined. We used a sample size allowing statistical significance to be reached between the different groups. No animals were excluded from the analysis. No technical replicates were used to calculate statistics. No randomization and no blinding were used in this study. For each experiment, we used biological-independent replicates per condition, and the number of replicate has been reported in the legends.

    Experimental models

    K14-Cre (34) mice were mated with Rosa26-VEGF-164 (35), Nrp1fl/fl (36), and Flt1fl/fl (37) mice. All mice used in this study were composed of males and females with mixed genetic background. Mouse colonies were maintained in a certified animal facility in accordance with the European guidelines and with approved ethical protocol (no. 526N).

    Primary cell culture

    Tail skin was removed from the tail bone and incubated overnight at 4°C in Hanks’ balanced salt solution (HBSS) (Gibco) and 0.25% trypsin (Gibco). The epidermis was then separated from the dermis and incubated on a rocking plate (100 rpm) at room temperature for 5 min. Basal cells were mechanically separated from the epidermis by flushing 10 times under the epidermis. Trypsin was then neutralized by adding Dulbecco’s modified Eagle’s medium. (DMEM) (Gibco) supplemented with 5% Chelex fetal calf serum (FCS) and filtrated on a 70-μm filter (Falcon). Cells were cultured in MEM supplemented with 10% FBS, hydrocortisone (0.4 μg/ml), epidermal growth factor (10 ng/ml), 2 × 10−9 MT3, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamine and incubated at 37°C with 20% O2 and 5% CO2. Twenty-four hours later, the cells were treated with recombinant vascular endothelial growth factor (VEGF) (50 ng/ml; R&D).

    Virus production, infection, and selection

    Stable knockdown cell lines were generated using lentiviral pLKO/PuroR vectors (Sigma-Aldrich) after puromycin selection (2.5 μg/ml). Knockdown was confirmed by qRT-PCR and Western blot. Three different shRNAs (NM_010235.1-664s1c1, NM_010235.1-1050s1c1, and NM_010235.1-851s1c1) were used to target the same gene.

    For virus production, 5 × 106 human embryonic kidney (HEK) 293T cells were seeded into 10-cm dishes and transfected with the vector of interest and appropriate packaging plasmids psPax2 and pMD2.G (12260 and 12259, respectively; Addgene). Medium was changed 24 hours later, and supernatants were collected at 48 hours and passed through a 0.45-μm filter. Keratinocytes were plated in six-well plate cells and incubated with viruses (40 μl/ml) when they reach 50% of confluence in the presence of polybrene (5 μg/ml). Medium was changed 24 hours later, and infected cells were selected by puromycin (5 μg/ml) for at least 1 week.

    Antibodies

    The following primary antibodies were used: anti-Ki67 (rabbit, 1:200, Abcam, catalog number ab15580), anti-K14 (rabbit, 1:1.000, Thermo Fisher Scientific, catalog number PA5-28002), anti-Nrp1 (goat, 1:100, R&D, catalog number AF 566), anti-CD31 (rat, 1:200, BD Biosciences, Clone MEC13.3, catalog number 550274), anti-CD45 (rat, 1:500, BD Biosciences, clone 30F11, catalog number 12-0451/553081), anti-Fosl1 (mouse, 1:500,Santa Cruz, clone C12, catalog number sc-28310), CD4 (rat, 1:100, BD Biosciences, clone RM4-5, catalog number 565650), CD8 (rabbit, 1:100, Abcam, catalog number ab203035), CD19 (rat, 1:100, BD Biosciences, clone 1D3, catalog number 561737), Ly6G (rat, 1:100, BioLegend, clone 1A8, catalog number 177603), F4/80 (rat, 1:500, Serotec, clone A3-1, catalog number MCA497 GA), TLR4 (rabbit, 1:100, Abcam, ab22048), and ISM1 (rabbit, 1:100, Abcam ab103338). The following secondary antibodies were used: anti-rabbit, anti-rat, and anti-chicken conjugated to Alexa Fluor 488 (1:400, Molecular Probes), to Rhodamine Red-X, or to Cy5 (1:400, Jackson ImmunoResearch).

    Western blot analysis

    Keratinocytes were lysed in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer for 4 hours on ice and then centrifuged for 10 min at 14.000 rpm at 4°C. Forty micrograms of cell lysate was loaded in 4/12% bis/tris-acrylamide gel (Invitrogen) and separated by electrophoresis. Proteins were transferred on polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes. The membranes were incubated overnight with anti-Nrp1 (goat, 1:200, R&D, catalog number AF 566) or anti-Flt1 (mouse, 1:1000, Santa Cruz, clone H-225, catalog number sc-9029) or anti-Fosl1 (mouse, 1:1000, Santa Cruz, clone C12, catalog number sc-28310) or Flt1 (rabbit, 1:1000, Abcam, ab3252) or anti–phospho-Flt1 Y1213 (rabbit, 1:1000, R&D, catalog number AF4170), (mouse, 1:1.000, Cell Signaling, catalog number 9106), anti–HA (human influenza hemagglutinin tag) (mouse, 1:1000, Sigma-Aldrich, catalog number: 11583816001), and anti–β-actin (1:3000, Abcam, catalog number ab8227). Anti-mouse or anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (1:3000 or 1:10,000; Healthcare) was used as the secondary antibody.

    Immunoprecipitation assay

    hFlt1-HEK293 lysates were immunoprecipitated by incubation with anti-HA (1 μg of antibody per 1.5 mg of protein, rabbit,, Abcam, ab9110) coupled to Protein G Dynabeads (Invitrogen, catalog number 10003D) overnight at 4°C. Proteins were eluted in sample buffer by heating to 70°C for 10 min. For Western blot analysis, equal amounts of total protein were loaded and resolved on a NuPAGE 4/12% bis/tris gel (Invitrogen) and transferred to a PVDF membrane. Blots were probed with specific antibodies for HA-tag (mouse, 1:1000, Sigma, catalog number 11583816001), Flt1 (rabbit, 1:1000, Abcam, ab3252), and anti-PFlt1 (rabbit, 1:1.000, R&D, Y1213). Enhanced chemiluminesence anti-mouse or anti-rabbit IgG conjugated with HRP (1:3000 or 1:10,000; Healthcare) was used as the secondary antibody.

    Phosphorylation assay for Flt1

    Cells were serum starved for 12 hours and stimulated either by rVEGFA (50 ng/ml; R&D, catalog number 293 CF) or by hPLGF (human placental growth factor) (50 ng/ml; R&D, catalog number 264-PGB). We used as control condition nonstimulated transfected hFlt1-HEK293 cells as previously described (13).

    Nrp1 antibody treatment

    Mice were treated by Nrp1-blocking antibodies: anti-Nrp1a, which blocks binding of semaphorins, and anti-Nrp1b, which blocks binding of Vegfa (Genentech, 10 mg/kg) by intraperitoneal injection, two times per week during 15 days as described previously for tumor models (14, 26). The antibodies were generated and provided by Genentech.

    Histology and immunostaining

    Skin was embedded in OCT (optimal cutting temperature) (Tissue-Tek). Samples were sectioned at 4- to 6-μm sections using CM3050S cryostat (Leica Microsystems GmbH). For the staining on frozen sections, tissues were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature, and then washed in phosphate-buffered saline (PBS). Nonspecific antibody binding was blocked with 5% horse serum, 1% bovine serum albumin, and 0.2% Triton X-100 during 1 hour at room temperature. Primary antibodies were incubated overnight at 4°C in blocking buffer. Sections were rinsed in PBS and incubated with secondary antibodies during 1 hour at room temperature. Nuclei were stained with Hoechst (4 mM). Slides were mounted using Glycergel (Dako) supplemented with 2.5% DABCO (Sigma-Aldrich). For the staining on paraffin sections, 4-μm paraffin sections were deparaffinized and rehydrated. Antigen unmasking was performed in citrate buffer (pH 6) at 98°C for 20 min using the PT (pre-treatment) module. Endogenous peroxidase was blocked using 3% H2O2 (Merck) in methanol for 20 min at room temperature. Endogenous avidin and biotin were blocked using the Endogenous Blocking kit (Invitrogen) for 20 min at room temperature. Primary antibodies were incubated overnight at 4°C. Anti-mouse biotinylated secondary antibodies, as well as Standard ABC kit, and ImmPACT DAB (Vector Laboratories) were used for the detection of HRP activity. Slides were mounted using SafeMount (Labonord).

    Image acquisition

    Microscopic imaging was performed on a Zeiss Axio Imager M1 (Thornwood) fluorescence microscope with a Zeiss Axiocam MR3 camera and a Zeiss Axiocam MRC5 camera for bright-field microscopy using the Axiovision release 4.6 software. Brightness, contrast, and picture size were adjusted using Photoshop CS6 (Adobe). Macroscopic imaging were performed using a Leica DFC 420C camera with an objective Leica 10446261 0.63×.

    FACS isolation of epithelial cells for RNA sequencing

    Tail skin was removed from the tail bone and incubated overnight at 4°C in HBSS (Gibco) and 0.25% trypsin (Gibco).The epidermis was then separated from the dermis and incubated on a rocking plate (100 rpm) at room temperature for 5 min. Basal cells were mechanically separated from the epidermis by flushing 10 times under the epidermis. Tissues were then cut into small pieces with a scalpel and incubated again for 5 min on a rocking plate (100 rpm) at room temperature. Trypsin was then neutralized by adding DMEM (Gibco) supplemented with 5% Chelex-treated FCS, and the cells were mechanically separated by pipetting 10 times and filtrated on a 70-μm filter (Falcon). Cells were incubated in 2% FCS/PBS with primary antibodies for 30 min on ice. Cells were washed with 10 ml of 2% FCS/PBS and then incubated for 30 min in APC (allophycocyanin)–conjugated streptavidin (BD Biosciences), and then washed again and resuspended in 200 μl of 2% FCS/PBS with Hoechst (10 mg/ml) diluted at 1:4000. Living epidermal cells were gated by forward scatter, side scatter, and negative for Hoechst. Basal interfollicular epidermis keratinocytes were stained using fluorescein isothiocyanate–conjugated anti–α6 integrin (clone GoH3, 1:200, eBioscience, catalog number MAB1378) and biotinylated CD34 (clone RAM34, 1:50, BD Biosciences, catalog number 13-0341), followed by avidin/APC-streptavidin used to stain and exclude hair follicle stem cells. Basal keratinocytes were isolated on the basis of α6 integrin expression with exclusion of CD34-positive cells. In Vegfa overexpression conditions, basal keratinocytes expressing the transgene are GFP positive, and we labeled basal keratinocytes using PE-conjugated anti–α6 integrin (clone GoH3, 1:200, eBioscience, catalog number MAB1378), and bulge cells were labeled with biotinylated CD34 (clone RAM34, 1:50, BD Biosciences). We used PE-conjugated anti-CD45 (clone 30-f11, 1:200, eBioscience, catalog number 12-0451/553081), PE-conjugated anti-CD31 (clone MEC13.3; 1:100, BD PharMingen, catalog number 550274), and PE-conjugated anti-Pdgfrα (clone APA-5, 1:200 eBioscience, catalog number12-1401/624049) to exclude dermal cells and avoid dermal contamination, and anti-mouse/human CD11b (clone M1/70, BioLegend), anti-mouse CD16/32 (clone 93, BioLegend), anti-mouse Ly6C (HK1.4, BioLegend), and anti-mouse Ly6G (1A8, BioLegend) were used to gate for neutrophils, macrophages, and monocytes. FACS analysis was performed using FACSAria I at high pressure (70 psi) and FACSDiva software (BD Biosciences). Sorted cells were collected into lysis buffer for RNA extraction.

    RNA extraction and real-time RT-PCR

    RNA extraction from FACS-isolated cells was performed using the RNAeasy Micro Kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s recommendations with DNAse (deoxyribonuclease) treatment. After NanoDrop RNA quantification, the first-strand cDNA was synthesized using Superscript II (Invitrogen) and random hexamer (Roche) in 50 μl of final volume. Control of genomic contamination was measured for each sample by performing the same procedure with or without reverse transcriptase. qPCR assays were performed using 1 ng of cDNA as template, SYBR Green Mix (Applied Bioscience) and a LightCycler 96 (Roche) real-time PCR system. β-Actin housekeeping gene was used for normalization. Primers were designed using the Roche Universal Probe library assay design center: https://lifescience.roche.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?tab=Assay+Design+Center&identifier=Universal+Probe+Library&langId=-1. qPCR analysis was performed using LightCycler 96 (Roche) real-time PCR system and the DDCT (Delta Delta CT) method with β-actin as a reference.

    List of primers

    Primers used for RT-qPCR are listed in Table 1.

    Table 1 List of qPCR primers for mouse.

    ATAC-seq and library preparation

    ATAC followed by sequencing was performed as follows: 100,000 sorted cells were collected in 1 ml of PBS and 3% FBS at 4°C. Cells were centrifuged, and then cell pellets were resuspended in 100 μl of lysis buffer (10 mM tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, and IGEPAL 0.1%) and centrifuged (500g) for 25 min at 4°C. Supernatant was discarded, and nuclei were resuspended in 50 μl of reaction buffer (2.5 μl of Tn5 transposase, 22.5 μl of tagmentation DNA buffer, and 25 μl of H2O-Nextera DNA Sample Preparation Kit, Illumina). The reaction was performed for 30 min at 37°C and then blocked by the addition of 5 μl of clean-up buffer (900 mM NaCl and 300 mM EDTA). DNA was purified using the minElute purification kit (QIAGEN) following the manufacturer’s protocol. DNA libraries were PCR amplified (Nextera DNA Sample Preparation Kit, Illumina) and size selected from 200 to 800 base pairs (bp) (BluePippin, Sage Sciences) following the manufacturer’s recommendations.

    Samples for the ATAC qPCR experiment were processed in the same manner, and primers were designed around the control region and peak region. Primers are listed in Table 2.

    Table 2 List of ATAC qPCR primers.

    ATAC-seq analysis

    Two samples of control, K14-Vegfa and K14-Vegfa/Nrp1 cKO, and one sample of K14-Vegfa/Flt1 cKO were sequenced. ATAC-seq paired-end reads of 50 bp were trimmed for adaptor sequences using Trimmomatic. ATAC-seq paired-end reads were then aligned to the mouse GRCm38 genome using Bowtie2 (version 2.2.6) using options “-X 2000 –fr –very- sensitive –no-discordant –no-unal –no-mixed –non-deterministic.” More than 18 million reads were mapped to mouse genomic DNA in each condition (between 18 and 86 millions). Mitochondrial reads and reads aligned to scaffolds and undefined chromosomes were excluded from downstream analysis.

    Reads with a mapping quality lower than 20 were eliminated with samtools, and duplicated reads were removed by Picard tools (http://broadinstitute.github.io/picard/). Read start sites were adjusted to represent the center of the transposon binding event as described in (38). Peak calling was performed on each individual sample using Macs2 (version 2.1.0.20151222) with parameter setting of “callpeak -f BAMPE -g mm -q 0.05 –nomodel –call-summits -B – SPMR.” Peaks from all ATAC-seq samples were merged for downstream analysis using bedtools. Pileup bedgraph files generated by MACS2 were transformed to tdf files with Integrative Genomics Viewer (IGV) tools, allowing the visualization of alignment data tracks by IGV. Read counts of each merged peaks for each individual sample were calculated by HTSeq-count using options “-s no -m intersection-nonempty.” These counts were normalized for 1 million of mapped reads in merged peaks, and fold of change was computed for all pairwise comparisons on the means of read counts (for control, K14-Vegfa, and K14-Vegfa/Nrp1 cKO) or on the read count (for K14-Vegfa/Flt1 cKO). Peaks up-regulated were defined as those having at least a twofold change, and merged peaks nonintersecting a peak called with a q value of 0.05 in the up-regulated condition were removed. Peaks were associated to genes with the GREAT software with the following association rules: “basal plus extension” with parameters 5.0 kb in proximal upstream, 1.0 kb in proximal downstream, and 100.0 kb in distal.

    Motif analysis

    De novo motif search was performed using the findMotifsGenome.pl program in the HOMER package with parameter setting of “-size -250,250 -S 15 -len 6,8,10,12,16.” Incidences of specific motif were examined by the program of annotatePeaks.pl in the HOMER package with default parameters.

    GO analysis

    Genes up- or down-regulated between were tested for enrichment in each GO class using the DAVID web server. Statistically significant enrichments correspond to those presenting a Benjamini-corrected P value less than or equal to 0.05.

    Quantification and statistical analysis

    All the statistical analyses were based on biological replicates (n is indicated in the text, figures, or figure legends). The statistical tests used for each experiment have been added to the corresponding figure legends. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 7.00 for Windows (GraphPad Software). Before performing the statistical analysis, we checked the distribution of the data by performing the Shapiro-Wilkinson test, and we checked the equality of variances between two comparisons by performing the Fisher-Snedecor test. Comparisons between two groups were carried out using an unpaired two-tailed Student’s t test if the data were normally distributed and if the variances were equal between the two comparisons. Comparisons between two groups were carried out using the Welsh test if the data were normally distributed and if the variances were not equal between the two comparisons. If the data were not normally distributed, Mann-Whitney test was performed. Data are presented as the arithmetic means ± SEM. The normality of the distribution of the data and the equality of the variances between the groups were verified. Based on this, the means of the groups were compared using the most appropriate comparison tests as summarized in Table 3.

    Table 3 Statistical analysis performed for each experiment.

    Acknowledgments: We thank the ULB animal facility and ULB genomic core facility. We thank F. Willaert and N. Cuylits for providing human samples. Funding: F.B. was supported by the Fond Erasme. B.S. is supported by the FNRS. Y.S. is supported by the TELEVIE. C.B. is supported by the WELBIO, FNRS, ULB Foundation, the Foundation Baillet Latour, and the European Research Council (EXPAND). M.S. is supported by grants from the Austrian Science Fund (FWF, PhD program W1212 “Inflammation and Immunity”), the European Research Council (ERC) Advanced grant (ERC-2015-AdG TNT-Tumors 694883), the WWTF-project LS16-025, and the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement no. 766214 (Meta-Can). Author contributions: C.B. and F.B. designed the experiments and performed the data analysis. F.B. performed most of the experiments. E.G. and M.S. designed and performed the experiments in the c-Jun/JunB psoriasis model. A.B., B.S., and Y.S. performed the bioinformatics analysis. V.d.M. cosupervised the study. M.R. and C.P. provided technical support. C.D. performed FACS isolation. C.B. and F.B. wrote the manuscript. Competing interests: The authors have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.