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INTRODUZIONE

La psoriasi è una malattia cutanea autoinfiammatoria che colpisce dal 2 al 3% della popolazione mondiale (1, 2). È una malattia della pelle papulosquamous con morfologia ben nota di placche rosse coperte da squame bianche o d'argento sulla pelle (3, 4). Istologicamente, le lesioni psoriasiche presentano alcune caratteristiche definite di iperplasia epidermica, generazione di vasi sanguigni cutanei e infiltrazione dei leucociti nel derma (5, 6). Le scelte delle strategie terapeutiche per la psoriasi dipendono dallo stato della malattia. Le terapie topiche di glucocorticosteroidi e derivati ​​della vitamina D sono terapie convenzionali, ma sono efficaci solo per le malattie lievi e hanno effetti avversi come l'irritazione della pelle (7, 8). Per la psoriasi grave, agenti biologici, come gli inibitori del fattore di necrosi tumorale – α (TNF-α) e interleuchina-17 (IL-17), vengono somministrati sistematicamente ai pazienti per colpire molecole specifiche nella patogenesi della psoriasi e inibire l'infiammazione (9, 10). Tuttavia, causano un alto rischio di infezione e cancro a causa dell'immunosoppressione cronica a lungo termine (11). Inoltre, il consumo di tempo limita l'uso della fototerapia e della fotochemioterapia, sebbene siano efficaci per la psoriasi da moderata a grave (6). I limiti di questi trattamenti per la psoriasi hanno incoraggiato ulteriori indagini su opzioni terapeutiche alternative.

Sebbene la patogenesi della psoriasi sia complicata, è chiaramente riconosciuto che il DNA privo di cellule (cfDNA) svolge un ruolo critico nello sviluppo della psoriasi. Uno studio clinico ha mostrato un aumento significativo dei livelli sierici di cfDNA nei pazienti con psoriasi esacerbata (12). La tolleranza innata al cfDNA viene interrotta formando un immunocomplesso con LL37, un peptide antimicrobico che è altamente espresso nella pelle psoriasica. LL37 fornisce cfDNA alle cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) per innescare il recettore Toll-like 9 (TLR9) e produrre citochine infiammatorie, portando all'attivazione delle cellule T (13, 14). Inoltre, dati in aumento suggeriscono che i cheratinociti epidermici (KC) riconoscono e rispondono al complesso DNA-LL37 e partecipano attivamente all'inizio della risposta infiammatoria cutanea (15, 16). Questi studi suggeriscono che il cfDNA potrebbe essere un bersaglio per nuovi farmaci per la psoriasi.

I ricercatori hanno recentemente utilizzato polimeri cationici per eliminare gli acidi nucleici (NA) rilasciati da cellule morte e morenti per distruggere i complessi immunitari, fornendo un nuovo concetto per trattare l'infiammazione sterile. La prova del principio è stata confermata nei modelli animali di shock tossico acuto (17), lupus eritematoso sistemico (18), artrite reumatoide (19, 20), ecc. In questi studi, i polimeri cationici hanno mostrato un effetto straordinario bloccando l'infiammazione indotta dal cfDNA attraverso la somministrazione sistemica. Tuttavia, la somministrazione sistemica di materiali cationici presenta un grande rischio di tossicità. La psoriasi danneggia principalmente la pelle e il trattamento topico con materiali cationici sarebbe preferenziale e sicuro per la somministrazione (21).

Qui, abbiamo applicato in modo innovativo la somministrazione topica di polimeri cationici sulla pelle per trattare la psoriasi (Fig. 1A). Sulla base della patogenesi della psoriasi correlata all'immunocomplesso DNA-LL37, abbiamo studiato l'interazione tra polimeri cationici e DNA nonché polipeptidi. Abbiamo scoperto che i polimeri cationici con un'elevata affinità di legame al DNA estraggono efficacemente il cfDNA dal complesso DNA-LL37, che, a sua volta, ha inibito in modo efficiente l'attivazione delle cellule epidermiche primarie. La terapia topica con polimeri cationici su topi psoriasici indotti da imiquimod (IMQ) ha notevolmente ridotto squame ed eritema, infiltrazione di leucociti e citochine proinfiammatorie. Un'efficacia terapeutica più significativa è stata ottenuta con nanoparticelle cationiche (cNPs) invece di polycations solubili a causa della loro ritenzione più favorevole nella pelle psoriasica e della maggiore capacità di scavenging della NA. È interessante notare che i risultati terapeutici dei cNP sono stati confermati nelle scimmie psoriasiche di cynomolgus. Inoltre, i cNP hanno mostrato un elevato accumulo solo negli strati cutanei senza alcuna tossicità apparente negli animali e sia i topi IMQ che le scimmie cynomolgus hanno mantenuto le normali funzioni epatiche e renali durante il trattamento cNP. I risultati significativi di questo studio, in particolare i dati delle scimmie cynomolgus, suggeriscono che i cNP dimostrano un grande potenziale traslazionale per l'applicazione clinica alla psoriasi.

Fig. 1 I cNP mostrano un'elevata capacità di legame al DNA e un'efficace inibizione dell'infiammazione indotta dal DNA-LL37.

(UN) Meccanismo di terapia topica da parte di cNP per lo scavenging del cfDNA e l'inibizione infiammatoria per il trattamento della psoriasi. Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (B) Affinità di legame tra CpG marcato FAM e materiali cationici / LL37 misurata da MST. (C) Efficienza di legame competitiva dei polimeri cationici con CpG dal complesso CpG-LL37 e efficienza di legame LL37 con polimeri (n = 3; significa ± SEM). (D e E) Polimeri cationici down-regolati IL-6 (D) e TNF-α (E) indotti dal complesso CpG-LL37 nei pDC del topo (n = 3; significa ± SEM; ***P <0,001 tra due gruppi e ###P <0,001 rispetto al gruppo normale). (F) I polimeri cationici hanno inibito l'espressione del TNF-α nelle cellule epidermiche primarie (n = 3; significa ± SEM; ** 0,001 < P <0,01 tra due gruppi e ## 0,001 < P <0,01 rispetto al gruppo normale). In (D) a (F), la significatività statistica è stata calcolata mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test post hoc con differenza meno significativa (LSD).

RISULTATI

I cNP competono efficacemente per il DNA dal suo complesso LL37 e inibiscono l'infiammazione

cNPs con un diametro idrodinamico di ca. 70 nm sono stati preparati mediante autoassemblaggio del copolimero diblock di poli (lattico-co-acido glicolico) (PLGA) e poli (2- (dietilammino) etil metacrilato) (PDMA), PLGA-B-PDMA474 (fig. S1A) e un omopolimero PDMA480 con una lunghezza della catena simile al guscio PDMA di cNPs è stato utilizzato per il confronto (vedere la struttura chimica nella figura S1B). In precedenza, avevamo osservato che PLGA-B-PNMA I cNP hanno un potenziale zeta più positivo e una maggiore efficienza di legame al DNA rispetto al PDMA sia nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) che nel siero bovino fetale al 10% (FBS) (18). Pertanto, riteniamo che la nanostruttura core-shell dei cNP potrebbe essere utile per interferire con il complesso immunitario della psoriasi DNA-LL37. LL37 è un polipeptide cationico che interagisce con il DNA per formare il complesso immunitario. Pertanto, la termoforesi su microscala (MST), una tecnologia per quantificare gli eventi di legame con elevata sensibilità e ampio intervallo di rilevazione, è stata utilizzata per determinare l'affinità di legame del DNA con LL37, PDMA e cNP, rispettivamente (Fig. 1B). La citidina-fosfato-guanosina oligodeossinucleotide 1826 (CpG 1826), la sequenza di DNA del modello, è stata etichettata con il colorante fluorescente 6-carbossi-fluoresceina (FAM) ed è diventata un giornalista estremamente sensibile per tutte le interazioni di legame. Quando è stato miscelato con materiali cationici, l'evento di legame ha causato un cambiamento nel segnale MST che è stato rilevato e tradotto in costante di dissociazione quantitativa Kd valori. Il più piccolo Kd è, il legame più forte tra due elementi è. Le misurazioni MST hanno mostrato che i cNP avevano la costante di dissociazione più bassa di 0,13 nM, che era la più alta affinità di legame del DNA tra due materiali cationici e LL37. PDMA con a Kd il valore di 0,98 nM aveva la seconda più alta affinità per CpG. comunque, il Kd il valore tra CpG e LL37 era 1,94 μM, indicando che l'affinità di legame tra CpG e cNP era ~ 1 × 104– più forte rispetto a quello tra CpG e LL37.

Abbiamo ipotizzato che, con una capacità di legame così forte, i cNP avevano la capacità di competere per il DNA dal suo complesso LL37. Per verificare questa ipotesi, abbiamo condotto esperimenti di associazione competitiva per analizzare i contenuti di CpG e LL37 legati ai polimeri come mostrato in fig. S2. Abbiamo prima premiscelato CpG 1826 marcato FAM con LL37 senza etichetta per generare il complesso CpG-LL37. Quindi, abbiamo incubato il complesso con PDMA o cNP per 30 minuti. Il complesso polimero CpG è stato separato mediante centrifugazione di ultrafiltrazione e l'efficienza di legame, data come partizione CpG (%), è stata calcolata quantificando la concentrazione di CpG in base all'intensità della fluorescenza FAM. Inoltre, per determinare se i polimeri potrebbero estrarre CpG da CpG-LL37 per formare un polimero CpG (ipotesi 1 in fig. S2) o formare direttamente un complesso polimerico CpG-LL37 senza dissociazione di CpG-LL37 (ipotesi 2 in fig. S2), il contenuto di LL37 è stato valutato dopo che i polimeri sono stati aggiunti al complesso di CpG e LL37 marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) con la stessa procedura usata sopra. Un'alta intensità di fluorescenza di FAM-CpG potrebbe essere rilevata negli strati polimerici, dimostrando una forte interazione tra polimeri e CpG (linea continua in Fig. 1C). Tuttavia, abbiamo scoperto che LL37 aveva segnali fluorescenti quasi non rilevabili negli strati polimerici (linea tratteggiata in Fig. 1C), indicando che i polimeri cationici dissociavano il complesso CpG-LL37 per formare un complesso polimero CpG. Inoltre, rispetto al PDMA, i cNP avevano una maggiore capacità di estrarre CpG dal complesso anche a una concentrazione di soli 20 μg / ml quando l'efficienza di legame era del 60% per i cNP e del 40% per il PDMA. Inoltre, la capacità di legame del DNA è stata aumentata con la dose di cNP (Fig. 1C).

Successivamente, abbiamo esaminato se i polimeri cationici inibissero l'attivazione dell'infiammazione cellulare mediata dal complesso DNA-LL37. Sebbene il LL37 libero non fosse in grado di indurre l'attivazione di TLR9, il suo complesso di DNA ha attivato i pDC attraverso TLR9 per secernere citochine infiammatorie (13). cNPs e PDMA hanno inibito l'attivazione di pDC del topo indotta dal complesso CpG-LL37, che è stato dimostrato dalla down-regolazione dei livelli di IL-6 e TNF-α (Fig. 1, D ed E). Questi risultati hanno suggerito che cNP e PDMA potrebbero inibire l'attivazione di pDC indotta dal complesso DNA-LL37 nella psoriasi. Ulteriori esperimenti hanno mostrato gli stessi effetti dei polimeri cationici sulle cellule epidermiche primarie dei topi psoriasici (Fig. 1F). Inoltre, i polimeri cationici da soli non hanno attivato l'infiammazione, come manifestato dai livelli di citochine simili al controllo (Fig. 1, da D a F).

Il trattamento topico con cNP allevia i sintomi psoriasici dei topi IMQ

Per valutare l'effetto terapeutico in vivo, abbiamo successivamente valutato il trattamento topico del modello murino indotto dall'IMQ con polimeri cationici, che viene utilizzato come modello murino psoriasiforme acuto perché provoca una dermatite simile ad alcuni aspetti della psoriasi umana (22). Dopo aver somministrato topicamente la crema IMQ per 7 giorni, IMQ come agonista TLR7 / 8 ha indotto una serie di reazioni infiammatorie cutanee per provocare eritema, squame e ispessimento di cerotti cutanei, indicando l'insorgenza della psoriasi (Fig. 2A). Topi indotti da IMQ hanno mostrato punteggi significativamente più alti nell'area della psoriasi e nell'indice di gravità (PASI) rispetto al normale durante l'esperimento (Fig. 2B). Nei successivi 5 giorni, una soluzione di cNP o PDMA dispersa in una base di glicerina-gelatina è stata applicata quotidianamente sulla pelle psoriasica dei topi IMQ a dosi di polimero gradiente di 0,05, 0,25 e 1,25 mg / cm2. Con l'aiuto della base, l'idratazione dello strato corneo (SC) e l'adesione dei polimeri sulla superficie della pelle sono state entrambe aumentate, il che ha giovato all'efficacia terapeutica. Il gruppo modello applicato solo con la base di glicerina-gelatina è stato usato come controllo. Durante il periodo di trattamento dai giorni 9 a 13, sia i cNP che il PDMA hanno ridotto l'infiammazione dei topi IMQ in modo dose-dipendente (Fig. 2, B e C). Alla dose di 0,25 mg / cm2, i cNP avevano già dimostrato la loro efficacia terapeutica sulla pelle psoriasica del topo, come indicato dalla riduzione di squame ed eritema, nonché da significativi punteggi PASI inferiori rispetto al modello. Tuttavia, PDMA allo stesso dosaggio non ha comportato una differenza significativa dei punteggi PASI dal gruppo modello. A una dose elevata di 1,25 mg / cm2, i cNP hanno persino levigato e diluito la pelle psoriasica e hanno portato l'aspetto molto più vicino alla pelle normale con scale appena visibili, il che ha portato al punteggio PASI più basso di tutti i gruppi tranne il gruppo normale. Inoltre, i cNP hanno mostrato un eritema, uno spessore e punteggi cumulativi significativamente inferiori rispetto al PDMA ad alto dosaggio (Fig. 2B).

Fig.2 cNPs migliora le condizioni psoriasiche dei topi IMQ.

(UN) Programma sperimentale degli esperimenti del mouse IMQ. Pelle psoriasiforme acuta sviluppata dopo l'applicazione quotidiana della crema IMQ sulla pelle posteriore per 7 giorni. Quindi, i topi IMQ sono stati trattati topicamente con cNP o PDMA quotidianamente a dosaggi di 0,05, 0,25 e 1,25 mg / cm2 dai giorni 8 a 12. Ulteriori analisi sono state eseguite dopo aver sacrificato i topi al giorno 13. (B) Eritema, ridimensionamento e spessore della pelle posteriore sono stati assegnati giornalmente da 0 a 4. Inoltre, viene mostrato il punteggio cumulativo come somma dei punteggi di eritema, scala e spessore (n = 10; significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01 e ***P <0,001 tra due gruppi dai giorni 9 a 13, # 0,01 < P <0,05, ## 0,001 < P <0,01 e ###P <0,001 rispetto al gruppo modello dai giorni 9 a 13 e P <0,001 tra il gruppo normale e altri gruppi dai giorni 1 a 13). (C) Morfologia rappresentativa della superficie cutanea dei vari gruppi al giorno 11 (dopo 3 giorni di trattamento) e colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) (× 400) delle sezioni della pelle di tutti i gruppi al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento). Una rete epidermica allungata (asterisco) e un infiltrato infiammatorio contenente linfociti (freccia) all'interno del derma erano chiaramente evidenti nel gruppo modello. Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (D) Analisi dello spessore di SC, strato epidermico e DC della pelle del topo posteriore in sezioni colorate con H & E dal software ImageJ (n = 5; significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01, ***P <0,001 tra due gruppi e # 0,01 < P <0,05, ## 0,001 < P <0,01 e ###P <0,001 rispetto al gruppo di modelli). In (B) e (D), la significatività statistica è stata calcolata dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

La psoriasi mostra la definizione di cambiamenti istopatologici. Nei topi modello IMQ, c'era un'aumentata proliferazione di KC nell'epidermide vitale (VE) con caratteristiche psoriasiche tra cui l'acantosi epidermica (vedi ispessimento dello strato di VE in Fig. 2C), ipercheratosi e parakeratosi nello SC (vedi lo strato di SC in Fig. 2C). Inoltre, le creste della rete epidermica si sono notevolmente allungate e hanno persino formato ondulazioni lunghe e sottili che si estendevano nel derma (contrassegnato come * nello strato dello strato cutaneo (DE) in Fig. 2C). Nelle lesioni psoriasiche, si è verificata un'enorme infiltrazione di leucociti nel derma, tra cui cellule T e DC mescolate (indicato da frecce nello strato DE in Fig. 2C). Dopo il trattamento topico con polimeri cationici, tutti questi sintomi patologici dei topi IMQ sono stati alleviati. Dopo i trattamenti PDMA e cNP a dosi di 0,25 o 1,25 mg / cm2, la proliferazione di KC è stata inibita in modo efficiente e l'epidermide è diventata più sottile di quella dei topi modello con una diminuzione della rete epidermica allungata (Fig. 2, C e D). Tuttavia, in 0,25 e 1,25 mg / cm2 gruppi cNP, lo spessore dello strato di SC è stato persino notevolmente ridotto rispetto al gruppo modello, che è stato mostrato da una riduzione delle squame nell'aspetto clinico, mentre tutti i gruppi trattati con PDMA non hanno mostrato una SC più sottile significativamente rispetto al modello (Fig. 2 , C e D). Inoltre, dopo il trattamento con cNP, gli aggregati di leucociti mononucleari nello strato del derma sono stati ridotti in modo significativo, indicando che i cNP hanno efficacemente soppresso l'infiammazione della pelle psoriasica (Fig. 2C). Sia l'analisi della morfologia che l'istologia hanno dimostrato che i cNP hanno alleviato i sintomi psoriasici dei topi IMQ meglio del PDMA.

i cNP inibiscono in modo più efficiente l'accumulo di cellule immunitarie e l'espressione di più citochine nelle lesioni psoriasiche

Nel modello IMQ, l'IMQ induce non solo cambiamenti fenotipici coerenti con la psoriasi, ma anche cambiamenti in più tipi di cellule, citochine e vie infiammatorie coinvolte nella perdita dell'omeostasi nella pelle (23). L'aumento del numero di cellule immunitarie, in particolare cellule dendritiche, cellule T e macrofagi, nelle lesioni psoriasiche gioca un ruolo importante nella transizione dall'immunità innata a quella adattativa nella psoriasi producendo citochine proinfiammatorie e chemochine2). La colorazione immunochimica delle cellule immunitarie ha mostrato la quantità di monociti e macrofagi (CD68+), Cellule T (CD3+) e cellule dendritiche reclutate nel sito psoriasico nel modello IMQ (Fig. 3A). Tuttavia, il trattamento con cNP e PDMA ha ridotto efficacemente l'infiltrazione di queste cellule immunitarie. La quantificazione delle cellule immunocolorate indicava che il numero di monociti e macrofagi, cellule T e cellule dendritiche era ovviamente inferiore in entrambi i gruppi polimerici cationici, mentre i cNP mostravano una maggiore efficienza di inibizione con il numero di cellule immunitarie molto più vicine alla norma (fig. S3).

Fig. 3 i cNP riducono più efficacemente le cellule infiammatorie e l'espressione di citochine proinfiammatorie nei topi IMQ.

(UN) Rilevazione immunoistochimica di monociti e macrofagi (CD68+), Cellula T (CD3+) e infiltrati di cellule dendritiche nella pelle psoriasica di vari gruppi (× 400). L'inserto indica l'immagine ingrandita di colorazione positiva (× 800). (B) Le citochine proinfiammatorie coinvolte nella patogenesi della psoriasi, tra cui IL-6, TNF-α, IL-17, IL-22 e IL-23, sono state analizzate mediante immunochimica (× 400). (C) livelli di mRNA di citochine IL-6, TNF-α, IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23 nella pelle al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento) (n = 5; significa ± SEM; ** 0,001 < P <0.01 e ***P <0,001 rispetto al gruppo di modelli). Il significato statistico è stato calcolato dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Abbiamo inoltre determinato se i cationici proinfiammatori down-regolati dei polimeri cationici secreti nelle lesioni psoriasiche. Il percorso delle citochine della psoriasi indotta dall'IMQ dipende in particolare dall'asse IL-17/23, che condivide somiglianze con la psoriasi umana (22). Oltre a IL-23 e IL-17 e IL-22, che sono relativi alle cellule dell'helper T effettore 17, le citochine proinfiammatorie come TNF-α e IL-6 sono funzionalmente coinvolte nella patogenesi della psoriasi. Quindi, le citochine proinfiammatorie, tra cui TNF-α, IL-6, IL-17, IL-22 e IL-23, sono state misurate nelle lesioni psoriasiche dei topi IMQ. I risultati della colorazione immunoistochimica hanno mostrato che i livelli di queste citochine erano ovviamente sovraregolati dalla dermatite indotta da IMQ. Dopo il trattamento con cNP e PDMA, i livelli di citochine della pelle psoriasica sono stati tutti ridotti rispetto al gruppo modello. La quantificazione ha mostrato che i cNP hanno ridotto significativamente l'espressione di IL-6 e IL-17 rispetto al gruppo PDMA (Fig. 3B e Fig. S3). I risultati sono stati confermati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale che indica che i livelli di mRNA di queste citochine infiammatorie chiave, tra cui TNF-α, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23 , nelle lesioni psoriasiche erano state tutte down-regolate dopo 5 giorni di trattamento con cNP e PDMA ed erano persino vicine ai livelli normali (Fig. 3C). L'analisi sia dell'infiltrazione dei leucociti che dei livelli di citochine proinfiammatorie ha verificato che i cNP hanno dimostrato un'inibizione infiammatoria più efficiente in vivo.

cNPs con maggiore accumulo nella pelle psoriasica riducono meglio il cfDNA

Per comprendere gli effetti terapeutici dei polimeri cationici, abbiamo esaminato la penetrazione cutanea e la biodistribuzione di cNP e PDMA. Abbiamo applicato topicamente polimeri cationici marcati con FITC con la base di glicerina-gelatina sulla pelle rasata del modello e dei topi normali, e quindi i campioni di pelle e organi interni sono stati raccolti in vari punti temporali. Quindi, l'accumulo di cNP e PDMA in diversi strati cutanei è stato analizzato mediante microscopia confocale. Inoltre, per valutare la biodistribuzione dei polimeri cationici in vivo, l'intensità di fluorescenza dei polimeri negli omogenati di organi è stata utilizzata per quantificare il contenuto di polimeri in ciascun organo. I risultati hanno mostrato che i cNP e il PDMA sono penetrati nella pelle sia del modello che dei topi normali dopo somministrazione topica (Fig. 4A e Fig. S4). Tuttavia, l'accumulo di PDMA e cNP nella pelle psoriasica potrebbe raggiungere il picco a 6 ore, mentre raggiungevano il massimo nella pelle normale almeno a 24 ore (fig. S4, B e C). L'assorbimento e il traffico dei materiali nella pelle psoriasica sono stati più rapidi che nella pelle normale perché la permeabilità è stata aumentata dalla barriera SC irregolare. Inoltre, i cNP sono stati mantenuti più nei diversi strati di pelle psoriasica rispetto al PDMA durante i tempi di osservazione. A 2 ore, i cNP si erano già accumulati nell'epidermide dove il PDMA mostrava un segnale più basso e, a 6 ore, più cNP erano dispersi nel derma rispetto al PDMA. Quindi, i cNP hanno mostrato un accumulo più favorevole sia nell'epidermide che nel derma, come manifestato dalla significativa maggiore intensità di fluorescenza FITC in diversi punti temporali (fig. S4, B e C). Inoltre, un livello più elevato e una più lunga ritenzione di cNP nella pelle psoriasica potrebbero spiegare la loro migliore efficacia del trattamento.

Fig. 4 i cNP rimangono più efficacemente negli strati cutanei con minore assorbimento da parte degli organi interni.

(UN) Immagini confocali di penetrazione cutanea da parte di PDMA e cNP nella cute psoriasica del mouse IMQ a 2, 6 e 24 ore dopo la somministrazione (× 200). Sia PDMA che cNP sono stati etichettati con FITC (verde). I nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI (blu). HF, follicoli piliferi. (B) Contenuto di polimeri cationici marcati con FITC conservati nella pelle e nei principali organi, inclusi fegato, reni, cuore, milza e polmoni, calcolati mediante quantificazione della fluorescenza (n = 5, significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01, ***P <0,001 tra due gruppi e # 0,01 < P <0.05, ###P <0,001 rispetto al polimero nella pelle dello stesso gruppo). (C) Livelli di ALP, ALT, AST, Cr, UA e urea nel siero di topo dopo 5 giorni di trattamento. Sieri di topo normali, modello, PDMA (1,25 mg / cm2) e cNP (1,25 mg / cm2) i gruppi sono stati raccolti al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento) (n = 5; significa ± SEM; ###P <0,001 rispetto al gruppo normale). In (B) e (C), la significatività statistica è stata calcolata dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Successivamente, la distribuzione dei polimeri cationici in vari organi è stata quantificata dall'intensità della fluorescenza. È stato interessante osservare una distribuzione inversa dei due materiali in base ai risultati, sebbene il loro accumulo negli organi interni fosse piuttosto inferiore rispetto a quello nella pelle (Fig. 4B). Nella pelle, i livelli di cNP erano sempre più alti dei livelli di PDMA. Tuttavia, a 2 ore, il PDMA si era già distribuito negli organi specialmente nel fegato e i livelli di cNP nei principali organi interni, tra cui fegato, reni, cuore, milza e polmoni, erano tutti molto più bassi dei livelli di PDMA durante l'osservazione. La differenza di biodistribuzione tra PDMA e cNP ha anche portato a diverse tossicità. La colorazione istologica dei principali organi ha mostrato che il PDMA ha causato diversi gradi di lesioni nel fegato e nei reni, mentre il trattamento con cNP non ha causato danni evidenti ai vari organi principali (fig. S5). Inoltre, l'epatotossicità dei cNP riflessi dai livelli di fosfatasi alcalina (ALP), alanina transaminasi (ALT) e aspartato transaminasi (AST) e la loro nefrotossicità riflessa dalla creatinina (Cr), dall'acido urico (UA) e dall'urea dopo il trattamento erano tutti vicino a quelli del gruppo normale anche alla dose più alta di 1,25 mg / cm2. Al contrario, il gruppo PDMA ha mostrato un aumento di sei volte del livello di ALT e un duplice aumento del livello di AST, implicando una grave lesione epatica. Inoltre, aumenti significativi di UA e urea nel gruppo PDMA hanno indicato l'interruzione delle funzioni renali (Fig. 4C). Pertanto, il basso accumulo negli organi interni dei cNP ha comportato una bassa tossicità in contrasto con il PDMA.

Abbiamo ipotizzato che la biodistribuzione di PDMA e cNPs possa influenzare i livelli di cfDNA in vivo. Pertanto, abbiamo misurato i livelli di cfDNA nelle lesioni psoriasiche e nella circolazione. Per rilevare il cfDNA nelle lesioni psoriasiche dei topi, sezioni congelate di 6 micron di pelle di topo sono state colorate con SYTOX Orange, una colorazione NA ad alta affinità, che colora intensamente i DNA extracellulari. Questi DNA extracellulari possono essere distinti dai cromosomi nucleari per la loro struttura di fili intrecciati e l'aspetto del filo spinato (24, 25). Nelle lesioni psoriasiche di topi IMQ, è stato rilevato tale DNA extracellulare con una struttura di filo intrecciato (indicato dalle frecce nelle Figure 5, A e B e 6A). Per la verifica, un'altra sezione dello stesso tessuto incorporato è stata utilizzata come controllo trattato con desossiribonucleasi I (DNasi І) per degradare il DNA extracellulare prima della colorazione SYTOX. Dopo il trattamento con DNase І, la struttura del filo intrecciato non era più rilevabile, indicando che l'essenza di questi fili colorati con SYTOX Orange era il cfDNA (Fig. 5A). Ulteriori risultati della colorazione hanno mostrato una grande quantità di cfDNA che circonda il derma dei topi modello IMQ al giorno 11. Tre giorni di trattamento con PDMA hanno avuto qualche effetto sulla riduzione del livello di cfDNA nelle lesioni psoriasiche. Tuttavia, il gruppo cNP ha mostrato un livello significativamente inferiore di cfDNA locale rispetto ai gruppi modello e PDMA (Fig. 5B e Fig. S6B). Al giorno 13, quando i topi IMQ erano stati trattati per 5 giorni, il livello locale di cfDNA nel gruppo cNP era la metà di quello nel gruppo PDMA e notevolmente inferiore a quello nel gruppo modello (fig. S6, A e C). Inoltre, sia i trattamenti cNP che PDMA hanno down-regolato il cfDNA sistemico allo stesso livello di quello nei topi normali, mentre il livello di CFDNA in circolazione nei topi modello era ancora elevato al giorno 13 (Fig. 5C). A differenza delle lesioni psoriasiche, i cNP e il PDMA non hanno fatto alcuna differenza nel lavaggio del cfDNA sistemico dopo 5 giorni (Fig. 5C). Questo risultato è stato coerente con la distribuzione di PDMA e cNP in vivo, in cui il PDMA si è disperso relativamente di più nella circolazione per interagire con il cfDNA sistemico, mentre i cNP con maggiore accumulo nella pelle psoriasica hanno ridotto ulteriormente il cfDNA locale. Pertanto, i cNP alleviarono meglio la risposta infiammatoria locale e non mostrarono tossicità visibile nei modelli animali.

Fig. 5 Il trattamento cNP regola meglio i livelli di cfDNA in vivo nei topi IMQ.

(UN) Immagini confocali di cfDNA nelle lesioni psoriasiche colorate con SYTOX Orange (× 1890). Le immagini ingrandite (× 3150) hanno mostrato la struttura del filo intrecciato di cfDNA (freccia). Dopo il trattamento con DNase І, la struttura simile al filo spinato di cfDNA era scomparsa, confermando che questi filamenti erano DNA extracellulare. (B) Al giorno 11, il livello locale di cfDNA era ridotto dopo 3 giorni di trattamento con polimeri cationici rispetto ai topi modello. Le immagini ingrandite mostravano una struttura più distinta di cfDNA come indicato dalle frecce. (C) Concentrazione di cfDNA nel siero dopo 5 giorni di trattamento con PDMA e cNP al giorno 13 (n = 7; significa ± SEM; ***P < 0,001 tra i due gruppi e ###P < 0,001 rispetto al gruppo normale). Il significato statistico è stato calcolato dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Fig.6 i cNP alleviano i sintomi delle scimmie cinomolgus psoriasiche.

(UN) Schema del trattamento topico cNP di scimmie cynomolgus indotte da IMQ. Una soluzione di cNP dispersa in una base di glicerina-gelatina è stata lentamente applicata sulla pelle posteriore psoriasica delle scimmie cynomolgus fino ad assorbimento. (B) Presentazione fenotipica della pelle posteriore psoriasica della scimmia cynomolgus (n. 2) in varie occasioni. L'area del modello era nella parte superiore della schiena e l'area trattata con cNP era nella parte bassa della schiena. La pelle trattata con cNP è diventata liscia dopo la rigenerazione (freccia). Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (C) Eritema, desquamazione e spessore della pelle posteriore sono stati assegnati giornalmente da 0 a 4. Inoltre, viene mostrato il punteggio cumulativo (eritema più desquamazione più spessore) (n = 3; significa ± SEM; ***P < 0,001 tra due gruppi dai giorni 9 a 13 e ###P < 0,001 tra due gruppi dai giorni 1 a 13). (D) Colorazione H&E della pelle psoriasica trattata con cNP e modello di scimmie cynomolgus (× 400). L'inserto indica l'immagine ingrandita (× 2000). L'asterisco bianco indica i KC parakeratotici. (E) Colorazione immunoistochimica della pelle psoriasica trattata con cNP di una scimmia cynomolgus (n. 1). La pelle del modello e trattata con cNP sono state colorate con anticorpi anti-TNF-α, anti-IL-6, anti-IL-17 e anti-IL-23 (× 200).

La terapia topica con cNP allevia i sintomi delle scimmie cynomolgus psoriasiche

Gli esperimenti di cui sopra nei modelli murini indotti dall'IMQ hanno dimostrato che i cNP inibivano efficacemente l'infiammazione della psoriasi indotta dal DNA e alleviato i sintomi psoriasici. I cNP hanno mostrato sia un'efficacia terapeutica superiore sia una migliore biocompatibilità rispetto al PDMA nei topi IMQ, indicando una maggiore possibilità di applicazione clinica. Pertanto, per valutare ulteriormente il potenziale di traduzione dei cNP nella clinica, sia l'efficacia che la tossicità dei cNP in un animale primate sono state valutate in tre scimmie cynomolgus (Fig. 6A). Usando la stessa procedura eseguita negli esperimenti con il topo, abbiamo prima applicato quotidianamente la crema IMQ sulle scimmie cynomolgus per indurre infiammazione della pelle simile alla psoriasi. Nel trattamento clinico dei pazienti, l'IMQ topico come trattamento per il carcinoma a cellule basali provoca eritema, erosione e croste o croste nei siti di applicazione con una sensazione di bruciore, prurito e dolore, che ricorda sintomi psoriasici (26, 27). Queste reazioni cutanee locali aumentano con la frequenza di dosaggio (cioè 2 volte al giorno e 7 volte alla settimana) (28). Per indurre lesioni psoriasiche nelle scimmie cynomolgus, abbiamo aumentato il dosaggio della crema IMQ a 250 mg per applicazione e aumentato la frequenza di dosaggio a due volte al giorno. Dopo 7 giorni, si è verificato un evidente eritema sulla pelle posteriore di tutte le scimmie e i siti dell'applicazione IMQ sono diventati ruvidi e ispessiti e ricoperti di squame lamellari argentee (Fig. 6B per scimmia n. 2 e fig. S7A per scimmie n. 1 e # 3). Questi sintomi simili alla psoriasi sono diventati sempre più gravi con la scottatura e la crosta nei giorni seguenti (Fig. 6C). Le caratteristiche istologiche implicano anche che la dermatite indotta dall'IMQ nelle scimmie cinomolgee somigliava molto alle lesioni della psoriasi umana, tra cui iperproliferazione di KC nello strato VE, ipercheratosi e KC parakeratotici con ritenzione di nuclei nella SC (Fig. 6D).

Abbiamo scelto un'area della parte bassa della schiena di 2 cm per 2 cm di tre scimmie cynomolgus come area trattata con cNP e un'area della parte superiore della stessa scimmia trattata con 2 cm per 2 cm trattata con solo base di glicerina-gelatina come auto- controllo. Pertanto, c'erano tre campioni in ciascun gruppo sperimentale. Per trattare le scimmie cynomolgus indotte da IMQ, abbiamo applicato topicamente cNPs (2,5 mg / cm2) con base sulla pelle due volte al giorno. L'aspetto fenotipico della pelle è stato migliorato dopo il trattamento con cNP e la progressione della psoriasi è stata inibita da cNP con riduzione di eritema, squame e scabbiatura (Fig. 6B e Fig. S7A). Dai giorni 9 a 13, i punteggi PASI di eritema, squame e spessore nel gruppo cNP sono diminuiti in modo significativo, sebbene fossero ancora significativamente più alti del normale (Fig. 6C). Inoltre, dopo 5 giorni di trattamento con cNP, le lesioni psoriasiche sono state desquamate, rigenerate e recuperate (indicato dalla freccia in Fig. 6B). Al contrario, sulla parte superiore della pelle senza trattamento cNP, i sintomi dell'infiammazione sono diventati sempre più gravi nel tempo (Fig. 6B e Fig. S7A).

Le caratteristiche istologiche implicavano che l'epidermide nell'area trattata con cNP fosse molto più sottile di quella nell'area del modello, dimostrando che i cNP inibivano la proliferazione epidermica anormale. Inoltre, lo spessore di SC nell'area trattata con cNP era ovviamente diminuito con la scomparsa di KCs completamente differenziate, il che implica che la parakeratosi e l'ipercheratosi erano state efficacemente alleviate dopo il trattamento (Fig. 6D e Fig. S7B). Inoltre, l'immunoistochimica ha dimostrato che i cNP erano efficaci per ridurre l'infiammazione della pelle di scimmia cinomolgus. I livelli di espressione di citochine proinfiammatorie, tra cui TNF-α, IL-6, IL-17 e IL-23, nelle lesioni simili alla psoriasi sono stati down-regolati dopo 5 giorni di trattamento cNP rispetto al modello (Fig. 6E per scimmia # 3 e fig. S8A per le scimmie n. 1 e n. 2), come evidenziato dai livelli dimezzati di IL-6 e IL-23 e una riduzione di oltre il 70% nell'espressione di TNF-α e IL-17; tra questi, il gruppo cNP ha mostrato un'efficace inibizione infiammatoria (fig. S8B).

Considerando la sicurezza preclinica della terapia topica, abbiamo anche valutato la tossicità dei cNP nelle scimmie cynomolgus. In breve, la pelle posteriore normale di 2 cm per 2 cm di tre scimmie maschi di cynomolgus è stata applicata con cNP a 2,5 mg / cm2 con una frequenza di due volte al giorno per 7 giorni. I campioni di sangue sono stati raccolti per analisi biochimiche nei giorni 1 e 8 e il loro peso corporeo è stato registrato contemporaneamente (vedere il programma in fig. S9A). Ogni animale veniva anche usato come controllo proprio. Non sono stati rilevati segni clinici avversi in tutti gli animali. Per quanto riguarda il peso corporeo, le fluttuazioni registrate senza una marcata perdita di peso rientravano nell'intervallo normale di questo parametro per le scimmie di 4 anni (fig. S9B). Inoltre, dopo il trattamento con cNP non sono state osservate variazioni patologiche dei marcatori biochimici. I livelli di ALP, ALT e AST erano simili prima e dopo il trattamento con cNP, indicando l'assenza di gravi danni al fegato. Inoltre, le normali concentrazioni di Cr, UA e urea nel sangue implicavano che anche le funzioni renali non erano compromesse (fig. S9C). Insieme, questi risultati rafforzano il potenziale del cNP come candidato farmaco innovativo per il trattamento topico delle malattie infiammatorie nella clinica.

DISCUSSIONE

Gli auto-NA rilasciati da cellule morte o morenti sono riconosciuti come pattern molecolari associati a danno (DAMP) o pattern molecolari associati a pattern e innescano l'attivazione di TLR endosomiali con l'assistenza di peptidi antimicrobici, portando a disturbi autoimmuni (29, 30). Pertanto, il cfDNA come bersaglio terapeutico è stato considerato in grado di interrompere il ciclo dell'infiammazione aberrante. Nel 2009, Lee et al. (17) ha inizialmente suggerito che alcune policitazioni che agiscono come scavenger molecolari interagiscono con le NA per inibire l'attivazione dei TLR sensibili alla NA. Il seguente studio ha inoltre dimostrato che l'uso di questi polimeri che si legano alla NA per limitare l'infiammazione indotta dalla NA è efficace in alcune malattie infiammatorie e autoimmuni (1720). Considerando la tossicità dei materiali cationici somministrati per via sistemica, un locale (31) o metodo ex vivo (32) utilizzando le policitazioni immobilizzate per rimuovere le molecole DAMP può essere una scelta migliore per una facile traduzione clinica.

Incoraggiato dall'elevata capacità di legame NA e dall'efficace inibizione infiammatoria dei cNP in uno studio precedente (19), abbiamo utilizzato cNP per interferire con il complesso cfDNA-LL37 per il trattamento della psoriasi. In particolare, l'eccellente capacità di legame NA dei cNP mediante interazioni di carica ha provocato una potente distruzione dell'inflammasoma NA formando un complesso polimero-NA più compatto. Abbiamo dimostrato che i cNP con ~ 1 × 104– l'affinità di legame al DNA più forte rispetto a LL37 compete in modo efficiente per il DNA dal complesso DNA-LL37 (Fig. 1B e C). Utilizzando un noto agonista TLR CpG nel complesso con LL37 per innescare TLR9, abbiamo dimostrato che i cNP sono più efficaci per bloccare l'attivazione TLR9 dei pDC primari del topo e delle cellule epidermiche (Fig. 1, da D a F), implicando la potenza dei cNP per ridurre Attività di stimolazione immunitaria mediata dal DNA nella psoriasi.

In generale, la consegna topica presenta vantaggi significativi grazie al primo passaggio minimo del metabolismo, all'eliminazione dell'ambiente sanguigno avverso diretto e alla capacità di fornire un rilascio prolungato e controllato del farmaco (33). Inoltre, la terapia topica non è invasiva e può essere auto-amministrata, mostrando un'elevata compliance del paziente (34). Pertanto, la terapia topica con materiali cationici può essere una strategia innovativa e sicura per il trattamento della psoriasi. Negli esperimenti su topi indotti dall'IMQ, abbiamo confermato che i cNP somministrati per via topica erano efficaci in vivo, supportati da morfologie della superficie cutanea, punteggi PASI, istologia e analisi immunoistochimica (Figg. 2 e 3). Successivamente, abbiamo estrapolato il concetto a un modello IMQ più clinicamente rilevante nelle scimmie cynomolgus. Il trattamento topico cNP ha recuperato lesioni psoriasiche, rinnovato la pelle di scimmia cinomolgus (Fig. 6) ed è stato ben tollerato senza evidente tossicità (fig. S9). Pertanto, forniamo chiare evidenze cliniche di cNP come potenziale trattamento per le malattie autoimmuni.

Esperimenti in vivo hanno mostrato che i cNP topici hanno costantemente sovraperformato la controparte solubile PDMA, che può essere attribuita alla loro ritenzione cutanea più favorevole. I parametri dei materiali cationici, come la carica superficiale, le dimensioni e la lipofilia, determinano la loro deposizione / permeazione cutanea (3539). In generale, molecole più piccole permeano attraverso gli strati della pelle in modo più efficiente rispetto alle molecole più grandi (38), che potrebbe spiegare la differenza di diffusione cutanea di cNP ~ 70 nm e PDMA solubile. Inoltre, cariche più positive di cNP portano a una più forte interazione con le cellule epidermiche e cutanee e, quindi, i cNP risiedono più a lungo. Inoltre, la lipofilia dei cNP può provocare un ritardo della permeazione nell'ambiente idrofilo esistente dopo la giunzione dermoepidermica (39). Pertanto, i cNP hanno mostrato una maggiore localizzazione negli strati cutanei, mentre il PDMA è penetrato più facilmente nel sangue e si è accumulato di più nel fegato e nei reni (Fig. 4 e Fig. S4). Queste differenze di biodistribuzione corrispondevano alle prestazioni terapeutiche. cNPs con maggiore ritenzione nella pelle hanno mostrato una migliore efficacia nel legame al cfDNA locale (Fig. 5 e Fig. S6) e quindi una migliore inibizione della risposta infiammatoria locale. Inoltre, la ritenzione di cNP nel sito cutaneo riduceva notevolmente la tossicità sistemica, a differenza del PDMA, che penetrava nella circolazione sanguigna e causava lesioni al fegato e ai reni (Fig. 4 e Fig. S5). Pertanto, i materiali cationici in particelle somministrati per via topica potrebbero mantenere la loro funzione inibitoria per la psoriasi auto-indotta dal DNA, evitando al contempo la tossicità sistemica mediante ritenzione nella pelle.

Motivati ​​dalla scoperta che l'auto-DNA accoppiato con LL37 attiva una risposta immunitaria anormale nella psoriasi, abbiamo dimostrato che i cNP si legavano ai NA proinfiammatori e interrompevano gli immunocomplessi DNA-LL37 per trattare la psoriasi sperimentale. La somministrazione topica di cNP ha raggiunto con successo l'unificazione di efficacia e sicurezza sia nei topi IMQ che nelle scimmie cynomolgus. A causa delle somiglianze genetiche e fisiologiche dei primati non umani con l'uomo, i risultati ottenuti dalle scimmie cynomolgus suggeriscono una strategia precedentemente non identificata per l'applicazione clinica di polimeri cationici. Come studio innovativo, questo studio aumenta notevolmente il potenziale traslazionale dei cNP come opzione di trattamento promettente per le malattie infiammatorie iniziate da un'attivazione inappropriata dei percorsi TLR.

MATERIALI E METODI

Progettazione dello studio

L'obiettivo dello studio era di trarre vantaggio dal lavaggio del cfDNA da parte di cNP topici per inibire la risposta infiammatoria psoriasica nei modelli di scimmie murine e cinomolgus e confrontare l'efficacia terapeutica e la tossicità in vivo con la controparte solubile PDMA. Gli effetti di entrambi i polimeri cationici sull'inibizione dell'infiammazione nella psoriasi sono stati valutati da una serie di esperimenti tra cui pDC primario del topo e stimolazione delle cellule epidermiche in vitro e fotografie fenotipiche, punteggio PASI, istologia ed espressione di citochine nel sito psoriasico nello studio sugli animali. La differenza comportamentale in vivo tra cNP e PDMA è stata ulteriormente esplorata dalle analisi meccanicistiche della penetrazione cutanea e della biodistribuzione, nonché dalla misurazione dell'espressione delle citochine nel sito psoriasico e dai livelli di cfDNA nella circolazione e nelle lesioni cutanee.

Durante lo studio, né animali né campioni sono stati esclusi dallo studio. Per esperimenti in vitro, la stimolazione delle cellule primarie è stata eseguita in triplicato. Per lo studio in vivo, la dimensione del campione di animali è stata stimata dopo aver consultato il servizio di biostatistica dell'Università di Sun Yat-sen seguendo gli standard degli usi degli animali. Lo studio del topo ha incluso 10 topi per gruppo di trattamento e lo studio della scimmia cynomolgus ha incluso tre scimmie. Tutti gli animali sono stati assegnati in modo casuale ai singoli gruppi di trattamento e gli investigatori sono stati accecati dall'assegnazione del gruppo durante l'analisi di tutti i campioni. Lo studio del mouse è stato ripetuto tre volte per verificare la riproducibilità. L'end point sperimentale per il modello di psoriasi del mouse IMQ è stato determinato essere almeno 13 giorni dopo la prima induzione dell'IMQ, quando i sintomi della psoriasi del modello iniziano a riprendersi.

Bioreagents

PBS (pH 7,4), terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), terreno Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), 0,25% di tripsina-EDTA e FBS sono stati acquistati da Gibco. Il DNA del timo di vitello è stato acquistato da Sigma-Aldrich e la sua soluzione madre, 1 mg / ml, è stata preparata in acqua distillata. CpG 1826 senza etichetta e CpG 1826 con etichetta FAM sono stati acquistati da GenScript China e le loro soluzioni stock in acqua distillata sono state preparate come 1 mg / ml. LL37 senza etichetta e LL37 con etichetta FITC sono stati acquistati rispettivamente da Invivogen e GenScript China e le loro soluzioni stock in acqua distillata sono state preparate come 5 mg / ml. Anticorpo anti-TNF-α (numero di catalogo ab6671), anticorpo anti-IL-6 (numero di catalogo ab9324), anticorpo anti-IL-17 (n. Di catalogo ab79056), anticorpo anti-IL-23 (n. Di catalogo 45420 ), anticorpo anti-IL-22 (n. catalogo ab18499), anticorpo anti CD68 (n. catalogo ab955), anticorpo anti CD3 (n. catalogo ab16669), immunoglobulina G-IgG anti-topo di capra (IgG) H&L (perossidasi di rafano (HRP )) (numero di catalogo ab6789) e IgG anti-coniglio H&L (HRP) di capra (numero di catalogo ab6702) sono stati acquistati da Abcam. L'anticorpo per cellule dendritiche (NB100-64608) è stato acquistato da Novus Biologicals LLC e l'HRP IgG anti-ratto di capra (HAF005) è stato acquistato da R&D Systems.

Miltenyi Biotec ha acquistato il kit di partenza MiniMACS (MS), il tampone da corsa autoMACS, le microsfere anti-mPDCA-1 e un kit di dissociazione dell'epidermide di topo. DNasi І (Roche), tirosina chinasi 3 legata al fms murino (FLT3-L) (PeproTech), kit ELISA TNF-α di topo (BioLegend), kit ELISA IL-6 di topo (BioLegend), crema Aldara (5% IMQ; 3M Pharmaceuticals), Zoletil 50 (50 mg / ml; Virbac), isoflurano (RWD Life Science, Cina), ematossilina (Jiangyuan, Cina), Eosin Y (Aladdin), 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; Invitrogen), composto di temperatura di taglio ottimale Tissue-Tek (composto OCT, Sakura), diaminobenzidina (DAB) più kit (Maxin Biotechnologies), kit di dosaggio Quantico iT PicoGreen dsDNA (PicoGreen, Invitrogen), colorazione SYTOX Orange NA (Invitrogen), Dynabeads SILANE Viral NA Kit (Invitrogen), TRIzol reagent (Invitrogen), RNeasy Universal Tissue Kit (Qiagen), PrimeScript RT reagent Kit con gDNA Eraser e oligo (dT) (Takara) e SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara Bio, Cina ) sono stati acquistati da società.

cellule

I pDC del topo sono stati generati dalle cellule del midollo osseo del topo (cellule BM) come descritto in letteratura (40). Le cellule BM sono state isolate e coltivate in RPMI 1640 con FLT3-L murino (100 ng / ml) e FBS inattivato al calore al 10% a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO2. Dopo 4 giorni, è stato reintegrato il 50% del terreno di coltura. Al giorno 8, i pDC sono stati isolati con MicroBeads anti-mPDCA-1 utilizzando il kit di partenza MiniMACS. Le cellule epidermiche primarie di topo sono state arricchite dal tessuto epidermico di topo utilizzando il kit di dissociazione dell'epidermide di topo. In breve, le cellule epidermiche sono state raccolte come segue. Innanzitutto, il tessuto dell'epidermide di topo del topo IMQ è stato separato dal derma mediante idrolisi enzimatica durante la notte a 4 ° C utilizzando il kit di dissociazione dell'epidermide di topo. Il giorno successivo, l'epidermide è stata staccata dal derma usando una pinzetta curva e trasferita nella provetta C di GentMACS contenente la miscela di enzimi. La dissociazione dell'epidermide è stata effettuata utilizzando il dissociatore gentleMACS. Quindi, i detriti sono stati rimossi mediante filtrazione attraverso un panno per schermi a 200 maglie e le cellule epidermiche sono state arricchite dopo centrifuga con 800g e coltivato con DMEM completato in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO al 5%2.

Animali

Topi BALB / c femmine (8 settimane) sono stati acquistati presso il centro per animali da laboratorio dell'Università Sun Yat-sen. Tutti i topi sono stati allevati, alloggiati e utilizzati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni nella struttura animale della School of Life Science, Sun Yat-sen University. Gli studi sui topi sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Etico della School of Life Science, Sun Yat-sen University.

Sono state coinvolte nello studio tre scimmie maschi di cynomolgus (da 4,4 a 4,8 anni) acquistate dalla Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd. Le scimmie dello studio sono state alloggiate da sole in gabbie di acciaio inossidabile e acclimatate all'alimentazione adattiva per almeno 2 settimane prima del primo giorno dello studio. Sono stati tatuati sul corpo e identificati in gabbia. Tutte le scimmie sono state allevate, alloggiate e utilizzate in condizioni convenzionali nel centro sperimentale per animali nel Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd. Gli studi sulle scimmie sono stati condotti con l'approvazione del Comitato etico del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat- sen University.

Affinità di legame tra DNA e materiali cationici o LL37

L'affinità di legame di PDMA, cNPs e LL37 con DNA è stata misurata da MST (Monolith NT.115, NanoTemper). Innanzitutto, sono state preparate le soluzioni madre, rispettivamente 200 μl di CpG 1826 marcato FAM 100 nM e 30 μl di materiale cationico 3.2 μM o soluzione LL37. Dopo che una diluizione seriale di materiali cationici o LL37 è stata preparata usando PBS nelle provette da 1 a 16, lo stesso volume di CpG marcato FAM è stato aggiunto a ciascuna provetta e miscelato mediante pipettaggio. Quindi, un capillare trattato standard Monolith NT.115 è stato immerso in ogni provetta da 1 a 16 e messo nelle posizioni da 1 a 16 del vassoio del dispositivo per iniziare la misurazione. Il colore di eccitazione era blu con un potere di eccitazione del 50%. I dati MST sono stati analizzati dal software MO.Affinity Analysis e costante di dissociazione Kd i valori sono stati calcolati usando a Kd modello.

Competere per il DNA dal complesso DNA-LL37

Per valutare l'efficienza di legame competitivo dei polimeri cationici con CpG dal complesso CpG-LL37, in primo luogo, la soluzione CpG 1826 marcata FAM e la soluzione LL37 senza etichetta sono state miscelate per 30 minuti con il rapporto di massa di 1: 5 per formare il CpG-LL37 complesso secondo il metodo in letteratura (13). A cui sono stati aggiunti diversi volumi delle soluzioni madre dei polimeri cationici. Dopo incubazione a 37 ° C per 30 minuti, la miscela è stata trasferita in una provetta di ultrafiltrazione per essere lavata e concentrata con una centrifuga e 100 μl di surnatante contenente il rimanente complesso polimerico CpG di ciascuna dose sono stati trasferiti su una piastra da 96 pozzetti . L'intensità di fluorescenza del complesso alla lunghezza d'onda di 590 nm è stata misurata mediante eccitazione a una lunghezza d'onda di 485 nm con un lettore di piastre multiparete (BioTek Synergy2 Gen5). Nel frattempo, la curva standard dell'intensità di fluorescenza di diversa concentrazione di CpG marcato con FAM è stata valutata per convertire l'intensità di fluorescenza in concentrazione di CpG. L'efficienza di legame NA con polimeri cationici è stata valutata da C1/C × 100%, dove C1 era il contenuto di CpG marcato con FAM nel surnatante dopo centrifuga e lavaggio e C era il contenuto totale di CpG marcato con FAM nel surnatante prima della centrifuga. Per verificare se LL37 era ancora combinato con CpG dopo l'interazione di CpG e polimeri, il contenuto di LL37 dello strato di polimero intercettato è stato misurato con lo stesso metodo, mentre sono stati utilizzati CpG 1826 senza etichetta e LL37 marcato FITC.

Blocco delle cellule attivate da DNA-LL37 con polimeri cationici

Per la valutazione dei polimeri cationici che inibiscono la stimolazione del DNA-LL37 dei pDC del topo, 5 × 104 le cellule in 200 μl di terreno completo per pozzetto sono state placcate in una piastra da 48 pozzetti. Dopo 12 ore di coltura, il terreno è stato sostituito con 200 ml di terreno contenente il complesso premiscelato di CpG 1826 (10 μg / ml) e LL37 (50 μg / ml). Polimeri cationici (25 μg / ml) sono stati aggiunti contemporaneamente. Dopo incubazione per 48 ore, i supernatanti sono stati raccolti e i livelli di espressione di IL-6 e TNF-α sono stati determinati con ELISA Kit. Per inibire la stimolazione del DNA delle cellule epidermiche primarie di topo, è stata eseguita la stessa procedura, mentre 3 × 104 le cellule epidermiche primarie per pozzetto sono state placcate in una piastra da 48 pozzetti. Dopo 48 ore, i supernatanti sono stati raccolti per misurare il livello di TNF-α.

Analisi della concentrazione di citochine con dosaggio di immunosorbenti enzimatico

La concentrazione di IL-6 e TNF-α nei supernatanti di coltura di cellule pDC di topo è stata determinata con il kit ELISA utilizzando kit ELISA IL-6 di topo e kit ELISA TNF-α di topo. Inoltre, le concentrazioni di TNF-α nei supernatanti di coltura di cellule epidermiche primarie di topo da cute psoriasica sono state determinate con kit ELISA utilizzando kit ELISA TNF-α di topo.

Induzione e trattamento del modello di topo

Topi BALB / c erano in anestesia dall'1,5 al 2% di isoflurano durante l'induzione della psoriasi e il trattamento topico con polimeri cationici. Il modello murino simile alla psoriasi è stato indotto dalla crema IMQ, chiamato modello murino indotto IMQ (modello murino IMQ) (23). Innanzitutto, è stata rasata un'area di pelle di 2 cm per 2 cm di topi BALB / c. Quindi, questa area cutanea di topi rasati alla schiena ha ricevuto una dose topica giornaliera di 62,5 mg di crema Aldara contenente 3,125 mg di IMQ. Dopo 7 giorni, l'infiammazione cutanea psoriasiforme è stata indotta con successo con i sintomi dell'eritema e della scala, indicando l'insorgenza della psoriasi. I topi IMQ sono stati equamente divisi in gruppi e gruppi di trattamento in modo casuale, con 10 topi per gruppo e 10 topi rasati alla schiena senza somministrazione di crema Aldara sono stati presi come gruppo normale.

I gruppi di trattamento del topo contenevano sei gruppi: PDMA (0,05 mg / cm2), PDMA (0,25 mg / cm2), PDMA (1,25 mg / cm2), cNP (0,05 mg / cm2), cNP (0,25 mg / cm2) e cNP (1,25 mg / cm2). La soluzione di polimero cationico con diversa concentrazione è stata dispersa in base di glicerina-gelatina (rapporto volume 1: 1) prima dell'uso, contenente il 15% di gelatina e il 10% di glicerina. Quindi, dai giorni 8 a 12, 200 μl di base di glicerina-gelatina con polimero cationico sono stati quotidianamente somministrati per via topica sulla pelle psoriasica sul retro, che è stata quindi immobilizzata con garza e bende. Per il gruppo modello, 200 μl di sola base di glicerina-gelatina sono stati applicati sulla pelle posteriore di ciascun topo IMQ. Al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento), il campione di sangue periferico di topi di diversi gruppi sono stati prelevati dall'orbita dell'occhio. La pelle posteriore e i principali organi interni sono stati raccolti dopo il sacrificio di topi sotto l'eccesso di isoflurano.

Induzione IMQ e terapia della scimmia cynomolgus

L'induzione della psoriasi e la somministrazione topica cNP di scimmie cynomolgus sono state tutte condotte sotto la fissazione di animali. La pelle posteriore di tre scimmie maschi di cynomolgus è stata rasata prima dell'induzione del modello. Quindi, un'area di 2 cm per 2 cm della pelle della parte bassa della schiena di ciascuna scimmia cinomolgus è stata scelta come area trattata con cNP e un'area di 2 cm per 2 cm della parte superiore della parte posteriore della pelle del modello è servita da autocontrollo. Pertanto, c'erano tre campioni in ciascun gruppo. Per l'induzione del sintomo psoriasico della scimmia cynomolgus, è stata eseguita la stessa procedura, mentre 250 mg di crema IMQ sono stati applicati su ciascuna area della pelle due volte al giorno.

Al giorno 8, dopo l'insorgenza della psoriasi, 100 μl di base di glicerina-gelatina con 10 mg di cNP sono stati applicati lentamente sull'area della pelle della schiena trattata con cNP fino all'assorbimento due volte al giorno. Lo stesso volume della sola base di glicerina-gelatina è stato applicato sull'area della pelle del modello come controllo. Dopo 5 giorni di trattamento, piccole aree (0,5 cm per 1 cm) di pelle trattata con cNP e pelle modello sono state raccolte, rispettivamente, dopo le scimmie cynomolgus dopo anestesia mediante iniezione intramuscolare di Zoletil 50 (da 4 a 6 mg / kg). Inoltre, è stata raccolta come controllo una piccola area (0,5 cm per 1 cm) di pelle normale. Quindi, la pelle posteriore è stata disinfettata con iodio medico e cucita.

Per valutare la tossicità in vivo dei cNP, tre scimmie cynomolgus sono state applicate localmente con i cNP (2,5 mg / cm2) due volte al giorno per 7 giorni. Un campione di sangue periferico di scimmia cynomolgus è stato raccolto mediante venipuntura dal vaso femorale prima del trattamento cNP (giorno 1) e dopo un trattamento di 7 giorni di cNP (giorno 8), e in questi giorni è stato registrato anche il peso corporeo delle scimmie cynomolgus. Gli animali sono stati a digiuno per almeno 8 ore prima della raccolta del sangue per analisi biochimiche.

Punteggio di gravità dell'infiammazione della pelle

La gravità dell'infiammazione cutanea della pelle posteriore dei topi e della scimmia cynomolgus è stata valutata giornalmente utilizzando un sistema di punteggio obiettivo sviluppato sulla base della PASI clinica. Eritema, ridimensionamento e ispessimento sono stati calcolati indipendentemente su una scala compresa tra 0 e 4: 0, nessuna; 1, leggero; 2, moderato; 3, contrassegnato; 4, molto marcato. Il punteggio cumulativo di eritema, ridimensionamento e ispessimento su una scala da 0 a 12 è servito come misura della gravità dell'infiammazione.

Fotografia

Per valutare l'infiammazione della pelle, la pelle posteriore dei topi di diversi gruppi è stata fotografata dalla telecamera al giorno 11 quando i sintomi psoriasici sono diventati più marcati. La pelle posteriore del modello e la pelle posteriore della scimmia cynomolgus trattata con cNP sono state fotografate dalla fotocamera al giorno 1 (prima della creazione del modello), al giorno 8 (dopo la creazione del modello) e giorni 9-13 (durante il trattamento).

Analisi istologiche e colorazione immunoistochimica

I campioni di pelle di topi e scimmie cynomolgus nonché cuore, fegato, milza, polmone e reni di topi erano precedentemente fissati in formalina al 10%. Dopo essere stati incorporati in paraffina, le sezioni di paraffina da 2 μm sono state tagliate dal microtomo (Leica) e quindi colorate con ematossilina ed eosina, rispettivamente. L'accumulo di cellule infiammatorie di diversi strati di pelle della pelle e la morfologia dei tessuti degli organi sono stati valutati dal sistema di imaging patologico quantitativo automatizzato Vectra (PerkinElmer) e lo spessore di diversi strati di pelle è stato misurato utilizzando il software ImageJ. Lo spessore medio di SC, epidermide e derma è stato calcolato da tre siti selezionati casualmente delle sezioni di pelle di ciascun animale.

Per la colorazione immunoistochimica, dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione, le fette di topi e pelle di scimmia cinomolgus sono state immerse in un tampone citrato di sodio 0,01 M a 125 ° C per 30 secondi, seguito da 10 secondi a 90 ° C per il recupero dell'antigene. Quindi, le fette sono state coperte con perossido di idrogeno al 3% per 5 minuti per inattivare la perossidasi endogena. Dopo che i siti di legame non specifici sono stati bloccati dal siero di capra al 10% in PBS, le fette sono state incubate con diversi anticorpi primari rispettivamente a 4 ° C per 24 ore. Quindi, le fette sono state incubate con anticorpo coniugato con HRP secondario a 37 ° C per 1 ora. Le sezioni sono state sviluppate utilizzando substrato DAB appena preparato, quindi sono state contrastate con ematossilina, disidratate e montate. Gli anticorpi primari includevano l'anticorpo anti-TNF-α, l'anticorpo anti-IL-6, l'anticorpo anti-IL-17, l'anticorpo anti-IL-22, l'anticorpo anti-IL-23, l'anticorpo anti-CD68, l'anticorpo anti-CD3 e anticorpo cellulare dendritico. Le immagini sono state acquisite e analizzate dal sistema di imaging automatizzato della patologia quantitativa Vectra. I risultati positivi (colorazione marrone) sono stati valutati utilizzando il software Nuance 3.0.2 e inForm 2.1.1. Le sezioni sono state scansionate e analizzate dal sistema di imaging della patologia quantitativa automatizzata Vectra e i risultati positivi (colorazione marrone) sono stati valutati utilizzando il software Nuance 3.0.2 e inForm 2.1.1.

Colorazione del DNA extracellulare negli strati cutanei

Il DNA extracellulare della pelle psoriasica è stato colorato secondo la letteratura (24). Al giorno 11 (dopo 3 giorni di trattamento) e al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento), la pelle del topo di vari gruppi è stata raccolta e immersa in O.C.T. Composto, quindi congelato a scatto in azoto liquido. Le criosezioni a sei micrometri di cute congelata sono state preparate usando un criostato clinico (Leica) e fissate in paraformaldeide al 4% per 30 minuti. I vetrini sono stati colorati con SYTOX Orange NA (1: 3000) per 15 minuti, quindi lavati con PBS tre volte e sono stati montati i vetrini coprioggetto. Inoltre, un'altra diapositiva dello stesso tessuto incorporato senza fissazione è stata trattata con DNasi І (1 mg / ml) per 30 minuti prima della colorazione SYTOX Orange, che è stata utilizzata come controllo in base alla letteratura (24). I vetrini sono stati ripresi mediante microscopia confocale (Leica SP8) e il cfDNA della quantità quantitativa della pelle è stato analizzato dal software ImageJ.

Estrazione e misurazione del DNA

Per l'estrazione di cfDNA nel siero di topo, il campione di sangue periferico di topi è stato prima centrifugato a 300g per 10 minuti, quindi la frazione è stata recentemente centrifugata a 12.000g per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari, che sono stati conservati a -80 ° C prima dell'analisi. Il cfDNA da 100 ml di siero è stato estratto con il kit Dynabeads SILANE Viral NA e la sua concentrazione è stata determinata utilizzando il kit di dosaggio Quantico iT PicoGreen dsDNA.

PCR in tempo reale

Al giorno 13, la pelle dei topi sacrificati è stata tagliata e omogeneizzata in un reagente TRIzol con un omogeneizzatore (T 25 digitale ULTRA-TURRAX, IKA) e l'RNA totale della pelle è stato estratto utilizzando il kit di tessuti universale RNeasy. Per la trascrizione inversa dell'RNA nel DNA complementare (cDNA), 2 μg di RNA sono stati trattati con il kit di reagenti PrimeScript RT con gomma gDNA e oligo (dT) in un volume totale di 20 μl. La PCR quantitativa in tempo reale dei livelli di cDNA è stata eseguita da SYBR Green in tempo reale nel Lightcycler (PCR quantitativa di Applied Biosystems) e i livelli di mRNA di citochine sono stati corretti con i loro livelli di mRNA di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi per normalizzare l'ingresso di RNA. I livelli relativi di mRNA delle citochine nel gruppo normale sono stati impostati come 1. Le sequenze dei primer erano le seguenti: qGADPH FP: 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ e qGADPH AP: 5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3 ′; qTNF-α FP: 5′- ACTCCAGGCGGTGCCTATGT-3 ′ e qTNF-α AP: 5′- GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3 ′; qIL-6 FP: 5′- CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3 ′ e qIL-6 AP: 5′- TGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3 ′; qIL-17A FP: 5′- GAAGGCCCTCAGACTACCTCAA-3 ′ e qIL-17A AP: 5′-TCATGTGGTGGTCCAGCTTTC-3 ′; qIL-17F FP: 5′- TGTCCCACGTGAATTCCAGA-3 ′ e qIL-17F AP: 5′- CATTGATGCAGCCTGAGTGTC-3 ′; qIL-22 FP: 5′- TCCAGCAGCCATACATCGTC-3 ′ e qIL-22 AP: 5′-CTTCCAGGGTGAAGTTGAGCA-3 ′; e qIL-23 FP: 5′-ACATGCACCAGCGGGACATA-3 ′ e qIL-23 AP: 5′-CTTTGAAGATGTCAGAGTCAAGCAG-3 ′.

Penetrazione cutanea e biodistribuzione dei polimeri cationici

Al giorno 11, sia i topi normali sia i topi IMQ sono stati somministrati per via topica con PDMA marcato con FITC o cNP in base di glicerina-gelatina. A 2, 6 e 24 ore, la pelle posteriore dei topi trattati con polimeri cationici marcati con FITC è stata tagliata e incorporata in O.C.T. Composto. Dopo essere stato congelato a scatto in azoto liquido, il tessuto è stato sezionato a 6 μm. Dopo la fissazione con paraformaldeide al 4% per 30 minuti, la fetta è stata colorata con DAPI (1: 1000) per 20 minuti e lavata con PBS tre volte. La penetrazione di polimeri cationici di diversi strati cutanei è stata valutata mediante microscopia confocale e l'intensità della fluorescenza dei polimeri nell'epidermide e nel derma di topi normali e modello è stata manifestata dalla densità ottica media quantificata dal software ImageJ. Per la quantificazione, i polimeri cationici di pelle e organi principali, pelle posteriore, cuore, fegato, milza, polmone e rene di topi IMQ trattati con polimeri marcati con FITC sono stati raccolti e omogeneizzati in PBS con un omogeneizzatore. L'intensità di fluorescenza del surnatante è stata analizzata con un lettore di piastre multiparete con la luce di eccitazione a una lunghezza d'onda di 485 nm. È stata valutata la curva standard dell'intensità di fluorescenza della diversa concentrazione di polimeri marcati con FITC ed è stata calcolata la quantità di polimeri cationici in diversi organi. È stata valutata la percentuale del polimero trattenuto in diversi organi UN1/UN × 100%, dove UN1 era la quantità del polimero nell'organo e UN era la quantità iniziale dei polimeri applicati sulla pelle.

Analisi di ALP, ALT, AST, Cr, urea e UA nel siero

I campioni di sangue periferico di topi raccolti al giorno 13 sono stati centrifugati a 300g per 10 minuti e la frazione di plasma è stata recentemente centrifugata a 12.000g ancora per 10 minuti per ottenere siero privo di cellule. Quindi, 100 μl di siero di topo sono stati diluiti a 300 μl con PBS. I livelli di ALP, ALT, AST, Cr, urea e UA nei sieri di topo sono stati misurati dall'analizzatore biochimico automatico (FAITH-1000, Nanjing Laola Electronics Co. Ltd) e dai livelli sierici di ALP, ALT, AST, Cr , urea e UA nelle scimmie cynomolgus prima del trattamento cNP e dopo il trattamento cNP sono stati analizzati dal Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd.

statistica

Le differenze statistiche delle piaghe PASI sono state valutate utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita da un test post hoc con differenza minima (LSD) con il software GraphPad Prism 7.0. L'analisi statistica di altri dati sperimentali è stata eseguita da ANOVA unidirezionale con test post hoc LSD utilizzando IBM SPSS Statistic 22. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Ringraziamenti: Riconosciamo C. Du nell'Università della Tecnologia della Cina meridionale che ha fornito MST. finanziamento: È riconosciuto il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (sovvenzione n. 21875290 e 51820105004), il programma del team di ricerca innovativa e imprenditoriale del Guangdong (n. 2013S086) e la Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (n. 2014A030312018). Contributi dell'autore: H.L. condusse i principali esperimenti e scrisse il manoscritto. Y.Y. assistito con esperimenti con il mouse. J.W. assistito nella preparazione del materiale. X.G. e L.W. incaricato lo studio della scimmia cinomolgus. L.L. ha progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. Y.C. ha progettato materiali, supervisionato e scritto il manoscritto. Interessi conflittuali: Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco. Disponibilità di dati e materiali: Tutti i dati necessari per valutare le conclusioni nel documento sono presenti nel documento e / o nei materiali supplementari. Ulteriori dati relativi a questo documento possono essere richiesti agli autori.

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INTRODUZIONE

La psoriasi è una malattia cutanea autoinfiammatoria che colpisce dal 2 al 3% della popolazione mondiale (1, 2). È una malattia della pelle papulosquamous con morfologia ben nota di placche rosse coperte da squame bianche o d'argento sulla pelle (3, 4). Istologicamente, le lesioni psoriasiche presentano alcune caratteristiche definite di iperplasia epidermica, generazione di vasi sanguigni cutanei e infiltrazione dei leucociti nel derma (5, 6). Le scelte delle strategie terapeutiche per la psoriasi dipendono dallo stato della malattia. Le terapie topiche di glucocorticosteroidi e derivati ​​della vitamina D sono terapie convenzionali, ma sono efficaci solo per le malattie lievi e hanno effetti avversi come l'irritazione della pelle (7, 8). Per la psoriasi grave, agenti biologici, come gli inibitori del fattore di necrosi tumorale – α (TNF-α) e interleuchina-17 (IL-17), vengono somministrati sistematicamente ai pazienti per colpire molecole specifiche nella patogenesi della psoriasi e inibire l'infiammazione (9, 10). Tuttavia, causano un alto rischio di infezione e cancro a causa dell'immunosoppressione cronica a lungo termine (11). Inoltre, il consumo di tempo limita l'uso della fototerapia e della fotochemioterapia, sebbene siano efficaci per la psoriasi da moderata a grave (6). I limiti di questi trattamenti per la psoriasi hanno incoraggiato ulteriori indagini su opzioni terapeutiche alternative.

Sebbene la patogenesi della psoriasi sia complicata, è chiaramente riconosciuto che il DNA privo di cellule (cfDNA) svolge un ruolo critico nello sviluppo della psoriasi. Uno studio clinico ha mostrato un aumento significativo dei livelli sierici di cfDNA nei pazienti con psoriasi esacerbata (12). La tolleranza innata al cfDNA viene interrotta formando un immunocomplesso con LL37, un peptide antimicrobico che è altamente espresso nella pelle psoriasica. LL37 fornisce cfDNA alle cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) per innescare il recettore Toll-like 9 (TLR9) e produrre citochine infiammatorie, portando all'attivazione delle cellule T (13, 14). Inoltre, dati in aumento suggeriscono che i cheratinociti epidermici (KC) riconoscono e rispondono al complesso DNA-LL37 e partecipano attivamente all'inizio della risposta infiammatoria cutanea (15, 16). Questi studi suggeriscono che il cfDNA potrebbe essere un bersaglio per nuovi farmaci per la psoriasi.

I ricercatori hanno recentemente utilizzato polimeri cationici per eliminare gli acidi nucleici (NA) rilasciati da cellule morte e morenti per distruggere i complessi immunitari, fornendo un nuovo concetto per trattare l'infiammazione sterile. La prova del principio è stata confermata nei modelli animali di shock tossico acuto (17), lupus eritematoso sistemico (18), artrite reumatoide (19, 20), ecc. In questi studi, i polimeri cationici hanno mostrato un effetto straordinario bloccando l'infiammazione indotta dal cfDNA attraverso la somministrazione sistemica. Tuttavia, la somministrazione sistemica di materiali cationici presenta un grande rischio di tossicità. La psoriasi danneggia principalmente la pelle e il trattamento topico con materiali cationici sarebbe preferenziale e sicuro per la somministrazione (21).

Qui, abbiamo applicato in modo innovativo la somministrazione topica di polimeri cationici sulla pelle per trattare la psoriasi (Fig. 1A). Sulla base della patogenesi della psoriasi correlata all'immunocomplesso DNA-LL37, abbiamo studiato l'interazione tra polimeri cationici e DNA nonché polipeptidi. Abbiamo scoperto che i polimeri cationici con un'elevata affinità di legame al DNA estraggono efficacemente il cfDNA dal complesso DNA-LL37, che, a sua volta, ha inibito in modo efficiente l'attivazione delle cellule epidermiche primarie. La terapia topica con polimeri cationici su topi psoriasici indotti da imiquimod (IMQ) ha notevolmente ridotto squame ed eritema, infiltrazione di leucociti e citochine proinfiammatorie. Un'efficacia terapeutica più significativa è stata ottenuta con nanoparticelle cationiche (cNPs) invece di polycations solubili a causa della loro ritenzione più favorevole nella pelle psoriasica e della maggiore capacità di scavenging della NA. È interessante notare che i risultati terapeutici dei cNP sono stati confermati nelle scimmie psoriasiche di cynomolgus. Inoltre, i cNP hanno mostrato un elevato accumulo solo negli strati cutanei senza alcuna tossicità apparente negli animali e sia i topi IMQ che le scimmie cynomolgus hanno mantenuto le normali funzioni epatiche e renali durante il trattamento cNP. I risultati significativi di questo studio, in particolare i dati delle scimmie cynomolgus, suggeriscono che i cNP dimostrano un grande potenziale traslazionale per l'applicazione clinica alla psoriasi.

Fig. 1 I cNP mostrano un'elevata capacità di legame al DNA e un'efficace inibizione dell'infiammazione indotta dal DNA-LL37.

(UN) Meccanismo di terapia topica da parte di cNP per lo scavenging del cfDNA e l'inibizione infiammatoria per il trattamento della psoriasi. Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (B) Affinità di legame tra CpG marcato FAM e materiali cationici / LL37 misurata da MST. (C) Efficienza di legame competitiva dei polimeri cationici con CpG dal complesso CpG-LL37 e efficienza di legame LL37 con polimeri (n = 3; significa ± SEM). (D e E) Polimeri cationici down-regolati IL-6 (D) e TNF-α (E) indotti dal complesso CpG-LL37 nei pDC del topo (n = 3; significa ± SEM; ***P <0,001 tra due gruppi e ###P <0,001 rispetto al gruppo normale). (F) I polimeri cationici hanno inibito l'espressione del TNF-α nelle cellule epidermiche primarie (n = 3; significa ± SEM; ** 0,001 < P <0,01 tra due gruppi e ## 0,001 < P <0,01 rispetto al gruppo normale). In (D) a (F), la significatività statistica è stata calcolata mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test post hoc con differenza meno significativa (LSD).

RISULTATI

I cNP competono efficacemente per il DNA dal suo complesso LL37 e inibiscono l'infiammazione

cNPs con un diametro idrodinamico di ca. 70 nm sono stati preparati mediante autoassemblaggio del copolimero diblock di poli (lattico-co-acido glicolico) (PLGA) e poli (2- (dietilammino) etil metacrilato) (PDMA), PLGA-B-PDMA474 (fig. S1A) e un omopolimero PDMA480 con una lunghezza della catena simile al guscio PDMA di cNPs è stato utilizzato per il confronto (vedere la struttura chimica nella figura S1B). In precedenza, avevamo osservato che PLGA-B-PNMA I cNP hanno un potenziale zeta più positivo e una maggiore efficienza di legame al DNA rispetto al PDMA sia nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) che nel siero bovino fetale al 10% (FBS) (18). Pertanto, riteniamo che la nanostruttura core-shell dei cNP potrebbe essere utile per interferire con il complesso immunitario della psoriasi DNA-LL37. LL37 è un polipeptide cationico che interagisce con il DNA per formare il complesso immunitario. Pertanto, la termoforesi su microscala (MST), una tecnologia per quantificare gli eventi di legame con elevata sensibilità e ampio intervallo di rilevazione, è stata utilizzata per determinare l'affinità di legame del DNA con LL37, PDMA e cNP, rispettivamente (Fig. 1B). La citidina-fosfato-guanosina oligodeossinucleotide 1826 (CpG 1826), la sequenza di DNA del modello, è stata etichettata con il colorante fluorescente 6-carbossi-fluoresceina (FAM) ed è diventata un giornalista estremamente sensibile per tutte le interazioni di legame. Quando è stato miscelato con materiali cationici, l'evento di legame ha causato un cambiamento nel segnale MST che è stato rilevato e tradotto in costante di dissociazione quantitativa Kd valori. Il più piccolo Kd è, il legame più forte tra due elementi è. Le misurazioni MST hanno mostrato che i cNP avevano la costante di dissociazione più bassa di 0,13 nM, che era la più alta affinità di legame del DNA tra due materiali cationici e LL37. PDMA con a Kd il valore di 0,98 nM aveva la seconda più alta affinità per CpG. comunque, il Kd il valore tra CpG e LL37 era 1,94 μM, indicando che l'affinità di legame tra CpG e cNP era ~ 1 × 104– più forte rispetto a quello tra CpG e LL37.

Abbiamo ipotizzato che, con una capacità di legame così forte, i cNP avevano la capacità di competere per il DNA dal suo complesso LL37. Per verificare questa ipotesi, abbiamo condotto esperimenti di associazione competitiva per analizzare i contenuti di CpG e LL37 legati ai polimeri come mostrato in fig. S2. Abbiamo prima premiscelato CpG 1826 marcato FAM con LL37 senza etichetta per generare il complesso CpG-LL37. Quindi, abbiamo incubato il complesso con PDMA o cNP per 30 minuti. Il complesso polimero CpG è stato separato mediante centrifugazione di ultrafiltrazione e l'efficienza di legame, data come partizione CpG (%), è stata calcolata quantificando la concentrazione di CpG in base all'intensità della fluorescenza FAM. Inoltre, per determinare se i polimeri potrebbero estrarre CpG da CpG-LL37 per formare un polimero CpG (ipotesi 1 in fig. S2) o formare direttamente un complesso polimerico CpG-LL37 senza dissociazione di CpG-LL37 (ipotesi 2 in fig. S2), il contenuto di LL37 è stato valutato dopo che i polimeri sono stati aggiunti al complesso di CpG e LL37 marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) con la stessa procedura usata sopra. Un'alta intensità di fluorescenza di FAM-CpG potrebbe essere rilevata negli strati polimerici, dimostrando una forte interazione tra polimeri e CpG (linea continua in Fig. 1C). Tuttavia, abbiamo scoperto che LL37 aveva segnali fluorescenti quasi non rilevabili negli strati polimerici (linea tratteggiata in Fig. 1C), indicando che i polimeri cationici dissociavano il complesso CpG-LL37 per formare un complesso polimero CpG. Inoltre, rispetto al PDMA, i cNP avevano una maggiore capacità di estrarre CpG dal complesso anche a una concentrazione di soli 20 μg / ml quando l'efficienza di legame era del 60% per i cNP e del 40% per il PDMA. Inoltre, la capacità di legame del DNA è stata aumentata con la dose di cNP (Fig. 1C).

Successivamente, abbiamo esaminato se i polimeri cationici inibissero l'attivazione dell'infiammazione cellulare mediata dal complesso DNA-LL37. Sebbene il LL37 libero non fosse in grado di indurre l'attivazione di TLR9, il suo complesso di DNA ha attivato i pDC attraverso TLR9 per secernere citochine infiammatorie (13). cNPs e PDMA hanno inibito l'attivazione di pDC del topo indotta dal complesso CpG-LL37, che è stato dimostrato dalla down-regolazione dei livelli di IL-6 e TNF-α (Fig. 1, D ed E). Questi risultati hanno suggerito che cNP e PDMA potrebbero inibire l'attivazione di pDC indotta dal complesso DNA-LL37 nella psoriasi. Ulteriori esperimenti hanno mostrato gli stessi effetti dei polimeri cationici sulle cellule epidermiche primarie dei topi psoriasici (Fig. 1F). Inoltre, i polimeri cationici da soli non hanno attivato l'infiammazione, come manifestato dai livelli di citochine simili al controllo (Fig. 1, da D a F).

Il trattamento topico con cNP allevia i sintomi psoriasici dei topi IMQ

Per valutare l'effetto terapeutico in vivo, abbiamo successivamente valutato il trattamento topico del modello murino indotto dall'IMQ con polimeri cationici, che viene utilizzato come modello murino psoriasiforme acuto perché provoca una dermatite simile ad alcuni aspetti della psoriasi umana (22). Dopo aver somministrato topicamente la crema IMQ per 7 giorni, IMQ come agonista TLR7 / 8 ha indotto una serie di reazioni infiammatorie cutanee per provocare eritema, squame e ispessimento di cerotti cutanei, indicando l'insorgenza della psoriasi (Fig. 2A). Topi indotti da IMQ hanno mostrato punteggi significativamente più alti nell'area della psoriasi e nell'indice di gravità (PASI) rispetto al normale durante l'esperimento (Fig. 2B). Nei successivi 5 giorni, una soluzione di cNP o PDMA dispersa in una base di glicerina-gelatina è stata applicata quotidianamente sulla pelle psoriasica dei topi IMQ a dosi di polimero gradiente di 0,05, 0,25 e 1,25 mg / cm2. Con l'aiuto della base, l'idratazione dello strato corneo (SC) e l'adesione dei polimeri sulla superficie della pelle sono state entrambe aumentate, il che ha giovato all'efficacia terapeutica. Il gruppo modello applicato solo con la base di glicerina-gelatina è stato usato come controllo. Durante il periodo di trattamento dai giorni 9 a 13, sia i cNP che il PDMA hanno ridotto l'infiammazione dei topi IMQ in modo dose-dipendente (Fig. 2, B e C). Alla dose di 0,25 mg / cm2, i cNP avevano già dimostrato la loro efficacia terapeutica sulla pelle psoriasica del topo, come indicato dalla riduzione di squame ed eritema, nonché da significativi punteggi PASI inferiori rispetto al modello. Tuttavia, PDMA allo stesso dosaggio non ha comportato una differenza significativa dei punteggi PASI dal gruppo modello. A una dose elevata di 1,25 mg / cm2, i cNP hanno persino levigato e diluito la pelle psoriasica e hanno portato l'aspetto molto più vicino alla pelle normale con scale appena visibili, il che ha portato al punteggio PASI più basso di tutti i gruppi tranne il gruppo normale. Inoltre, i cNP hanno mostrato un eritema, uno spessore e punteggi cumulativi significativamente inferiori rispetto al PDMA ad alto dosaggio (Fig. 2B).

Fig.2 cNPs migliora le condizioni psoriasiche dei topi IMQ.

(UN) Programma sperimentale degli esperimenti del mouse IMQ. Pelle psoriasiforme acuta sviluppata dopo l'applicazione quotidiana della crema IMQ sulla pelle posteriore per 7 giorni. Quindi, i topi IMQ sono stati trattati topicamente con cNP o PDMA quotidianamente a dosaggi di 0,05, 0,25 e 1,25 mg / cm2 dai giorni 8 a 12. Ulteriori analisi sono state eseguite dopo aver sacrificato i topi al giorno 13. (B) Eritema, ridimensionamento e spessore della pelle posteriore sono stati assegnati giornalmente da 0 a 4. Inoltre, viene mostrato il punteggio cumulativo come somma dei punteggi di eritema, scala e spessore (n = 10; significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01 e ***P <0,001 tra due gruppi dai giorni 9 a 13, # 0,01 < P <0,05, ## 0,001 < P <0,01 e ###P <0,001 rispetto al gruppo modello dai giorni 9 a 13 e P <0,001 tra il gruppo normale e altri gruppi dai giorni 1 a 13). (C) Morfologia rappresentativa della superficie cutanea dei vari gruppi al giorno 11 (dopo 3 giorni di trattamento) e colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) (× 400) delle sezioni della pelle di tutti i gruppi al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento). Una rete epidermica allungata (asterisco) e un infiltrato infiammatorio contenente linfociti (freccia) all'interno del derma erano chiaramente evidenti nel gruppo modello. Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (D) Analisi dello spessore di SC, strato epidermico e DC della pelle del topo posteriore in sezioni colorate con H & E dal software ImageJ (n = 5; significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01, ***P <0,001 tra due gruppi e # 0,01 < P <0,05, ## 0,001 < P <0,01 e ###P <0,001 rispetto al gruppo di modelli). In (B) e (D), la significatività statistica è stata calcolata dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

La psoriasi mostra la definizione di cambiamenti istopatologici. Nei topi modello IMQ, c'era un'aumentata proliferazione di KC nell'epidermide vitale (VE) con caratteristiche psoriasiche tra cui l'acantosi epidermica (vedi ispessimento dello strato di VE in Fig. 2C), ipercheratosi e parakeratosi nello SC (vedi lo strato di SC in Fig. 2C). Inoltre, le creste della rete epidermica si sono notevolmente allungate e hanno persino formato ondulazioni lunghe e sottili che si estendevano nel derma (contrassegnato come * nello strato dello strato cutaneo (DE) in Fig. 2C). Nelle lesioni psoriasiche, si è verificata un'enorme infiltrazione di leucociti nel derma, tra cui cellule T e DC mescolate (indicato da frecce nello strato DE in Fig. 2C). Dopo il trattamento topico con polimeri cationici, tutti questi sintomi patologici dei topi IMQ sono stati alleviati. Dopo i trattamenti PDMA e cNP a dosi di 0,25 o 1,25 mg / cm2, la proliferazione di KC è stata inibita in modo efficiente e l'epidermide è diventata più sottile di quella dei topi modello con una diminuzione della rete epidermica allungata (Fig. 2, C e D). Tuttavia, in 0,25 e 1,25 mg / cm2 gruppi cNP, lo spessore dello strato di SC è stato persino notevolmente ridotto rispetto al gruppo modello, che è stato mostrato da una riduzione delle squame nell'aspetto clinico, mentre tutti i gruppi trattati con PDMA non hanno mostrato una SC più sottile significativamente rispetto al modello (Fig. 2 , C e D). Inoltre, dopo il trattamento con cNP, gli aggregati di leucociti mononucleari nello strato del derma sono stati ridotti in modo significativo, indicando che i cNP hanno efficacemente soppresso l'infiammazione della pelle psoriasica (Fig. 2C). Sia l'analisi della morfologia che l'istologia hanno dimostrato che i cNP hanno alleviato i sintomi psoriasici dei topi IMQ meglio del PDMA.

i cNP inibiscono in modo più efficiente l'accumulo di cellule immunitarie e l'espressione di più citochine nelle lesioni psoriasiche

Nel modello IMQ, l'IMQ induce non solo cambiamenti fenotipici coerenti con la psoriasi, ma anche cambiamenti in più tipi di cellule, citochine e vie infiammatorie coinvolte nella perdita dell'omeostasi nella pelle (23). L'aumento del numero di cellule immunitarie, in particolare cellule dendritiche, cellule T e macrofagi, nelle lesioni psoriasiche gioca un ruolo importante nella transizione dall'immunità innata a quella adattativa nella psoriasi producendo citochine proinfiammatorie e chemochine2). La colorazione immunochimica delle cellule immunitarie ha mostrato la quantità di monociti e macrofagi (CD68+), Cellule T (CD3+) e cellule dendritiche reclutate nel sito psoriasico nel modello IMQ (Fig. 3A). Tuttavia, il trattamento con cNP e PDMA ha ridotto efficacemente l'infiltrazione di queste cellule immunitarie. La quantificazione delle cellule immunocolorate indicava che il numero di monociti e macrofagi, cellule T e cellule dendritiche era ovviamente inferiore in entrambi i gruppi polimerici cationici, mentre i cNP mostravano una maggiore efficienza di inibizione con il numero di cellule immunitarie molto più vicine alla norma (fig. S3).

Fig. 3 i cNP riducono più efficacemente le cellule infiammatorie e l'espressione di citochine proinfiammatorie nei topi IMQ.

(UN) Rilevazione immunoistochimica di monociti e macrofagi (CD68+), Cellula T (CD3+) e infiltrati di cellule dendritiche nella pelle psoriasica di vari gruppi (× 400). L'inserto indica l'immagine ingrandita di colorazione positiva (× 800). (B) Le citochine proinfiammatorie coinvolte nella patogenesi della psoriasi, tra cui IL-6, TNF-α, IL-17, IL-22 e IL-23, sono state analizzate mediante immunochimica (× 400). (C) livelli di mRNA di citochine IL-6, TNF-α, IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23 nella pelle al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento) (n = 5; significa ± SEM; ** 0,001 < P <0.01 e ***P <0,001 rispetto al gruppo di modelli). Il significato statistico è stato calcolato dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Abbiamo inoltre determinato se i cationici proinfiammatori down-regolati dei polimeri cationici secreti nelle lesioni psoriasiche. Il percorso delle citochine della psoriasi indotta dall'IMQ dipende in particolare dall'asse IL-17/23, che condivide somiglianze con la psoriasi umana (22). Oltre a IL-23 e IL-17 e IL-22, che sono relativi alle cellule dell'helper T effettore 17, le citochine proinfiammatorie come TNF-α e IL-6 sono funzionalmente coinvolte nella patogenesi della psoriasi. Quindi, le citochine proinfiammatorie, tra cui TNF-α, IL-6, IL-17, IL-22 e IL-23, sono state misurate nelle lesioni psoriasiche dei topi IMQ. I risultati della colorazione immunoistochimica hanno mostrato che i livelli di queste citochine erano ovviamente sovraregolati dalla dermatite indotta da IMQ. Dopo il trattamento con cNP e PDMA, i livelli di citochine della pelle psoriasica sono stati tutti ridotti rispetto al gruppo modello. La quantificazione ha mostrato che i cNP hanno ridotto significativamente l'espressione di IL-6 e IL-17 rispetto al gruppo PDMA (Fig. 3B e Fig. S3). I risultati sono stati confermati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale che indica che i livelli di mRNA di queste citochine infiammatorie chiave, tra cui TNF-α, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23 , nelle lesioni psoriasiche erano state tutte down-regolate dopo 5 giorni di trattamento con cNP e PDMA ed erano persino vicine ai livelli normali (Fig. 3C). L'analisi sia dell'infiltrazione dei leucociti che dei livelli di citochine proinfiammatorie ha verificato che i cNP hanno dimostrato un'inibizione infiammatoria più efficiente in vivo.

cNPs con maggiore accumulo nella pelle psoriasica riducono meglio il cfDNA

Per comprendere gli effetti terapeutici dei polimeri cationici, abbiamo esaminato la penetrazione cutanea e la biodistribuzione di cNP e PDMA. Abbiamo applicato topicamente polimeri cationici marcati con FITC con la base di glicerina-gelatina sulla pelle rasata del modello e dei topi normali, e quindi i campioni di pelle e organi interni sono stati raccolti in vari punti temporali. Quindi, l'accumulo di cNP e PDMA in diversi strati cutanei è stato analizzato mediante microscopia confocale. Inoltre, per valutare la biodistribuzione dei polimeri cationici in vivo, l'intensità di fluorescenza dei polimeri negli omogenati di organi è stata utilizzata per quantificare il contenuto di polimeri in ciascun organo. I risultati hanno mostrato che i cNP e il PDMA sono penetrati nella pelle sia del modello che dei topi normali dopo somministrazione topica (Fig. 4A e Fig. S4). Tuttavia, l'accumulo di PDMA e cNP nella pelle psoriasica potrebbe raggiungere il picco a 6 ore, mentre raggiungevano il massimo nella pelle normale almeno a 24 ore (fig. S4, B e C). L'assorbimento e il traffico dei materiali nella pelle psoriasica sono stati più rapidi che nella pelle normale perché la permeabilità è stata aumentata dalla barriera SC irregolare. Inoltre, i cNP sono stati mantenuti più nei diversi strati di pelle psoriasica rispetto al PDMA durante i tempi di osservazione. A 2 ore, i cNP si erano già accumulati nell'epidermide dove il PDMA mostrava un segnale più basso e, a 6 ore, più cNP erano dispersi nel derma rispetto al PDMA. Quindi, i cNP hanno mostrato un accumulo più favorevole sia nell'epidermide che nel derma, come manifestato dalla significativa maggiore intensità di fluorescenza FITC in diversi punti temporali (fig. S4, B e C). Inoltre, un livello più elevato e una più lunga ritenzione di cNP nella pelle psoriasica potrebbero spiegare la loro migliore efficacia del trattamento.

Fig. 4 i cNP rimangono più efficacemente negli strati cutanei con minore assorbimento da parte degli organi interni.

(UN) Immagini confocali di penetrazione cutanea da parte di PDMA e cNP nella cute psoriasica del mouse IMQ a 2, 6 e 24 ore dopo la somministrazione (× 200). Sia PDMA che cNP sono stati etichettati con FITC (verde). I nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI (blu). HF, follicoli piliferi. (B) Contenuto di polimeri cationici marcati con FITC conservati nella pelle e nei principali organi, inclusi fegato, reni, cuore, milza e polmoni, calcolati mediante quantificazione della fluorescenza (n = 5, significa ± SEM; * 0,01 < P <0,05, ** 0,001 < P <0,01, ***P <0,001 tra due gruppi e # 0,01 < P <0.05, ###P <0,001 rispetto al polimero nella pelle dello stesso gruppo). (C) Livelli di ALP, ALT, AST, Cr, UA e urea nel siero di topo dopo 5 giorni di trattamento. Sieri di topo normali, modello, PDMA (1,25 mg / cm2) e cNP (1,25 mg / cm2) i gruppi sono stati raccolti al giorno 13 (dopo 5 giorni di trattamento) (n = 5; significa ± SEM; ###P <0,001 rispetto al gruppo normale). In (B) e (C), la significatività statistica è stata calcolata dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Successivamente, la distribuzione dei polimeri cationici in vari organi è stata quantificata dall'intensità della fluorescenza. È stato interessante osservare una distribuzione inversa dei due materiali in base ai risultati, sebbene il loro accumulo negli organi interni fosse piuttosto inferiore rispetto a quello nella pelle (Fig. 4B). Nella pelle, i livelli di cNP erano sempre più alti dei livelli di PDMA. Tuttavia, a 2 ore, il PDMA si era già distribuito negli organi specialmente nel fegato e i livelli di cNP nei principali organi interni, tra cui fegato, reni, cuore, milza e polmoni, erano tutti molto più bassi dei livelli di PDMA durante l'osservazione. La differenza di biodistribuzione tra PDMA e cNP ha anche portato a diverse tossicità. La colorazione istologica dei principali organi ha mostrato che il PDMA ha causato diversi gradi di lesioni nel fegato e nei reni, mentre il trattamento con cNP non ha causato danni evidenti ai vari organi principali (fig. S5). Inoltre, l'epatotossicità dei cNP riflessi dai livelli di fosfatasi alcalina (ALP), alanina transaminasi (ALT) e aspartato transaminasi (AST) e la loro nefrotossicità riflessa dalla creatinina (Cr), dall'acido urico (UA) e dall'urea dopo il trattamento erano tutti vicino a quelli del gruppo normale anche alla dose più alta di 1,25 mg / cm2. Al contrario, il gruppo PDMA ha mostrato un aumento di sei volte del livello di ALT e un duplice aumento del livello di AST, implicando una grave lesione epatica. Inoltre, aumenti significativi di UA e urea nel gruppo PDMA hanno indicato l'interruzione delle funzioni renali (Fig. 4C). Pertanto, il basso accumulo negli organi interni dei cNP ha comportato una bassa tossicità in contrasto con il PDMA.

Abbiamo ipotizzato che la biodistribuzione di PDMA e cNPs possa influenzare i livelli di cfDNA in vivo. Pertanto, abbiamo misurato i livelli di cfDNA nelle lesioni psoriasiche e nella circolazione. Per rilevare il cfDNA nelle lesioni psoriasiche dei topi, sezioni congelate di 6 micron di pelle di topo sono state colorate con SYTOX Orange, una colorazione NA ad alta affinità, che colora intensamente i DNA extracellulari. Questi DNA extracellulari possono essere distinti dai cromosomi nucleari per la loro struttura di fili intrecciati e l'aspetto del filo spinato (24, 25). Nelle lesioni psoriasiche di topi IMQ, è stato rilevato tale DNA extracellulare con una struttura di filo intrecciato (indicato dalle frecce nelle Figure 5, A e B e 6A). Per la verifica, un'altra sezione dello stesso tessuto incorporato è stata utilizzata come controllo trattato con desossiribonucleasi I (DNasi І) per degradare il DNA extracellulare prima della colorazione SYTOX. Dopo il trattamento con DNase І, la struttura del filo intrecciato non era più rilevabile, indicando che l'essenza di questi fili colorati con SYTOX Orange era il cfDNA (Fig. 5A). Ulteriori risultati della colorazione hanno mostrato una grande quantità di cfDNA che circonda il derma dei topi modello IMQ al giorno 11. Tre giorni di trattamento con PDMA hanno avuto qualche effetto sulla riduzione del livello di cfDNA nelle lesioni psoriasiche. Tuttavia, il gruppo cNP ha mostrato un livello significativamente inferiore di cfDNA locale rispetto ai gruppi modello e PDMA (Fig. 5B e Fig. S6B). Al giorno 13, quando i topi IMQ erano stati trattati per 5 giorni, il livello locale di cfDNA nel gruppo cNP era la metà di quello nel gruppo PDMA e notevolmente inferiore a quello nel gruppo modello (fig. S6, A e C). Inoltre, sia i trattamenti cNP che PDMA hanno down-regolato il cfDNA sistemico allo stesso livello di quello nei topi normali, mentre il livello di CFDNA in circolazione nei topi modello era ancora elevato al giorno 13 (Fig. 5C). A differenza delle lesioni psoriasiche, i cNP e il PDMA non hanno fatto alcuna differenza nel lavaggio del cfDNA sistemico dopo 5 giorni (Fig. 5C). Questo risultato è stato coerente con la distribuzione di PDMA e cNP in vivo, in cui il PDMA si è disperso relativamente di più nella circolazione per interagire con il cfDNA sistemico, mentre i cNP con maggiore accumulo nella pelle psoriasica hanno ridotto ulteriormente il cfDNA locale. Pertanto, i cNP alleviarono meglio la risposta infiammatoria locale e non mostrarono tossicità visibile nei modelli animali.

Fig. 5 Il trattamento cNP regola meglio i livelli di cfDNA in vivo nei topi IMQ.

(UN) Immagini confocali di cfDNA nelle lesioni psoriasiche colorate con SYTOX Orange (× 1890). Le immagini ingrandite (× 3150) hanno mostrato la struttura del filo intrecciato di cfDNA (freccia). Dopo il trattamento con DNase І, la struttura simile al filo spinato di cfDNA era scomparsa, confermando che questi filamenti erano DNA extracellulare. (B) Al giorno 11, il livello locale di cfDNA era ridotto dopo 3 giorni di trattamento con polimeri cationici rispetto ai topi modello. Le immagini ingrandite mostravano una struttura più distinta di cfDNA come indicato dalle frecce. (C) Concentrazione di cfDNA nel siero dopo 5 giorni di trattamento con PDMA e cNP al giorno 13 (n = 7; significa ± SEM; ***P < 0,001 tra i due gruppi e ###P < 0,001 rispetto al gruppo normale). Il significato statistico è stato calcolato dall'ANOVA a una via con il test post hoc LSD.

Fig.6 i cNP alleviano i sintomi delle scimmie cinomolgus psoriasiche.

(UN) Schema del trattamento topico cNP di scimmie cynomolgus indotte da IMQ. Una soluzione di cNP dispersa in una base di glicerina-gelatina è stata lentamente applicata sulla pelle posteriore psoriasica delle scimmie cynomolgus fino ad assorbimento. (B) Presentazione fenotipica della pelle posteriore psoriasica della scimmia cynomolgus (n. 2) in varie occasioni. L'area del modello era nella parte superiore della schiena e l'area trattata con cNP era nella parte bassa della schiena. La pelle trattata con cNP è diventata liscia dopo la rigenerazione (freccia). Credito fotografico: Huiyi Liang, Sun Yat-sen University. (C) Eritema, desquamazione e spessore della pelle posteriore sono stati assegnati giornalmente da 0 a 4. Inoltre, viene mostrato il punteggio cumulativo (eritema più desquamazione più spessore) (n = 3; significa ± SEM; ***P < 0,001 tra due gruppi dai giorni 9 a 13 e ###P < 0,001 tra due gruppi dai giorni 1 a 13). (D) Colorazione H&E della pelle psoriasica trattata con cNP e modello di scimmie cynomolgus (× 400). L'inserto indica l'immagine ingrandita (× 2000). L'asterisco bianco indica i KC parakeratotici. (E) Colorazione immunoistochimica della pelle psoriasica trattata con cNP di una scimmia cynomolgus (n. 1). La pelle del modello e trattata con cNP sono state colorate con anticorpi anti-TNF-α, anti-IL-6, anti-IL-17 e anti-IL-23 (× 200).

La terapia topica con cNP allevia i sintomi delle scimmie cynomolgus psoriasiche

Gli esperimenti di cui sopra nei modelli murini indotti dall'IMQ hanno dimostrato che i cNP inibivano efficacemente l'infiammazione della psoriasi indotta dal DNA e alleviato i sintomi psoriasici. I cNP hanno mostrato sia un'efficacia terapeutica superiore sia una migliore biocompatibilità rispetto al PDMA nei topi IMQ, indicando una maggiore possibilità di applicazione clinica. Pertanto, per valutare ulteriormente il potenziale di traduzione dei cNP nella clinica, sia l'efficacia che la tossicità dei cNP in un animale primate sono state valutate in tre scimmie cynomolgus (Fig. 6A). Usando la stessa procedura eseguita negli esperimenti con il topo, abbiamo prima applicato quotidianamente la crema IMQ sulle scimmie cynomolgus per indurre infiammazione della pelle simile alla psoriasi. Nel trattamento clinico dei pazienti, l'IMQ topico come trattamento per il carcinoma a cellule basali provoca eritema, erosione e croste o croste nei siti di applicazione con una sensazione di bruciore, prurito e dolore, che ricorda sintomi psoriasici (26, 27). Queste reazioni cutanee locali aumentano con la frequenza di dosaggio (cioè 2 volte al giorno e 7 volte alla settimana) (28). Per indurre lesioni psoriasiche nelle scimmie cynomolgus, abbiamo aumentato il dosaggio della crema IMQ a 250 mg per applicazione e aumentato la frequenza di dosaggio a due volte al giorno. Dopo 7 giorni, si è verificato un evidente eritema sulla pelle posteriore di tutte le scimmie e i siti dell'applicazione IMQ sono diventati ruvidi e ispessiti e ricoperti di squame lamellari argentee (Fig. 6B per scimmia n. 2 e fig. S7A per scimmie n. 1 e # 3). Questi sintomi simili alla psoriasi sono diventati sempre più gravi con la scottatura e la crosta nei giorni seguenti (Fig. 6C). Le caratteristiche istologiche implicano anche che la dermatite indotta dall'IMQ nelle scimmie cinomolgee somigliava molto alle lesioni della psoriasi umana, tra cui iperproliferazione di KC nello strato VE, ipercheratosi e KC parakeratotici con ritenzione di nuclei nella SC (Fig. 6D).

Abbiamo scelto un'area della parte bassa della schiena di 2 cm per 2 cm di tre scimmie cynomolgus come area trattata con cNP e un'area della parte superiore della stessa scimmia trattata con 2 cm per 2 cm trattata con solo base di glicerina-gelatina come auto- controllo. Pertanto, c'erano tre campioni in ciascun gruppo sperimentale. Per trattare le scimmie cynomolgus indotte da IMQ, abbiamo applicato topicamente cNPs (2,5 mg / cm2) con base sulla pelle due volte al giorno. L'aspetto fenotipico della pelle è stato migliorato dopo il trattamento con cNP e la progressione della psoriasi è stata inibita da cNP con riduzione di eritema, squame e scabbiatura (Fig. 6B e Fig. S7A). Dai giorni 9 a 13, i punteggi PASI di eritema, squame e spessore nel gruppo cNP sono diminuiti in modo significativo, sebbene fossero ancora significativamente più alti del normale (Fig. 6C). Inoltre, dopo 5 giorni di trattamento con cNP, le lesioni psoriasiche sono state desquamate, rigenerate e recuperate (indicato dalla freccia in Fig. 6B). Al contrario, sulla parte superiore della pelle senza trattamento cNP, i sintomi dell'infiammazione sono diventati sempre più gravi nel tempo (Fig. 6B e Fig. S7A).

Le caratteristiche istologiche implicavano che l'epidermide nell'area trattata con cNP fosse molto più sottile di quella nell'area del modello, dimostrando che i cNP inibivano la proliferazione epidermica anormale. Inoltre, lo spessore di SC nell'area trattata con cNP era ovviamente diminuito con la scomparsa di KCs completamente differenziate, il che implica che la parakeratosi e l'ipercheratosi erano state efficacemente alleviate dopo il trattamento (Fig. 6D e Fig. S7B). In addition, immunohistochemistry showed that cNPs were effective to reduce cynomolgus monkey skin inflammation. Expression levels of proinflammatory cytokines, including TNF-α, IL-6, IL-17, and IL-23, in psoriasis-like lesions were down-regulated after 5 days of cNP treatment compared with the model (Fig. 6E for monkey #3 and fig. S8A for monkeys #1 and #2), as evidenced by the halved levels of IL-6 and IL-23 and more than 70% decrease in expression of TNF-α and IL-17; among them, the cNP group showed efficient inflammatory inhibition (fig. S8B).

Considering the preclinical safety of topical therapy, we also evaluated the toxicity of cNPs in cynomolgus monkeys. In brief, 2 cm by 2 cm normal back skin of three male cynomolgus monkeys was applied with cNPs at 2.5 mg/cm2 with a frequency of twice daily for 7 days. Blood samples were collected for biochemical analysis on days 1 and 8, and their body weight was recorded at the same time (see schedule in fig. S9A). Each animal was also used as its own control. No adverse clinical signs were detected in all animals. Regarding body weight, the recorded fluctuations without marked weight loss were in the normal range of this parameter for 4-year-old monkeys (fig. S9B). Furthermore, no pathological variations of biochemical markers were observed after cNP treatment. ALP, ALT, and AST levels were similar before and after cNP treatment, indicating no serious liver damage. Furthermore, the normal concentrations of Cr, UA, and urea in blood implied that renal functions were not impaired either (fig. S9C). Together, these results strengthen the potential of cNP as an innovative drug candidate for the topical treatment of inflammatory diseases in the clinic.

DISCUSSION

Self–NAs released from dead or dying cells are recognized as damage-associated molecular patterns (DAMPs) or pattern-associated molecular patterns and trigger activation of endosomal TLRs with the assistance of antimicrobial peptides, leading to autoimmune disorders (29, 30). Therefore, cfDNA as a therapeutic target has been considered to break the cycle of aberrant inflammation. In 2009, Lee et al. (17) first suggested that certain polycations acting as molecular scavengers interact with NAs to inhibit activation of NA-sensing TLRs. The following study further demonstrated that using these NA-binding polymers to limit NA-induced inflammation is effective in some inflammatory and autoimmune diseases (1720). Considering the toxicity of cationic materials administered systemically, a local (31) or ex vivo method (32) using immobilized polycations to remove DAMP molecules may be a better choice for easy clinical translation.

Encouraged by the high NA-binding capacity and effective inflammatory inhibition of cNPs in a previous study (19), we used cNPs to interfere with the cfDNA-LL37 complex for psoriasis treatment. In particular, the excellent NA-binding capability of cNPs by charge interactions resulted in potent destruction of the NA inflammasome by forming a more compact polymer-NA complex. We have shown that cNPs with ~1 × 104–fold stronger DNA binding affinity than LL37 efficiently compete for DNA from the DNA-LL37 complex (Fig. 1B and C). Using a known TLR agonist CpG in complex with LL37 to trigger TLR9, we demonstrated that cNPs are more effective to block the TLR9 activation of mouse primary pDCs and epidermal cells (Fig. 1, D to F), implying the potency of cNPs to reduce DNA-mediated immune stimulatory activities in psoriasis.

In general, topical delivery has significant advantages owing to the minimal first pass of metabolism, avoidance of the direct adverse blood environment, and the ability to provide prolonged and controlled drug release (33). In addition, topical therapy is noninvasive and can be self-administered, showing high patient compliance (34). Hence, topical therapy with cationic materials may be an innovative and safe strategy to treat psoriasis. In IMQ-induced mouse experiments, we confirmed that topically administered cNPs were effective in vivo as supported by skin surface morphologies, PASI scores, histology, and immunohistochemical analysis (Figs. 2 and 3). Next, we extrapolated the concept to a more clinically relevant IMQ model in cynomolgus monkeys. cNP topical treatment recovered psoriatic lesions, renewed the cynomolgus monkey skin (Fig. 6), and was well tolerated without obvious toxicity (fig. S9). Thus, we provide clear clinical evidences of cNPs as a potential treatment for autoimmune diseases.

In vivo experiments showed that topical cNPs consistently outperformed the soluble counterpart PDMA, which may be attributed to their more favorable skin retention. The parameters of cationic materials, such as surface charge, size, and lipophilicity, determine their skin deposition/permeation (3539). Generally, smaller molecules permeate through skin layers more efficiently than larger molecules (38), which could explain the skin diffusion difference of ~70-nm cNPs and soluble PDMA. Moreover, more positive charges of cNPs lead to a stronger interaction with epidermal and dermal cells, and thus, cNPs reside longer. Also, the lipophilicity of cNPs may result in a permeation retardation under the hydrophilic environment existing after the dermoepidermal junction (39). Therefore, cNPs showed higher localization in skin layers, whereas PDMA penetrated more easily into blood and accumulated more in the liver and kidneys (Fig. 4 and fig. S4). These biodistribution differences matched therapeutic performance. cNPs with more retention in skin showed better effectiveness in binding to local cfDNA (Fig. 5 and fig. S6) and thus better inhibition of the local inflammatory response. Moreover, retention of cNPs at the skin site greatly reduced systemic toxicity, unlike PDMA, which penetrated into blood circulation and caused liver and kidney lesions (Fig. 4 and fig. S5). Thus, particulate cationic materials administered topically could retain their inhibitory function for self-DNA–induced psoriasis while avoiding systemic toxicity by retention in the skin.

Motivated by the finding that self-DNA coupled with LL37 activates an abnormal immune response in psoriasis, we demonstrated that cNPs bound to proinflammatory NAs and interrupted DNA-LL37 immunocomplexes to treat experimental psoriasis. Topical administration of cNPs successfully achieved unification of efficacy and safety in both IMQ mice and cynomolgus monkeys. Because of the genetic and physiological similarities of nonhuman primates to humans, the results obtained from cynomolgus monkeys suggest a previously unidentified strategy for clinical application of cationic polymers. As an innovative trial, this study greatly increases the translational potential of cNPs as a promising treatment option for inflammatory diseases initiated by inappropriate activation of TLR pathways.

MATERIALS AND METHODS

Study design

The objective of the study was to capitalize on cfDNA scavenging by topical cNPs to inhibit psoriatic inflammatory response in murine and cynomolgus monkey models and compare the therapeutic efficacy and in vivo toxicity with the soluble counterpart PDMA. The effects of both cationic polymers on inflammation inhibition in psoriasis were evaluated by a series of experiments including mouse primary pDC and epidermal cell stimulation in vitro and phenotypical photographs, PASI scoring, histology, and cytokine expression in the psoriatic site in the animal study. In vivo behavior difference between cNPs and PDMA was further explored by mechanistic analyses of skin penetration and biodistribution, as well as the measurement of cytokine expression in the psoriatic site and cfDNA levels in circulation and skin lesions.

Throughout the study, neither animals nor samples were excluded from the study. For in vitro experiments, the stimulation of primary cells was performed in triplicate. For in vivo study, the sample size of animals was estimated after consultation with the biostatistics service at Sun Yat-sen University following the standard of the animal uses. Mouse study included 10 mice per treatment group, and cynomolgus monkey study included three monkeys. All animals were randomly allocated to the individual treatment groups, and the investigators were blinded to the group allocation when analyzing all samples. Mouse study was repeated three times to verify the reproducibility. The experimental end point for the IMQ mouse model of psoriasis was determined to be at least 13 days after the first IMQ induction, when psoriasis symptoms of model begin to recover.

Bioreagents

PBS (pH 7.4), Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640), 0.25% trypsin-EDTA, and FBS were purchased from Gibco. Calf thymus DNA was purchased from Sigma-Aldrich, and its stock solution, 1 mg/ml, was prepared in distilled water. Nonlabeled CpG 1826 and FAM-labeled CpG 1826 were purchased from GenScript China, and their stock solutions in distilled water were prepared as 1 mg/ml. Nonlabeled LL37 and FITC-labeled LL37 were purchased from Invivogen and GenScript China, respectively, and their stock solutions in distilled water were prepared as 5 mg/ml. Anti–TNF-α antibody (catalog no. ab6671), anti–IL-6 antibody (catalog no. ab9324), anti–IL-17 antibody (catalog no. ab79056), anti–IL-23 antibody (catalog no. 45420), anti–IL-22 antibody (catalog no. ab18499), anti CD68 antibody (catalog no. ab955), anti CD3 antibody (catalog no. ab16669), goat anti-mouse immunoglobulin G (IgG) H&L (horseradish peroxidase (HRP)) (catalog no. ab6789), and goat anti-rabbit IgG H&L (HRP) (catalog no. ab6702) were purchased from Abcam. Dendritic cells antibody (NB100-64608) was purchased from Novus Biologicals LLC, and goat anti-rat IgG HRP (HAF005) was purchased from R&D Systems.

MiniMACS Starting Kit (MS), autoMACS Running Buffer, anti–mPDCA-1 MicroBeads, and a mouse epidermis dissociation kit were purchased from Miltenyi Biotec. DNase І (Roche), murine Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (FLT3-L) (PeproTech), mouse TNF-α ELISA Kit (BioLegend), mouse IL-6 ELISA Kit (BioLegend), Aldara cream (5% IMQ; 3M Pharmaceuticals), Zoletil 50 (50 mg/ml; Virbac), isoflurane (RWD Life Science, China), hematoxylin (Jiangyuan, China), Eosin Y (Aladdin), 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen), Tissue-Tek optimal cutting temperature compound (O.C.T. Compound, Sakura), diaminobenzidine (DAB) plus kit (Maxin Biotechnologies), Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (PicoGreen, Invitrogen), SYTOX Orange NA stain (Invitrogen), Dynabeads SILANE Viral NA Kit (Invitrogen), TRIzol reagent (Invitrogen), RNeasy Universal Tissue Kit (Qiagen), PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser and oligo (dT) (Takara), and SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara Bio, China) were purchased from companies.

Cells

Mouse pDCs were generated by mouse bone marrow cells (BM cells) as described in literature (40). BM cells were isolated and cultured in RPMI 1640 with murine FLT3-L (100 ng/ml) and 10% heat-inactivated FBS at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2. After 4 days, 50% of the culture medium was replenished. At day 8, pDCs were isolated with anti–mPDCA-1 MicroBeads using the MiniMACS Starting Kit. Mouse primary epidermal cells were enriched from mouse epidermal tissue using the mouse epidermis dissociation kit. Briefly, epidermal cells were collected as following steps. First, mouse epidermis tissue of IMQ mouse was separated from dermis by overnight enzymatic hydrolysis at 4°C using the mouse epidermis dissociation kit. The next day, the epidermis was peeled off from the dermis using curved tweezers and transferred into the gentleMACS C Tube containing the enzyme mix. The dissociation of epidermis was carried our using the gentleMACS Dissociator. Then, the debris were removed by filtration through 200-mesh screen cloth, and the epidermal cells were enriched after centrifuge with 800g and cultured with completed DMEM in a humidified incubator at 37°C under 5% CO2.

Animals

Female BALB/c mice (8 weeks) were purchased from the laboratory animal center of Sun Yat-sen University. All mice were bred, housed, and used under specific pathogen–free conditions in the animal facility of the School of Life Science, Sun Yat-sen University. The mouse studies were performed with the approval of the Ethics Committee of the School of Life Science, Sun Yat-sen University.

Three male cynomolgus monkeys (4.4 to 4.8 years) purchased from Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd. were involved in the study. The study monkeys were housed alone in stainless steel cages and acclimated to adaptive feeding for at least 2 weeks before the first day of the study. They were body-tattooed and on-cage–identified. All monkeys were bred, housed, and used under conventional conditions in the experimental animal center in Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd. The monkey studies were performed with the approval of the Ethics Committee of the Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University.

Binding affinity between DNA and cationic materials or LL37

The binding affinity of PDMA, cNPs, and LL37 with DNA was measured by MST (Monolith NT.115, NanoTemper). First, the stock solutions, 200 μl of 100 nM FAM-labeled CpG 1826 and 30 μl of 3.2 μM cationic material or LL37 solution, were prepared, respectively. After a serial dilution of cationic materials or LL37 was prepared using PBS in tubes 1 to 16, the same volume of FAM-labeled CpG was added to each tube and mixed by pipetting. Then, a Monolith NT.115 Standard Treated Capillary was dipped into each tube from 1 to 16 and put in positions 1 to 16 of the device tray to start the measurement. The excitation color was blue with 50% excitation power. The MST data were analyzed by MO.Affinity Analysis software, and dissociation constant Kd values was calculated using a Kd model.

Competing for DNA from DNA-LL37 complex

To evaluate the competitive binding efficiency of cationic polymers with CpG from the CpG-LL37 complex, first, the FAM-labeled CpG 1826 solution and unlabeled LL37 solution were mixed for 30 min with the mass ratio of 1:5 to form the CpG-LL37 complex according to the method in literature (13). To which, different volume of the stock solutions of the cationic polymers were added. After incubation at 37°C for 30 min, the mixture was transferred to an ultrafiltration tube to be washed and concentrated by a centrifuge, and 100 μl of supernatant containing the remaining CpG-polymer complex of each dose was transferred to a 96-well plate. The fluorescence intensity of the complex at wavelength of 590 nm was measured by excitation at a wavelength of 485 nm with a multiwall plate reader (BioTek Synergy2 Gen5). Meanwhile, the standard curve of the fluorescence intensity of different concentration of FAM-labeled CpG was evaluated for converting the fluorescence intensity into CpG concentration. The NA-binding efficiency with cationic polymers was evaluated by C1/C × 100%, where C1 was the content of FAM-labeled CpG in the supernatant after centrifuge and wash and C was the total content of FAM-labeled CpG in the supernatant before centrifuge. To verify whether LL37 was still combined with CpG after the interaction of CpG and polymers, the LL37 content of intercepted polymer layer was measured by the same method, whereas unlabeled CpG 1826 and FITC-labeled LL37 were used.

Blocking DNA-LL37–activated cells with cationic polymers

For evaluation of the cationic polymers inhibiting the DNA-LL37 stimulation of mouse pDCs, 5 × 104 cells in 200 μl of complete medium per well were plated in a 48-well plate. After 12-hour culture, the medium was replaced with 200 μl of medium containing the premixed complex of CpG 1826 (10 μg/ml) and LL37 (50 μg/ml). Cationic polymers (25 μg/ml) were added at the same time. After incubation for 48 hours, the supernatants were collected, and both IL-6 and TNF-α expression levels were determined by ELISA Kit. For inhibiting the DNA stimulation of mouse primary epidermal cells, the same procedure was performed, whereas 3 × 104 primary epidermal cells per well were plated in a 48-well plate. After 48 hours, the supernatants were collected to measure TNF-α level.

Cytokine concentration analysis with enzyme-linked immunosorbent assay

The concentration of IL-6 and TNF-α in the culture supernatants of mouse pDC cells was determined with ELISA Kit using mouse IL-6 ELISA Kits and mouse TNF-α ELISA Kits. Also, the concentrations of TNF-α in the culture supernatants of mouse primary epidermal cells from psoriatic skin were determined with ELISA Kits using mouse TNF-α ELISA Kits.

Mouse model induction and treatment

BALB/c mice were under the anesthesia of 1.5 to 2% isoflurane during the psoriasis induction and topical treatment with cationic polymers. The psoriasis-like mouse model was induced by IMQ cream, called IMQ-induced mouse model (IMQ mouse model) (23). First, a 2 cm by 2 cm area of back skin of BALB/c mice was shaved. Then, this skin area of back-shaved mice received a daily topical dose of 62.5 mg of the Aldara cream containing 3.125 mg of IMQ. After 7 days, the psoriasiform skin inflammation was successfully induced with the symptoms of erythema and scale, indicating the onset of psoriasis. The IMQ mice were evenly divided into model and treatment groups randomly, with 10 mice per group, and 10 back-shaved mice without Aldara cream administration were taken as the normal group.

The mouse treatment groups contained six groups: PDMA (0.05 mg/cm2), PDMA (0.25 mg/cm2), PDMA (1.25 mg/cm2), cNP (0.05 mg/cm2), cNP (0.25 mg/cm2), and cNP (1.25 mg/cm2). The cationic polymer solution with different concentration was dispersed into glycerin-gelatin base (volume ratio 1:1) before use, containing 15% gelatin and 10% glycerin. Then, from days 8 to 12, 200 μl of glycerin-gelatin base with cationic polymer was daily topically administered onto the psoriatic skin on the back, which was then immobilized with gauze and bandages. For the model group, 200 μl of glycerin-gelatin base alone was applied on the back skin of each IMQ mouse. At day 13 (after 5 days treatment), peripheral blood sample of mice of different groups were taken from the eye socket. Back skin and major internal organs were collected after mice sacrifice under excess isoflurane.

IMQ induction and therapy of cynomolgus monkey

The psoriasis induction and cNP topical administration of cynomolgus monkeys were all conducted under the fixation of animals. The back skin of three male cynomolgus monkeys was shaved before model induction. Then, a 2 cm by 2 cm area of the lower back skin of each cynomolgus monkey was chosen as cNP-treated area, and a 2 cm by 2 cm area of the upper back of model skin served as self-control. Therefore, there were three samples in each group. For the induction of psoriatic symptom of cynomolgus monkey, the same procedure was performed, whereas 250 mg of IMQ cream was applied on each skin area twice a day.

At day 8, after the onset of psoriasis occurred, 100 μl of the glycerin-gelatin base with 10 mg of cNPs was applied on the cNP-treated area of back skin slowly until absorption twice a daily. The same volume of the glycerin-gelatin base alone was applied on model skin area as the control. After 5 days of treatment, small areas (0.5 cm by 1 cm) of cNP-treated skin and and model skin were collected, respectively, after the cynomolgus monkeys after anesthesia using intramuscular injection of Zoletil 50 (4 to 6 mg/kg). Besides, a small area (0.5 cm by 1 cm) of normal skin was also collected as control. Then, the back skin was disinfected with medical iodine and sewn up.

For evaluating in vivo toxicity of cNPs, three cynomolgus monkeys were topically applied with cNPs (2.5 mg/cm2) twice daily for 7 days. A peripheral blood sample of cynomolgus monkey was collected by venipuncture from the femoral vessel before cNP treatment (day 1) and after 7-day treatment of cNPs (day 8), and the body weight of cynomolgus monkeys was also recorded at these days. Animals were fasted for at least 8 hours before blood collection for biochemical analysis.

Scoring severity of skin inflammation

Skin inflammation severity of back skin of mice and cynomolgus monkey was daily scored using an objective scoring system developed on the basis of the clinical PASI. Erythema, scaling, and thickening were scored independently on a scale between 0 to 4: 0, none; 1, slight; 2, moderate; 3, marked; 4, very marked. The cumulative score of erythema, scaling, and thickening on a scale of 0 to 12 served as a measure of the severity of inflammation.

Photograph

For evaluating the skin inflammation, the back skin of mice from different groups was photographed by camera at day 11 when psoriatic symptoms became most marked. The model back skin and cNP-treated back skin of cynomolgus monkey were photographed by camera at day 1 (before model establishment), day 8 (after model establishment), and days 9 to 13 (during treatment).

Histological analysis and immunohistochemical staining

The skin samples of mice and cynomolgus monkey as well as the heart, liver, spleen, lung, and kidneys of mice were previously fixed in 10% formalin. After being paraffin-embedded, 2-μm paraffin sections were cut by microtome (Leica) and then stained with hematoxylin and eosin, respectively. The inflammatory cell accumulation of different skin layers skin as well as the tissue morphology of organs were evaluated by the Vectra Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer), and the thickness of different skin layers was measured using ImageJ software. Average thickness of SC, epidermis, and dermis was calculated from three randomly selected sites of the skin sections of each animal.

For immunohistochemical staining, after deparaffinization and rehydration, the slices of mice and cynomolgus monkey skin were immersed into 0.01 M sodium citrate buffer at 125°C for 30 s, followed by 10 s at 90°C for antigen recovery. Then, slices were covered with 3% hydrogen peroxide for 5 min to inactivate endogenous peroxidase. After the nonspecific binding sites were blocked by 10% goat serum in PBS, the slices were incubated with different primary antibody respectively at 4°C for 24 hours. Then, the slices were incubated with secondary HRP-conjugated antibody at 37°C for 1 hour. Sections were developed using freshly prepared DAB substrate, then counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted. The primary antibodies included anti–TNF-α antibody, anti–IL-6 antibody, anti–IL-17 antibody, anti–IL-22 antibody, anti–IL-23 antibody, anti-CD68 antibody, anti-CD3 antibody, and dendritic cell antibody. The images were captured and analyzed by the Vectra Automated Quantitative Pathology Imaging System. The positive results (brown staining) were evaluated using Nuance 3.0.2 and inForm 2.1.1 software. Sections were scanned and analyzed by Vectra Automated Quantitative Pathology Imaging System, and the positive results (brown staining) were evaluated using Nuance 3.0.2 and inForm 2.1.1 software.

Staining of extracellular DNA in skin layers

The extracellular DNA of psoriatic skin was stained according to the literature (24). At day 11 (after 3 days of treatment) and day 13 (after 5 days of treatment), the mouse back skin of various groups was collected and immersed in O.C.T. Compound, and then snap-frozen in liquid nitrogen. Six-micrometer cryosections of snap-frozen skin were prepared using a clinical cryostat (Leica) and fixed in 4% paraformaldehyde for 30 min. Slides were stained with SYTOX Orange NA stain (1:3000) for 15 min and then washed with PBS three times, and coverslips were mounted. Besides, another slide of the same embedded tissue without fixation was treated with DNase І (1 mg/ml) for 30 min before SYTOX Orange staining, which was served as control according to the literature (24). Slides were imaged using confocal microscopy (Leica SP8), and cfDNA of skin quantitative was analyzed by ImageJ software.

DNA extraction and measurement

For extraction of cfDNA in mouse serum, peripheral blood sample of mice were first centrifuged at 300g for 10 min, and then the fraction was recentrifuged at 12,000g for 10 min to remove cell debris, which was stored at −80°C before analysis. The cfDNA from 100 μl of serum was extracted with the Dynabeads SILANE Viral NA Kit, and its concentration was determined using the Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit.

Real-time PCR

At day 13, the skin of sacrificed mice was cut off and homogenized in a TRIzol reagent with a homogenizer (T 25 digital ULTRA-TURRAX, IKA), and the total RNA of the skin was extracted using the RNeasy Universal Tissue Kit. For RNA reverse transcription into complementary DNA (cDNA), 2 μg of RNA was treated with the PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser and oligo (dT) in a total volume of 20 μl. Quantitative real-time PCR of cDNA levels was performed by SYBR Green real-time in the Lightcycler (Applied Biosystems quantitative PCR), and cytokine mRNA levels were corrected with their glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA levels to normalize RNA input. The relative mRNA levels of cytokines in the normal group were set as 1. The sequences of the primers were as follows: qGADPH FP: 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′ and qGADPH AP: 5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′; qTNF-α FP: 5′- ACTCCAGGCGGTGCCTATGT-3′ and qTNF-α AP: 5′- GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3′; qIL-6 FP: 5′- CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3′ and qIL-6 AP: 5′- TGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3′; qIL-17A FP: 5′- GAAGGCCCTCAGACTACCTCAA-3′ and qIL-17A AP: 5′-TCATGTGGTGGTCCAGCTTTC-3′; qIL-17F FP: 5′- TGTCCCACGTGAATTCCAGA-3′ and qIL-17F AP: 5′- CATTGATGCAGCCTGAGTGTC-3′; qIL-22 FP: 5′- TCCAGCAGCCATACATCGTC-3′ and qIL-22 AP: 5′-CTTCCAGGGTGAAGTTGAGCA-3′; and qIL-23 FP: 5′-ACATGCACCAGCGGGACATA-3′ and qIL-23 AP: 5′-CTTTGAAGATGTCAGAGTCAAGCAG-3′.

Skin penetration and biodistribution of cationic polymers

At day 11, both normal mice and IMQ mice were topically administered with FITC-labeled PDMA or cNPs in glycerin-gelatin base. At 2, 6, and 24 hours, the back skin of the mice treated with FITC-labeled cationic polymers was cut off and embedded in O.C.T. Compound. After being snap-frozen in liquid nitrogen, the tissue was sectioned at 6 μm. After the fixation with 4% paraformaldehyde for 30 min, the slice was stained with DAPI (1:1000) for 20 min and washed with PBS three times. The penetration of cationic polymers of different skin layers was evaluated by confocal microscopy, and the fluorescence intensity of polymers in the epidermis and dermis of normal and model mice was manifested by average optical density quantified by ImageJ software. For the quantification, the cationic polymers of skin and major organs, back skin, heart, liver, spleen, lung, and kidney of IMQ mice treated with FITC-labeled polymers were collected and homogenized in PBS with a homogenizer. The fluorescence intensity of the supernatant was analyzed with a multiwall plate reader with the excitation light at a wavelength of 485 nm. The standard curve of the fluorescence intensity of different concentration of FITC-labeled polymers was evaluated and the amount of cationic polymers in different organs was calculated. The percentage of the polymer retained in different organs was evaluated by UN1/UN × 100%, where UN1 was the amount of the polymer in the organ and UN was the initial amount of the polymers applied on the skin.

Analysis of ALP, ALT, AST, Cr, urea, and UA in serum

Peripheral blood samples of mice collected at day 13 were centrifuged at 300g for 10 min, and the plasma fraction was recentrifuged at 12,000g for 10 min again to obtain cell-free serum. Then, 100 μl of the mouse serum was diluted to 300 μl with PBS. The levels of ALP, ALT, AST, Cr, urea, and UA in mouse sera were measured by the Automatic Biochemical Analyzer (FAITH-1000, Nanjing Laola Electronics Co. Ltd), and the serum levels of ALP, ALT, AST, Cr, urea, and UA in cynomolgus monkeys before cNP treatment and after cNP treatment were analyzed by Guangdong Blooming-Spring Biological Technology Development Co. Ltd.

statistica

Statistical differences of PASI sores were evaluated using one-way analysis of variance (ANOVA), followed by least significant difference (LSD) post hoc test with GraphPad Prism 7.0 software. Statistical analysis of other experimental data was performed by one-way ANOVA with LSD post hoc test using IBM SPSS Statistic 22. P < 0.05 was considered statistically significant.

Acknowledgments: We acknowledge C. Du in South China University of Technology who supplied MST. Funding: Financial support from the National Natural Science Foundation of China (grant nos. 21875290 and 51820105004), the Guangdong Innovative and Entrepreneurial Research Team Program (no. 2013S086), and the Natural Science Foundation of Guangdong Province (no. 2014A030312018) is acknowledged. Author contributions: H.L. conducted the main experiments and wrote the manuscript. Y.Y. assisted with mouse experiments. J.W. assisted with material preparation. X.G. and L.W. instructed the cynomolgus monkey study. L.L. designed and supervised all the experiments and wrote the manuscript. Y.C. designed materials, supervised, and wrote the manuscript. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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How the Top Doctors are selected

Castle Connolly Top Doctors is a healthcare research company and the official source for Top Doctors for the past 25 years. Castle Connolly’s established nomination survey, research, screening, and selection process, under the direction of an MD, involves many hundreds of thousands of physicians as well as academic medical centers, specialty hospitals and regional and community hospitals all across the nation.

The online nominations process – located at www.castleconnolly.com/nominations – is open to all licensed physicians in America who are able to nominate physicians in any medical specialty and in any part of the country, as well as indicate whether the nominated physicians is, in their opinion, among the best in their region in their medical specialty or among the best in the nation in their medical specialty. Once nominated, Castle Connolly’s physician-led team of researchers follow a rigorous screening process to select top doctors on both the national and regional levels.

Careful screening of doctors’ educational and professional experience is essential before final selection is made among those physicians most highly regarded by their peers. The result: We identify the top doctors in America and provide you, the consumer, with detailed information about their education, training and special expertise in our paperback guides, national and regional magazine “Top Doctors” features and online directories.

Doctors do not and cannot pay to be selected and profiled as Castle Connolly Top Doctors.

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Castle Connolly was acquired by Everyday Health Group (EHG), one of the world’s most prominent digital healthcare companies, in late 2018. EHG, a recognized leader in patient and provider education, attracts an engaged audience of over 53 million health consumers and over 780,000 U.S. practicing physicians and clinicians to its premier health and wellness websites. EHG combines social listening data and analytics expertise to deliver highly personalized healthcare consumer content and effective patient engagement solutions. EHG’s vision is to drive better clinical and health outcomes through decision-making informed by highly relevant data and analytics. Healthcare professionals and consumers are empowered with trusted content and services through the Everyday Health Group’s flagship brands including Everyday Health®, What to Expect®, MedPage Today®, Health eCareers®, PRIME® Education and our exclusive partnership with MayoClinic.org® and The Mayo Clinic Diet.® Everyday Health Group is a division of J2 Global Inc. (NASDAQ: JCOM), and is headquartered in New York City.

Top Doctors 2020

The 268 best  physicians in Southern Nevada, as chosen by their peers

How to use this guide

Medical specialties are listed alphabetically. Doctors are listed alphabetically beneath those specialty areas, with subspecialties below that. Note that some physicians may require referrals.

Allergy & Immunology

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4750 W. Oakey Blvd., #1A
702-724-8844 x3
Asthma & Allergy, Urticaria, Pediatric Allergy & Immunology

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Allergy & Asthma Center
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Food Allergy, Immunotherapy, Insect Allergy, Asthma

David H. Tottori, MD
Tottori Allergy & Asthma Associates
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702-240-4233 x3
Asthma & Allergy, Food Allergy, Eczema

Cardiac Electrophysiology

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Sudden Death Prevention, Radiofrequency Ablation, Atrial Fibrillation

Arjun V. Gururaj, MD
Nevada Heart & Vascular Center
3150 N. Tenaya Way, #320
702-240-6482 x2
Arrhythmias, Catheter Ablation, Heart Failure, Atrial Fibrillation

Niuton Koide, MD
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3131 La Canada St, #140
702-933-9400
Arrhythmias

Foad Moazez, MD
Nevada Cardiology Associates
3150 N. Tenaya Way, #460
702-233-1000
Arrhythmias, Pacemakers/Defibrillators

Cardiovascular Disease

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Cholesterol/Lipid Disorders, Echocardiography-Transesophageal, Preventive Cardiology, Hypertension

Richard Chen, MD
Nevada Cardiology Associates
3121 S Maryland Pkwy., #512
702-796-7150
Coronary Artery Disease, Interventional Cardiology, Angioplasty & Stent Placement, Echocardiography-Transesophageal

Berge J. Dadourian, MD
Ameli-Dadourian Heart Center
400 S Rampart Blvd., #240
702-906-1100
Peripheral Vascular Disease, Interventional Cardiology

Vanessa Gastwirth, MD
Nevada Cardiology Associates
3150 N. Tenaya Way, #460
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Samuel E. Green, MD
Nevada Cardiology Associates
3150 N. Tenaya Way, #460
702-233-1000
Nuclear Cardiology, Echocardiography-Transesophageal

Thomas L. Lambert
Cardiology Specialists of Nevada
3150 N. Tenaya Way, #135
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Interventional Cardiology, Heart Failure

Child & Adolescent Psychiatry

Debora A. Barney, MD
Center for Emotional Health
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702-257-0140 x200
Autism Spectrum Disorders, Depression, Anxiety Disorders, Mood Disorders

Child Neurology

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Neurology Center of Nevada
2380 W. Horizon Ridge Pkwy.
702-247-9994 x415
Neurophysiology, Epilepsy

Colon & Rectal Surgery

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UNLV Medicine
Department of Surgery
1707 W. Charleston Blvd., #160
702-671-5150
Minimally Invasive Surgery, Colon & Rectal Cancer, RoboticSurgery, Hemorrhoids

Leslie K. Browder, MD
Women’s Cancer Center of Nevada
3131 La Canada St, #241
702-693-6870
Microsurgery, Pelvic Floor Disorders, Diverticulitis, Crohn’s Disease

Dermatology
Alan J. Arnold, MD
Couture Dermatology & Plastic Surgery
2615 Box Canyon Drive
702-998-9001
Mohs Surgery

Miriam Bettencourt, MD
Advanced Dermatology & Cosmetic Surgery
861 Coronado Center Drive, #100
702-257-7546
Melanoma, Mohs Surgery

Michael G. Bryan, MD
Las Vegas Skin & Cancer Clinics
880 Seven Hills Drive, #260
702-588-6730
Hair & Nail Disorders, Mohs Surgery, Cosmetic Dermatology

Victoria G. Farley, MD
Vivida Dermatology
6460 Medical Center St, #350
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Cosmetic Dermatology, Dermatologic Surgery, Acne & Rosacea, Psoriasis

Douglas Fife, MD
Vivida Dermatology
6460 Medical Center St, #350
702-255-6647
Mohs Surgery

Lionel J. Handler, MD
Strimling Dermatology, Laser & Vein Institute
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Pediatric Dermatology, Laser Surgery, Cosmetic Surgery

Robert B. Strimling, MD
Strimling Dermatology, Laser & Vein Institute
10105 Banburry Cross Drive, #350
702-243-6400
Mohs Surgery, Laser Surgery, Cosmetic Dermatology, Varicose Veins

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Couture Dermatology & Plastic Surgery
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Hair Loss in Women, Acne, Facial Rejuvenation, Botox

Developmental-Behavioral Pediatrics
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UNLV Ackerman Center
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702-998-9505
Autism Spectrum Disorders, ADD/ADHD

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Neuroradiology, Interventional Radiology

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Desert Radiology
2020 Palomino Lane, #100
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Interventional Radiology, Nuclear Radiology

Ashok Gupta, MD
Desert Radiology
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Desert Radiology
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Rajashree C. Vyas, MD
Desert Radiology
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Pediatric Radiology, Musculoskeletal Imaging

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Desert Radiology
2020 Palomino Lane, #100
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Cancer Imaging, Musculoskeletal Imaging, Nuclear Medicine

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Pediatric Radiology

Endocrinology, Diabetes & Metabolism
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Desert Endocrinology
2415 W. Horizon Ridge Pkwy., #100
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Diabetes, Thyroid Disorders

Quang T. Nguyen, DO
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229 N. Pecos Road, #100
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Hypertension, Metabolic Syndrome, Nutrition & Obesity

Freddie G. Toffel, MD
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702-736-2021
Diabetes, Hormonal Disorders

Family Medicine
Kimberly Adams, MD
Total Wellness Family Medicine
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702-253-9355
AIDS/HIV, Adolescent Medicine, Sports Medicine, Chronic Illness

Herve Bezard, MD
Family Doctors of Boulder City
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702-293-0406

Michael Gunter, MD
Canyon Trails Family Practice
7455 W. Washington Ave., #445
702-804-5138
Primary Care Sports Medicine

Sungwook Kim, MD
Brighton Family Medicine
1720 W. Horizon Ridge Pkwy., #140
702-566-5445

Shari Klein, DO
8571 W. Lake Mead Blvd., #100
702-545-0283
Concierge Medicine

Darren Rahaman, MD
Nevada Health Centers
1799 Mount Mariah Drive
702-383-1961

Lara Wenner, MD
HealthCare Partners Nevada
3960 W. Craig Road, #101
702-473-8380

Gastroenterology
Tarek Ammar, MD
Comprehensive Digestive Inst of Nevada
8530 W. Sunset Road, #230
702-483-4483
Endoscopic Ultrasound, Pancreatic & Biliary Disease, Colon & Rectal Cancer, Digestive Disorders

Gregory M. Kwok, MD
Gastroenterology Associates
6950 S Cimarron Road, #200
702-796-0231
Gastrointestinal Functional Disorders, Gastroesophageal Reflux Disease (GERD)

Wai Li. Ma, MD
GI Excellence
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702-476-2822

Frank J. Nemec, MD
Gastroenterology Associates
6950 S Cimarron Road, #200
702-796-0231
Gastrointestinal Functional Disorders, Digestive Disorders

Christian Diaz. Stone, MD
Comprehensive Digestive Institute of Nevada
8530 W. Sunset Road, #230
702-483-4483
Inflammatory Bowel Disease/Crohn’s, Colitis, Digestive Disorders, Colon & Rectal Cancer

Nicholas A. Tibaldi, MD
Southwest Medical Associates
4750 W. Oakey Blvd.
702-877-8330
Hemorrhoids, Crohn’s Disease, Irritable Bowel Syndrome, Ulcerative Colitis

Geriatric Medicine
Esteban Hennings, MD
Humanitas Primary Care
3201 S Maryland Pkwy., #414
702-685-7700

Hand Surgery
Andrew J. Bronstein, MD
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Wrist Reconstruction, Elbow Surgery, Pediatric Hand Surgery, Carpal Tunnel Syndrome

David Fadell, DO
Hand Surgery Specialists of Nevada
9321 W. Sunset Road
702-645-7800
Trauma, Arthritis, Elbow Surgery, Shoulder Surgery

William T. Stewart, MD
Desert Orthopaedic Center
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Arthroscopic Surgery, Sports Medicine, Joint Reconstruction

James Vahey, MD
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Hand & Upper Extremity Surgery

Hematology
Russell Gollard, MD
OptumCare Cancer Care
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Clark S. Jean, MD
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Hematologic Malignancies, Leukemia & Lymphoma

Infectious Disease
Brian J. Lipman, MD
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Ronald A. Shockley, MD
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AIDS/HIV

Internal Medicine
Valeria Asimenios, MD
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Lawrence S. Copeland, MD
653 Town Center Drive, #101
702-243-7483
Concierge Medicine

Rama Harouni, MD
University Medical Center – Quick Care
9320 W. Sahara Ave.
702-383-3850
Preventive Medicine

Reza Mojtabavi, MD
Avencia Medical Center
3150 N. Tenaya Way, #240
702-445-7770

Mohammed Najmi, MD
Medical Group at Sun City
2440 Professional Court, #110
702-240-8155
Chronic Illness, Eating Disorders, Nutrition

Russell N. Neibaur, MD
Concierge Care Physicians
2450 W. Horizon Ridge Pkwy., #150
702-990-0622

Candice H. Tung, MD
Jerry Schwartz & Associates
7395 S Pecos Road, #102
702-737-8657
Concierge Medicine, Diabetes

John A. Varras, MD
UNLV Medicine
1707 W. Charleston Blvd., #230
702-671-5060
Weight Management, Diabetes, Heart Disease, Preventive Medicine

Raji Venkat, MD
Dignity Health Medical Group
10001 S Eastern Ave., #101
702-616-5801 x1

Sandhya Wahi Gururaj, MD
UNLV Medicine
1707 W. Charleston Blvd., #230
702-671-5060
Preventive Medicine, Hypertension

Interventional Cardiology
John B. Bedotto, MD
HealthCare Partners Sunset Cardiology
9280 W. Sunset Road, #320
702-534-5464

James A. Lally, MD
Heart Center of Nevada
700 Shadow Lane, #240
702-384-0022
Arrhythmias

Sanjay Malhotra, MD
Nevada Heart & Vascular Center
4275 Burnham Ave., #100
702-240-6482 x2

Cres P. Miranda, MD
Nevada Heart & Vascular Center
3150 N. Tenaya Way, #320
702-240-6482 x2
Coronary Angioplasty/Stents, Preventive Cardiology

Janmejay J. Patel, MD
HealthCare Partners Medical Group
3131 La Canada St, #140
702-933-9400

Maternal & Fetal Medicine
Wilson H. Huang, MD
High Risk Pregnancy Center
2845 Siena Heights Drive, #350
702-382-3200
Prematurity/Low Birth Weight Infants, Ultrasound

Brian K. Iriye, MD
High Risk Pregnancy Center
2011 Pinto Lane, #200
702-382-3200
Prenatal Diagnosis, Ultrasound, Diabetes in Pregnancy, Multiple Gestation

Patricia Pierce, MD
High Risk Pregnancy Center
2011 Pinto Lane, #200
702-382-3200
Pregnancy-High Risk, Ultrasound

Stephen M. Wold, MD
High Risk Pregnancy Center
2011 Pinto Lane, #200
702-382-3200
Pregnancy-High Risk

Medical Oncology
Fadi S. Braiteh, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3730 S Eastern Ave.
702-952-3400
Gastrointestinal Cancer, Lung Cancer, Breast Cancer, Colon & Rectal Cancer

Khoi M. Dao, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
10001 S Eastern Ave., #108
702-952-3444
Hematologic Malignancies, Colon Cancer, Lung Cancer

Oscar B. Goodman, MD/PhD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
9280 W. Sunset Road, #100
702-952-1251
Genitourinary Cancer, Prostate Cancer, Bladder Cancer

Regan Holdridge, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
1505 Wigwam Pkwy., #130
702-856-1400
Breast Cancer, Lung Cancer, Colon Cancer

H. Keshava-Prasad, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3730 S Eastern Ave.
702-952-3400
Leukemia & Lymphoma, Lung Cancer, Palliative Care

Edwin Kingsley, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3730 S Eastern Ave.
702-952-3400
Hematologic Malignancies

Anthony V. Nguyen, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
1505 Wigwam Pkwy., #130
702-856-1400
Gastrointestinal Cancer, Lung Cancer, Anemias & Red Blood Cell Disorders

Rupesh J. Parikh, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
10001 S Eastern Ave., #108
702-952-3444
Hematology

Wolfram E. Samlowski, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
9280 W. Sunset Road, #100
702-952-1251
Melanoma, Sarcoma, Kidney Cancer, Merkel Cell Carcinoma

Hamidreza Sanatinia, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
9280 W. Sunset Road, #100
702-952-1251
Hematology

James D. Sanchez, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
7445 Peak Drive
702-952-2140
Leukemia & Lymphoma, Lung Cancer

Nicholas J. Vogelzang, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3730 S Eastern Ave.
702-952-3400
Prostate Cancer, Mesothelioma, Kidney Cancer, Genitourinary Cancer

Ann M. Wierman, MD
3150 N. Tenaya Way, #200
702-749-3700
Breast Cancer, Lymphoma, Lung Cancer

Neonatal-Perinatal Medicine
Elmer S. David, MD
A Las Vegas Medical Group
4043 E. Sunset Road
702-733-0744
Neonatal Nutrition

Nephrology
Adin Boldur, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887
Hypertension, Kidney Failure

Jay K. Chu, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887

Radhika R. Janga, MD
Nevada Kidney Disease & Hypertension Centers
6970 W. Patrick Lane, #140
702-732-1586

Bindu Khanna, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887
Fluid/Electrolyte Balance, Glomerulonephritis

Lawrence M. Lehrner, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887
Kidney Disease-Chronic,

Deepak Nandikanti, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887

Chidi C. Okafor, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887
Hypertension, Dialysis Care, Dialysis-Peritoneal

Syed I. Shah, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
500 S Rancho Drive, #12
702-877-1887
Transplant Medicine-Kidney

Marwan Takieddine, MD
Nevada Kidney Disease & Hypertension Centers
2450 Fire Mesa St, #110
702-853-0090
Hypertension, Cholesterol/Lipid Disorders

Vincent Yang, MD
Kidney Specialists of Southern Nevada
7316 W. Cheyenne Ave.
702-877-1887
Diabetes, Hypertension, Kidney Disease-Chronic, Kidney Stones

Neurological Surgery
Derek A. Duke, MD
The Spine & Brain Institute
861 Coronado Center Drive, #200
702-896-0940
Brain & Spinal Surgery, Spinal Surgery

Jason E. Garber, MD
Las Vegas Neurosurgical Institute
3012 S Durango Drive
702-835-0088
Spinal Surgery, Minimally Invasive Spinal Surgery, Spinal Surgery-Complex, Peripheral Nerve Surgery

Randal Peoples, MD
Las Vegas Neurosurgery & Spine Care
8285 W. Arby Ave., #220
702-737-7070
Pediatric Neurosurgery, Pain-Back & Neck, Spinal Cord Injury

Michael E. Seiff, MD
The Spine & Brain Institute
8530 W. Sunset Road, #250
702-851-0792
Brain & Spinal Surgery, Chiari Malformations, Minimally Invasive Surgery

Neurology
Samir Bangalore, MD
Nevada Neurosciences Institute
3006 S Maryland Pkwy., #765
702-961-7310
Epilepsy

Jeffrey L. Cummings, MD
Cleveland Clinic Lou Ruvo Center for Brain Health
888 W. Bonneville Ave.

702-483-6000
Alzheimer’s Disease, Clinical Trials, Neurodegenerative Disorders

Shanker N. Dixit, MD
Neurology Center of Las Vegas
2480 Professional Court
702-405-7100
Clinical Neurophysiology, Stroke, Epilepsy/Seizure Disorders, Headache

Eric Farbman, MD
Roseman Medical Group
5380 S Rainbow Blvd., #120
702-463-4040
Parkinson’s Disease/Movement Disorders, Huntington’s Disease, Deep Brain Stimulation, Alzheimer’s Disease

Le Hua, MD
Cleveland Clinic Lou Ruvo Center for Brain Health
888 W. Bonnenville Ave.

702-483-6000
Multiple Sclerosis, Neuro-Immunology

Zoltan Mari, MD
Cleveland Clinic Lou Ruvo Center for Brain Health
888 W. Bonneville Ave.

702-483-6000
Movement Disorders, Parkinson’s Disease

Christopher Milford, MD
Silver State Neurology
2585 Montessouri St, #100
702-272-0694
Clinical Neurophysiology, Electromyography (EMG)

Marwan N. Sabbagh, MD/PhD
Cleveland Clinic Lou Ruvo Center for Brain Health
888 W. Bonneville Ave.
702-483-6000
Alzheimer’s Disease, Memory Disorders

Dylan P. Wint, MD
Cleveland Clinic Lou Ruvo Center for Brain Health
888 W. Bonneville Ave.

702-483-6000
Neurodegenerative Disorders, Neuro-Psychiatry, Cognitive Impairment-Mild, Behavioral Neurology

Nuclear Medicine
Bharat Reddy Mocherla, MD
Las Vegas Medical Research
8530 W. Sunset Road, #300
702-750-0222
PET Imaging, CT Scan

Obstetrics & Gynecology
Nadia A. Gomez, MD
Women’s Healthcare of Las Vegas
3196 S Maryland Pkwy., #209
702-944-2888
Gynecology Only, Minimally Invasive Surgery, Robotic Surgery, Tubal Ligation Reversal

John V. Martin, MD
Women’s Health Associates of Southern NV
2050 Mariner Drive, #120
702-255-2022
Pregnancy

Donna M. Miller, MD
For Women OB/GYN
861 Coronado Center Drive, #131
725-777-0414
Pregnancy-High Risk, Pap Smear Abnormalities, Menopause Problems

Edmond E. Pack, MD
Women’s Health Associates of Southern NV
2580 St. Rose Pkwy., #140
702-862-8862
Minimally Invasive Surgery, Endometriosis, Gynecologic Surgery, Robotic Surgery

Petar Planinic, MD
UNLV Medicine
Women’s Healthcare Center of Las Vegas
3196 S Maryland Pkwy., #209
702-944-2888

Tammy Reynolds, MD
Women’s Health Associates of Southern NV
2050 Mariner Drive, #120
702-255-2022

K. Warren Volker, MD/PhD
Healthcare Partners
9260 W. Sunset Road, #100
702-255-3547
Gynecology Only, Minimally Invasive Surgery, Pelvic Surgery

Ophthalmology
Mark W. Doubrava, MD
Eye Care for Nevada
The Lakes Business Park
9011 W. Sahara Ave., #101

702-794-2020
LASIK-Refractive Surgery, Cataract Surgery, Corneal Disease & Surgery, Cornea Transplant

Emily Fant, MD
Shepherd Eye Center
3575 Pecos-McLeod Interconnect
702-731-2088

Jeffrey Hart, MD
Center For Sight
5871 W. Craig Road
702-724-2020

Rodney Hollifield, MD
Retina Consultants of Nevada
653 N. Town Center Drive, #518
702-369-0200
Retina/Vitreous Surgery

Jay K. Mattheis, MD
Wellish Vision Institute
2110 E. Flamingo Road, #211
702-733-2020
Dry Eye Syndrome, LASIK-Refractive Surgery, Cataract Surgery, Glaucoma

William N. May, MD
Wellish Vision Institute
10424 S Eastern Ave., #100
702-733-2020
Cataract Surgery, Dry Eye Syndrome

Steven N. Montgomery, MD
Shepherd Eye Center
3575 Pecos-McLeod Interconnect
702-731-2088

Timothy Perozek, MD
See Right Now
653 N. Town Center Drive, #212
702-982-1360
Glaucoma, Diabetic Eye Disease/Retinopathy, Intraocular Lens Replacement

Helga F. Pizio, MD
New Eyes
2020 Wellness Way, #402
702-485-5000
Cataract Surgery, Intraocular Lens Replacement, Eyelid Surgery/Blepharoplasty, LASIK-Refractive Surgery

Grace S. Shin, MD
Ideal EyeCare
6028 S Fort Apache Road, #101
702-896-2020
Pediatric Ophthalmology, Cataract Surgery, Glaucoma, Macular Disease/Degeneration

Surjeet Singh, MD
Nevada Eye Physicians
1505 Wigwam Pkwy.
702-819-6640
Cataract Surgery, LASIK-Refractive Surgery, PRK-Refractive Surgery

Matthew Swanic, MD
Las Vegas Eye Institute
9555 S Eastern Ave., #260
702-816-2525
Cataract Surgery, Corneal Disease, Glaucoma, LASIK-Refractive Surgery

Allen Bradford Thach, MD
Retina Consultants of Nevada
653 N. Town Center Drive, #518
702-369-0200
Retina/Vitreous Surgery

Timothy H. Tweito, MD
Nevada Retina Center
6980 Smoke Ranch Road, #110
702-732-4500
Diabetic Eye Disease/Retinopathy, Retina/Vitreous Surgery, Retinal Disorders

Kent L. Wellish, MD
Wellish Vision Institute
2110 E. Flamingo Road, #211
702-733-2020
Corneal Disease & Surgery, LASIK-Refractive Surgery, Cataract Surgery, Dry Eye Syndrome

Jason Craig Wickens, MD
Retina Consultants of Nevada
653 N. Town Center Drive, #518
702-369-0200
Retina/Vitreous Surgery, Macular Degeneration, Trauma

C. Edward Yee, MD
Las Vegas Ophthalmology
2980 S Jones Blvd., #A
702-362-3937
Corneal Disease & Surgery, LASIK-Refractive Surgery, Cornea Transplant

Meher Yepremyan, MD
Retina Consultants of Nevada
653 N. Town Center Drive, #518
702-369-0200
Retinal Disorders, Retina/Vitreous Surgery

Orthopaedic Surgery
Hugh Bassewitz, MD
Desert Orthopaedic Center
2800 E. Desert Inn Road, #100
702-731-1616
Spinal Surgery, Spinal Disc Replacement, Scoliosis

Gregory T. Bigler, MD
Knee & Shoulder Institute
9499 W. Charleston Blvd., #200
702-933-9393
Shoulder & Knee Surgery, Arthroscopic Surgery, Arthritis, Sports Medicine

Andrew Cash, MD
Desert Institute of Spine Care
9339 W. Sunset Road, #100
702-630-3472
Spinal Surgery, Minimally Invasive Spinal Surgery

Robert Jeffrey Grondel, MD
Orthopaedic Institute of Henderson
10561 Jeffreys St, #230
702-565-6565
Arthroscopic Surgery-Shoulder, Sports Medicine, Cartilage Damage & Transplant

Steven R. Hoer, MD
Orthopaedic Institute of Henderson
10561 Jeffreys St, #230
702-565-6565
Joint Replacement

Erik N. Kubiak, MD
OptumCare Orthopaedics and Spine
4750 W. Oakey Blvd.
702-724-8877
Reconstructive Surgery

Michael Miao, MD
Desert Orthopaedic Center
2800 E. Desert Inn Road, #100
702-731-1616
Arthroscopic Surgery-Shoulder, Arthroscopic Surgery-Knee, Sports Medicine, Reconstructive Surgery

Jason H. Nielson, MD
Children’s Bone & Spine Surgery
1525 E. Windmill Lane, #201
702-434-6920
Pediatric Orthopaedic Surgery, Pediatric Sports Medicine, Dance Medicine, Arthroscopic Surgery-Hip

Bernard C. Ong, MD
8551 W. Lake Mead Blvd., #251
702-796-7979
Joint Replacement, Sports Medicine, Fractures, Knee Reconstruction

Deirdre D. Ryan, MD
Children’s Bone & Spine Surgery
9050 W. Cheyenne Ave., #110
702-998-5200
Neuromuscular Disorders, Trauma, Foot Deformities

Roman Sibel, MD
Orthopedic Foot & Ankle Institute
3175 St. Rose Pkwy., #320
702-997-9833
Foot & Ankle Deformities, Charcot Foot, Clubfoot, Diabetic Leg/Foot

David G. Stewart, MD
Children’s Bone & Spine Surgery
1525 E. Windmill Lane, #201
702-434-6920
Pediatric Orthopaedic Surgery, Scoliosis, Fractures-Complex & Non-Union

Michael D. Thomas, MD
Nevada Orthopedic & Spine Center
7455 W. Washington Ave., #160
702-258-3773
Pediatric Orthopaedic Surgery, Scoliosis, Spinal Deformity

Troy S. Watson, MD
Desert Orthopaedic Center
2800 E. Desert Inn Road, #100
702-731-1616
Foot & Ankle Surgery, Arthroscopic Surgery, Sports Injuries-Foot & Ankle, Dance/Ballet Injuries

Joseph Yu, MD
Total Sports Medicine & Orthopedics
10105 Banburry Cross Drive, #445
702-475-4390
Sports Medicine, Joint Replacement, Shoulder & Knee Surgery, Cartilage Damage

Otolaryngology

Christine Mirabal, MD
Ear, Nose & Throat Consultants of Nevada
3195 St. Rose Pkwy., #210
702-792-6700
Ear Disorders, Nasal & Sinus Disorders, Throat Disorders

Matthew Ng, MD
UNLV Medicine
5380 S Rainbow Blvd., #324
702-992-6828
Neuro-Otology, Skull Base Surgery, Otology, Acoustic Neuroma/Schwannoma

Sean David Palacios, MD
Nevada Ear & Sinus Institute
3692 E. Sunset Road
702-735-7668
Neuro-Otology, Hearing & Balance Disorders, Skull Base Tumors, Sinus Disorders/Surgery

Walter W. Schroeder, MD
Ear, Nose & Throat Consultants of Nevada
3195 St. Rose Pkwy., #210
702-792-6700
Head & Neck Surgery, Nasal Surgery, Throat Disorders

Robert C. Wang, MD
UNLV Medicine
3150 N. Tenaya Way, #112
702-671-6480
Head & Neck Surgery

Randall T. Weingarten, MD
Southern Nevada ENT
10410 S Eastern Ave., #110
702-617-9599
Head & Neck Surgery, Thyroid & Parathyroid Surgery, Sinus Disorders/Surgery

Larry Yu, MD
Ear, Nose & Throat Consultants of Nevada
3195 St. Rose Pkwy., #210
702-792-6700
Nasal & Sinus Disorders

Otolaryngology/Facial Plastic Surgery
Sina Nasri-Chenijani, MD
Lubritz & Nasri Physicians
3150 N. Tenaya Way, #340
702-804-4729
Head & Neck Surgery, Facial Plastic & Reconstructive Surgery, Voice Disorders, Thyroid & Parathyroid Surgery

Robert J. Troell, MD
Beauty By Design
7975 W. Sahara Ave., #104
702-242-6488
Facial Plastic Surgery, Eyelid Surgery/Blepharoplasty, Rhinoplasty, Reconstructive Plastic Surgery

Pain Medicine
Daniel L. Burkhead, MD
Innovative Pain Care Center
9920 W. Cheyenne Ave., #110
702-684-7246
Pain-Chronic, Pain-Interventional Techniques, Sciatica

Ho Viet Dzung, MD
Innovative Pain Care Center
9920 W. Cheyenne Ave., #110
702-684-7246
Pain-Back & Neck

Michael J. McKenna, MD

McKenna, Ruggeroli & Helmi
6070 S Fort Apache Road, #100
702-307-7700
Pain-Chronic, Pain-Cancer, Pain-Back, Head & Neck

Anthony Ruggeroli, MD
McKenna, Ruggeroli & Helmi
6070 S Fort Apache Road, #100
702-307-7700
Pain-Musculoskeletal, Pain-Interventional Techniques

Pediatric Cardiology
Ruben J. Acherman, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290
Neonatal Cardiology, Arrhythmias, Fetal Echocardiography

William J. Castillo, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290
Fetal Cardiology, Echocardiography

William N. Evans, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290

Alvaro Galindo, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290
Interventional Cardiology, Cardiac Catheterization

Gary A. Mayman, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290
Fetal Echocardiography

Abraham Rothman, MD
Children’s Heart Center Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #690
702-732-1290
Interventional Cardiology

Pediatric Gastroenterology
Howard I. Baron, MD
Pediatric Gastroenterology & Nutrition Associates
3196 S Maryland Pkwy., #309
702-791-0477
Inflammatory Bowel Disease, Eosinophilic Esophagitis, Gastrointestinal Motility Disorders

Elizabeth Mileti, DO
Pediatric Gastroenterology & Nutrition Associates
3196 S Maryland Pkwy., #309
702-791-0477

Rebecca L. Scherr, MD
UNLV Medicine
1524 Pinto Lane Fl 3
(709) 660-8658
Nutrition

Pediatric Hematology-Oncology
Alan Ikeda, MD
Cure 4 The Kids Foundation
1 Breakthrough Way
702-732-1493
Bone Marrow Transplant, Sickle Cell Disease, Gene Therapy, Stem Cell Transplant

Pediatric Infectious Disease
David Di John, MD
UNLV Medicine
1524 Pinto Lane Fl 3
(709) 660-8658
Vaccines, Travel Medicine

Pediatric Nephrology
Michael O. Aigbe, MD
Children’s Nephrology Clinic
7271 W. Sahara Ave., #110
702-639-1700
Kidney Disease, Kidney Failure, Hypertension

Pediatric Pulmonology
Craig T. Nakamura, MD
Children’s Lung Specialists
3006 S Maryland Pkwy., #315
702-598-4411
Asthma, Lung Disease, Sleep Disorders/Apnea, Cystic Fibrosis

David P. Parks, MD
UNLV Medicine
1524 Pinto Lane Floor 3
(709) 660-8658
Lung Disease, Cystic Fibrosis, Pneumonia

Pediatric Surgery
Nicholas F. Fiore, MD
Pediatric Surgery Associates
653 N. Town Center Drive, #412
702-233-8101

Michael Scheidler, MD
UNLV Medicine
3121 S Maryland Pkwy., #400
702-650-2500
Trauma

Pediatric Urology
Clare Close, MD
Close Pediatric Urology
2653 W. Horizon Ridge Pkwy., #100
702-220-4006
Congenital Anomalies-Genitourinary, Fetal Urology, Hypospadias, Undescended Testis

Andrew H. Hwang, MD
Las Vegas Pediatric Urology
653 N. Town Center Drive, #407
702-728-5686
Transplant-Kidney

James C. Plaire, MD
Children’s Urology Associates
6670 S Tenaya Way, #180
702-369-4999
Undescended Testis, Incontinence, Congenital Anomalies-Genitourinary

Pediatrics
James A. Bakerink, MD
Wee Care Pediatrics
4785 S Durango Drive, #101
702-889-8444
Newborn Care, Preventive Medicine, Adolescent Medicine, ADD/ADHD

Blair Duddy, MD
Southwest Medical Associates
2704 N. Tenaya Way
702-877-5199
Diabetes, Nutrition

Pamela Greenspon, MD
Desert Valley Pediatrics
10105 Banburry Cross, #370
702-260-4525
Nutrition, Newborn Care

Kami Larsen, MD
Nevada Health Centers
98 E. Lake Mead Pkwy., #103
702-868-0327

Beverly Neyland, MD
UNLV Medicine
1524 Pinto Lane Floor 3
702-944-2828

Ryan M. Nishihara, MD
Meadows Pediatrics
9030 W. Cheyenne Ave., #120
702-436-7337
Adolescent Medicine

Wesley Robertson, MD
Sunshine Valley Pediatrics
7455 W. Washington Ave., #300
702-363-3000

Laura H. Weidenfeld, MD
Sunshine Valley Pediatrics
9091 W. Post Road
702-363-3000

Physical Medicine & Rehabilitation
Bevins K. Chue, MD
Rehabilitation Specialists of Henderson
1669 W. Horizon Ridge Pkwy., #100
702-386-1041
Arthritis, Musculoskeletal Disorders, Neuromuscular Disorders

Andrew B. Kim, DO
Desert Orthopaedic Center
2800 E. Desert Inn Road, #100
702-731-4088
Musculoskeletal Injuries, Musculoskeletal Disorders, Pain Management

Nianjun Tang, MD
Centennial Medical Group
4454 N. Decatur Blvd.
702-839-1203
Pain Management

Plastic Surgery
Hayley Brown, MD
Desert Hills Plastic Surgery Center
10001 S Eastern Ave., #406
702-260-7707
Facelift, Blepharoplasty, Breast Augmentation, Breast Reduction

Arthur M. Cambeiro, MD
SurgiSpa
2370 W. Horizon Ridge Pkwy., #130
702-566-8300
Facelift, Liposuction & Body Contouring, CoolSculpting, Breast Augmentation

Michael C. Edwards, MD
Plastic Surgery Vegas
8530 W. Sunset Road, #130
702-822-2100
Breast Cosmetic & Reconstructive Surgery, Breast Augmentation, Breast Reduction, Breast Reconstruction & Augmentation

W. Tracy Hankins, MD
Hankins & Sohn Plastic Surgery Associates
60 N. Pecos Road
702-948-7595
Cosmetic Surgery-Face & Breast, Liposuction & Body Contouring

Terrence B. Higgins, MD
Plastic Surgery Vegas
8530 W. Sunset Road, #130
702-822-2100
Liposuction & Body Contouring, Cosmetic Surgery-Breast, Facial Rejuvenation, Microsurgery

Christopher Khorsandi, MD
VIP Plastic Surgery
2779 Sunridge Heights Pkwy., #100
702-608-1318
Cosmetic Surgery, Breast Augmentation, Hand Surgery

John M. Menezes, MD
UNLV Medicine
1707 W. Charleston Blvd., #190
702-671-5110
Craniofacial Surgery, Cosmetic & Reconstructive Surgery

Stephen M. Miller, MD
8435 S Eastern Ave., #100
702-369-1001
Cosmetic Surgery-Face & Breast, Liposuction & Body Contouring, Hair Restoration/Transplant

John J. Minoli, MD
Smith Plastic Surgery
7650 W. Sahara Ave.
702-838-2455
Facial Plastic Surgery, Rhinoplasty, Eyelid Surgery/Blepharoplasty, Botox

Jeffrey J. Roth, MD
Las Vegas Plastic Surgery
6140 S Fort Apache Road, #100, MS 89148
702-450-0777
Botox, Breast Augmentation, Breast Cosmetic Surgery, CoolSculpting

Lane Smith, MD
Smith Plastic Surgery
7650 W. Sahara Ave.
702-838-2455
Breast Augmentation, Facelift, Liposuction & Body Contouring, CoolSculpting

Samuel Sohn, MD
Hankins & Sohn Plastic Surgery Associates
60 N. Pecos Road
702-948-7595
Cosmetic Surgery-Breast, Body Contouring after Weight Loss, Cosmetic & Reconstructive Surgery, Botox

Psychiatry
Alison Netski, MD
6375 W. Charleston Blvd.
702-671-6475
Psychosomatic Disorders, Geriatric Psychiatry, ADD/ADHD, Psychiatry in Physical Illness

Daniel Sussman, MD
4205 Mont Blanc Way
702-493-5203
Psychoanalysis, Geriatric Psychiatry

Pulmonary Disease
John B. Collier, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3150 N. Tenaya Way, #125
702-869-0855
Critical Care, Lung Disease, Sleep Disorders/Apnea

Wael Eid, MD
United Critical Care
6040 S Fort Apache Road, #100
702-476-4900
Asthma & Emphysema, Chronic Obstructive Lung Disease (COPD), Interstitial Lung Disease, Sleep Disorders/Apnea

Nancy Holder, MD
United Critical Care
6040 S Fort Apache Road, #100
702-476-4900
Critical Care, Sleep Medicine

Joaquim Tavares, MD
United Critical Care
6040 S Fort Apache Road, #100
702-476-4900
Chronic Obstructive Lung Disease (COPD), Lung Cancer, Critical Care, Asthma

George S. Tu, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3150 N. Tenaya Way, #125
702-869-0855
Sleep Disorders/Apnea, Emphysema, Pulmonary Fibrosis

Radiation Oncology
Michael J. Anderson, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
10001 S Eastern Ave., #108
702-952-3444
Head & Neck Cancer, Prostate Cancer, Brachytherapy, Intensity Modulated Radiotherapy (IMRT)

Andrew M. Cohen, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
7445 Peak Drive
702-952-2140
Breast Cancer, Lung Cancer, Prostate Cancer, Image Guided Radiotherapy (IGRT)

Dan Lee Curtis, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
655 N. Town Center Drive
702-233-2200
Prostate Cancer, Brachytherapy, Head & Neck Cancer, Cosmetic Dermatology

Greg A. Dean, MD
Radiation Oncology Centers of Nevada
3980 S Eastern Ave.
702-463-9100

Farzaneh Farzin, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3730 S Eastern Ave.
702-952-3366
Breast Cancer, Intensity Modulated Radiotherapy (IMRT), Stereotactic Radiosurgery

Carlos Alberto. Lopez, MD
Radiation Oncology Centers of Nevada
624 S Tonopah Drive
702-463-9100
Intensity Modulated Radiotherapy (IMRT), Stereotactic Radiosurgery

Raul T. Meoz, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
9280 W. Sunset Road, #100
702-952-1251
Brachytherapy, Stereotactic Radiosurgery

Susan A. Reisinger, MD
21st Century Oncology
3006 S Maryland Pkwy., #100
702-894-5100
Breast Cancer, Stereotactic Radiosurgery, Brain Tumors, Prostate Cancer

Michael T. Sinopoli, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
7445 Peak Drive
702-952-2140
Prostate Cancer, Lung Cancer, Breast Cancer, Stereotactic Radiosurgery

Ritchie Stevens, MD
Radiation Oncology Centers of Nevada
3980 S Eastern Ave.
702-463-9100
Brachytherapy, Prostate Cancer, Gynecologic Cancers

Beau James W. Toy, MD
Radiation Oncology Centers of Nevada
624 S Tonopah Drive
702-463-9100
Stereotactic Body Radiotherapy, Image Guided Radiotherapy (IGRT)

Paul Treadwell, MD
21st Century Oncology
3006 S Maryland Pkwy., #100
702-990-4767
Pediatric Cancers, Breast Cancer, Gynecologic Cancers, Hodgkin’s Lymphoma

Reproductive Endocrinology/Infertility
Jeffrey Fisch, MD
Green Valley Fertility Partners
2510 Wigwam Pkwy., #201
702-722-2229
Infertility-IVF, Menstrual Disorders

Eva D. Littman, MD
Red Rock Fertility Center
9120 W. Russell Road, #200
702-749 4834
Infertility-IVF, Preimplantation Genetic Diagnosis, Egg & Embryo Freezing

John Phelps, MD
UNLV Medicine
3196 S Maryland Pkwy., #209

702-944-2888
Women’s Healthcare, Ob/Gyn, Infertility, Gynecologic Surgery

Bruce S. Shapiro, MD/PhD
Fertility Center of Las Vegas
8851 W. Sahara Ave., #100
702-254-1777
Infertility-IVF

Rheumatology
Neil Braunstein, MD
Southwest Medical Associates
4750 W. Oakey Blvd.
702-251-3670
Autoimmune Disease, Fibromyalgia

Michael E. Clifford, MD
7151 Cascade Valley Ct, #103
702-944-5444
Fibromyalgia, Rheumatoid Arthritis, Lupus/SLE, Osteoporosis

Ewa Olech, MD

Access Health
Rheumatology Consultants
7200 Cathedral Rock Drive, Suite 110
702-489-4838
Rheumatoid Arthritis, Lupus/SLE, Inflammatory Arthritis, Clinical Trials

Sports Medicine
Timothy James Trainor, MD
Advanced Orthopedics & Sports Medicine
7195 Advanced Way
702-740-5327
Arthroscopic Surgery, Shoulder & Knee Surgery, Shoulder Arthroscopic Surgery, Fractures

Randall E. Yee, DO
Advanced Orthopedics & Sports Medicine
7195 Advanced Way
702-740-5327
Arthroscopic Surgery, Cartilage Damage & Transplant, Knee Surgery

Surgery
James Dee. Atkinson, MD
Surgical Weight Control Center
3802 Meadows Lane
702-313-8446
Bariatric/Obesity Surgery, Laparoscopic Surgery-Advanced, Minimally Invasive Surgery

Annabel Barber, MD
UNLV Medicine
3150 N. Tenaya Way, #112
702-671-6480
Robotic Surgery, Colon & Rectal Cancer & Surgery, Gastrointestinal Surgery, Endocrine Surgery

Pankaj Bhatnagar, MD
Advanced Laparoscopic & General Surgery
6240 N. Durango Drive, #120
702-791-7855
Laparoscopic Surgery-Advanced

Peter A. Caravella, MD
Las Vegas Surgical Associates
8930 W. Sunset Road, #300
702-258-7788

Souzan El-Eid, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
9280 W. Sunset Road, #100
702-255-1133
Breast Cancer & Surgery, Cancer Surgery

Daniel Kirgan, MD
UNLV Medicine
Department of Surgery
1707 W. Charleston Blvd., #160

702-671-5150
Cancer Surgery, Breast Cancer & Surgery, Melanoma, Sarcoma

Deborah Ann Kuhls, MD
UNLV Medicine
Department of Surgery
1707 W. Charleston Blvd., #160

702-671-5150
Trauma, Critical Care

Allan David. MacIntyre, DO
Desert Surgical Associates
3131 La Canada St, #217
702-369-7152
Bariatric/Obesity Surgery, Robotic Surgery, Trauma/Critical Care, Minimally Invasive Surgery

Irwin B. Simon, MD
Vegas Valley Vein Institute
2450 W. Horizon Ridge Pkwy., #100
702-341-7608
Minimally Invasive Vascular Surgery, Vein Disorders, Varicose Veins, Hair Restoration/Transplant

Darren W. Soong, MD
Surgical Weight Control Center
3802 Meadows Lane
702-313-8446
Bariatric/Obesity Surgery, Laparoscopic Surgery-Advanced, Minimally Invasive Surgery

Charles R. St. Hill, MD
UNLV Medicine
Department of Surgery
1707 W. Charleston Blvd., #160

702-671-5150
Cancer Surgery, Gallbladder Surgery, Hernia

Francis W. Teng, MD
Advanced Surgical Care
3150 N. Tenaya Way, #508
702-838-5888
Bariatric/Obesity Surgery, Minimally Invasive Surgery, Laparoscopic Surgery, Robotic Surgery

Margaret A. Terhar, MD
Comprehensive Cancer Centers of Nevada
3006 S Maryland Pkwy., #270
702-369-6008
Breast Disease, Breast Surgery

Thoracic & Cardiac Surgery
Quynh Feikes, MD
Cardiovascular Surgery of Southern Nevada
5320 S Rainbow Blvd., #282
702-737-3808
Cardiothoracic Surgery, Endovascular Surgery, Esophageal Surgery

Juan Enrique. Martin, MD
Cardiovascular Surgery of Southern Nevada
5320 S Rainbow Blvd., #282
702-737-3808
Robotic Cardiac Surgery, Heart Valve Surgery-Aortic, Minimally Invasive Surgery

Michael G. Wood, MD
MountainView Cardiovascular & Thoracic Surgery Associates
3150 N. Tenaya Way, #260
702-962-5920
Cardiac Surgery-Adult, Heart Valve Surgery, Thoracic Aortic Surgery, Heart Valve Surgery-Mitral

Urogynecology/Female Pelvic Medicine & Reconstruct Surgery
Geoffrey C. Hsieh, MD
Women’s Cancer Center of Nevada
3131 La Canada St, #241
702-693-6870
Urogynecology, Pelvic Reconstruction, Incontinence-Urinary, Pelvic Organ Prolapse Repair

Urology
Scott Baranoff, MD
Las Vegas Urology
9053 S Pecos Road, #2900
702-735-8000
Impotence, Incontinence, Urologic Cancer, Kidney Stones

Joseph V. Candela, MD
Las Vegas Urology
7500 Smoke Ranch Road, #200
702-233-0727
Urology-Female, Urologic Cancer

Sheldon J. Freedman, MD
653 N. Town Center Drive, #308
702-732-0282
Erectile Dysfunction, Vasectomy-No Scalpel, Kidney Stones, Prostate Cancer

Vijay Goli, MD
Las Vegas Urology
7500 Smoke Ranch Road, #200
702-233-0727
Kidney Stones, Incontinence-Male & Female, Minimally Invasive Surgery, Prostate Cancer-Cryosurgery

O. Alex Lesani, MD
Las Vegas Urology
7150 W. Sunset Road, #200
702-233-0727
Reconstructive Surgery, Robotic Surgery, Urinary Reconstruction

Lawrence H. Newman, MD
Las Vegas Urology
7150 W. Sunset Road, #201
702-316-1616
Bladder Surgery, Prostate Benign Disease (BPH), Erectile Dysfunction, Kidney Stones

Sarah Ryan, MD
Urology Specialists of Nevada
2010 Wellness Way, #200
702-877-0814
Urology-Female, Incontinence

Michael P. Verni, MD
Urology Center
653 N. Town Center Drive, #302
702-212-3428
Pediatric Urology, Endourology

Jason Zommick, MD
Urology Specialists of Nevada
58 N. Pecos Road
702-877-0814
Prostate Benign Disease (BPH), Vasectomy & Vasectomy Reversal

Vascular & Interventional Radiology
Steven H. Davis, MD
Red Rock Radiology
7130 Smoke Ranch Road, #101
702-304-8135
Angioplasty & Stent Placement, Chemoembolization & Tumor Ablation, Radiofrequency Tumor Ablation

Aaron Peterson, MD
Red Rock Radiology
7130 Smoke Ranch Road, #101
702-304-8135

Vascular Surgery
Earl Cottrell, MD
General Vascular Specialists
7200 W. Cathedral Rock Drive, #130
702-228-8600
Endovascular Surgery, Varicose Veins

Bruce Hirschfeld, MD
General Vascular Specialists
7200 W. Cathedral Rock Drive, #130
702-228-8600
Endovascular Surgery, Varicose Veins

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Risultati delle operazioni


(Tables present dollars in millions, except per-share data)
General
Management's discussion and analysis of results of operations and financial
condition is intended to assist the reader in understanding and assessing
significant changes and trends related to the results of operations and
financial position of our consolidated company. This discussion and analysis
should be read in conjunction with the consolidated condensed financial
statements and accompanying footnotes in Item 1 of Part I of this Quarterly
Report on Form 10-Q. Certain statements in this Item 2 of Part I of this
Quarterly Report on Form 10-Q constitute forward-looking statements. Various
risks and uncertainties, including those discussed in "Forward-Looking
Statements" and "Risk Factors" in Part II, Item 1A of this Quarterly Report on
Form 10-Q and Item 1A, "Risk Factors," of Part I of our Annual Report on   Form
10-K   for the year ended December 31, 2019, may cause our actual results,
financial position, and cash generated from operations to differ materially from
these forward-looking statements.
Executive Overview
This section provides an overview of our financial results, recent product and
late-stage pipeline developments, and other matters affecting our company and
the pharmaceutical industry. Earnings per share (EPS) data are presented on a
diluted basis.
COVID-19
In response to the COVID-19 pandemic, we have been focused on the
following: maintaining a reliable supply of our medicines; reducing the strain
on the medical system; developing potential treatments for the virus; keeping
our employees safe; supporting our communities; and affordability of and access
to our medicines, particularly insulin.
Our consolidated operating results during the six months ended June 30, 2020
were negatively impacted by the COVID-19 pandemic due to delayed new patient
prescription trends. The COVID-19 pandemic could continue to have a negative
impact on our business in the future depending upon the duration and depth of
the effects of the pandemic crisis. We have experienced negative impacts due to
the COVID-19 pandemic including decreases in new prescriptions as a result of
fewer patient visits to physician's offices to begin or change treatment and
changes in payer segment mix and the use of patient affordability programs in
the United States (U.S.) due to rising unemployment. Additionally, we may
experience decreased demand as a result of temporarily halting in-person
interactions by our employees with healthcare providers and potential additional
pricing pressures resulting from the fiscal strain on government-funded
healthcare systems around the world.
We remain committed to discovering and developing new treatments for the
patients we serve. At the beginning of the pandemic we paused new clinical trial
starts and enrollment in new trials in order to reduce the strain on the medical
system, and in recent weeks we have resumed this activity in the majority of our
clinical trials. With the exception of mirikizumab for Crohn's disease and
ulcerative colitis, which we expect will be delayed due to a suspension in
clinical trial enrollment, the trials for products in our late-stage pipeline
are continuing. However, delays in the timing of our clinical trials, or in
regulatory reviews, could adversely affect our ability to commercialize some
assets in our product pipeline if the current pandemic crisis continues for a
protracted period.
Our ability to continue to operate without any significant negative impacts will
in part depend on our ability to protect our employees and our supply chain. We
have taken steps to protect our employees world-wide, with particular measures
in place for those working in our manufacturing sites and distribution
facilities. For the six months ended June 30, 2020, we were able to largely
maintain our normal operations. However, uncertainty resulting from the COVID-19
pandemic could have an adverse impact on our manufacturing operations, supply
chain and distribution systems, which could impact our ability to produce and
distribute our products and the ability of third parties on which we rely to
fulfill their obligations to us, and could increase our expenses. In addition,
we are resuming in-person promotional activities when determined safe to do so.
Although the pandemic has had an impact our operations and the demand for our
products, it has not negatively impacted our liquidity position. We expect to
continue to generate cash flows to meet our short-term liquidity needs and to
have access to liquidity via the short-term and long-term debt markets. We have
also not observed any material impairments of our assets or a significant change
in the fair value of assets due to the COVID-19 pandemic.
                                       36
--------------------------------------------------------------------------------

The degree to which the COVID-19 pandemic will continue to impact our future
business operations, financial results and liquidity will depend on future
developments, is highly uncertain, and cannot be predicted due to, among other
things, the duration and spread of the outbreak, its severity, the actions to
contain the virus or treat its impact, and how quickly and to what extent normal
economic and operating conditions resume. Should the COVID-19 pandemic and any
associated recession or depression continue for a prolonged period, our results
of operations, financial condition, liquidity, and cash flows could be
materially impacted by lower revenues and profitability and a lower likelihood
of effectively and efficiently developing and launching new medicines. See "Risk
Factors" in Part II, Item 1A of this Quarterly Report on Form 10-Q for
additional information on risk factors that could impact our results.
Elanco Animal Health (Elanco) Disposition
On March 11, 2019, we completed the disposition of our remaining 80.2 percent
ownership of Elanco common stock through a tax-free exchange offer. As a result,
we recognized a gain on the disposition of approximately $3.7 billion in the
first quarter of 2019 and now operate as a single segment. See Note 5 to the
consolidated condensed financial statements for further discussion.
Financial Results
The following table summarizes our key operating results:
                                         Three Months Ended                                                                       Six Months Ended
                                              June 30,                                                                                June 30,
                                       2020               2019            Percent Change             2020                   2019                Percent Change
Revenue                            $ 5,499.4$ 5,636.7                 (2)              $ 11,359.2$       10,728.9                  6
Gross margin                         4,277.4            4,511.8                 (5)                 8,922.1                   8,465.3                  5
Gross margin as a percent of
revenue                                 77.8  %            80.0  %                                     78.5  %                   78.9  %
Operating expenses                 $ 2,838.8$ 2,988.5                 (5)              $  5,780.5$        5,736.1                  1
Acquired in-process research and
development (IPR&D)                    241.8               25.0                 NM                    294.1                     161.9                 

82

Asset impairment, restructuring,
and other special charges                  -                  -                  -                     59.9                     423.9                

(86)

Net income from continuing
operations                           1,412.0            1,327.2                  6                  2,868.5                   1,888.3                 52

Net income                           1,412.0            1,327.2                  6                  2,868.5                   5,568.8                (48)
EPS from continuing operations          1.55               1.44                  8                     3.15                      1.98                 59

EPS                                     1.55               1.44                  8                     3.15                      5.84                (46)


NM - not meaningful
Revenue decreased for the three months ended June 30, 2020 driven by lower
realized prices, partially offset by increased volume. We estimate that the
COVID-19 pandemic negatively impacted revenue for the three months ended June
30, 2020 by approximately $250 million of decreased customer buying that largely
offset product stocking that occurred in the first quarter of 2020 and
approximately $250 million resulting from delayed new patient prescription
trends. Revenue increased for the six months ended June 30, 2020 driven by
increased volume, partially offset by lower realized prices. We estimate that
the COVID-19 pandemic negatively impacted revenue for the six months ended June
30, 2020 by approximately $250 million due to delayed new patient prescription
trends, while product stocking in the first quarter of 2020 was largely offset
by decreased customer buying in the second quarter of 2020. Operating expenses
decreased for the three months ended June 30, 2020, primarily due to lower
marketing expenses. Operating expenses increased for the six months ended
June 30, 2020, reflecting higher development expenses for late-stage assets,
partially offset by lower marketing expenses. The increase in net income and EPS
for the three months ended June 30, 2020 was primarily driven by higher other
income primarily due to favorable mark-to-market adjustments on investment
securities, partially offset by lower gross margin and higher acquired IPR&D.
The decrease in net income and EPS for the six months ended June 30, 2020 was
primarily driven by approximately $3.7 billion gain recognized on the
disposition of Elanco in the first quarter of 2019, partially offset by higher
other income primarily due to favorable mark-to-market adjustments on investment
securities and higher gross margin.
                                       37
--------------------------------------------------------------------------------

The following highlighted items also affect comparisons of our financial results
for the three and six months ended June 30, 2020 and 2019:
2020
Acquired IPR&D (Note 3 to the consolidated condensed financial statements)
•We recognized acquired IPR&D charges of $241.8 million and $294.1 million for
the three and six months ended June 30, 2020, respectively. The charges for the
three months ended June 30, 2020 were related to both the acquisition of a
pre-clinical stage company as well as collaborations with AbCellera Biologics
Inc. (AbCellera), Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. (Junshi Biosciences),
and Evox Therapeutics Ltd. The charges for the six months ended June 30, 2020
also included a charge related to the collaboration with Sitryx Therapeutics
Limited (Sitryx).
Asset Impairment, Restructuring, and Other Special Charges (Note 6 to the
consolidated condensed financial statements)
•We recognized charges of $59.9 million for the six months ended June 30, 2020
primarily related to acquisition and integration costs as part of the closing of
the acquisition of Dermira, Inc. (Dermira).
2019
Acquired IPR&D (Note 3 to the consolidated condensed financial statements)
•We recognized acquired IPR&D charges of $25.0 million and $161.9 million for
the three and six months ended June 30, 2019, respectively. The charge for the
three months ended June 30, 2019 was related to the collaboration with Avidity
Biosciences, Inc. (Avidity). The charges for the six months ended June 30, 2019
also included charges related to collaborations with AC Immune SA (AC Immune)
and ImmuNext, Inc. (ImmuNext).
Asset Impairment, Restructuring, and Other Special Charges (Note 6 to the
consolidated condensed financial statements)
•We recognized charges of $423.9 million for the six months ended June 30, 2019
primarily associated with the accelerated vesting of Loxo Oncology, Inc. (Loxo)
employee equity awards as a result of the closing of the acquisition of Loxo.
Net Income from Discontinued Operations (Note 5 to the consolidated condensed
financial statements)
•We recognized a gain related to the disposition of Elanco of approximately $3.7
billion for the six months ended June 30, 2019.
Late-Stage Pipeline
Our long-term success depends to a great extent on our ability to continue to
discover and develop innovative pharmaceutical products and acquire or
collaborate on molecules currently in development by other biotechnology or
pharmaceutical companies. We have approximately 40 potential new drugs in human
testing or under regulatory review and a larger number of projects in
preclinical research.
The following new molecular entities (NMEs) and diagnostic agent have been
approved by regulatory authorities in at least one of the major geographies for
use in the conditions described. The first quarter in which the NMEs and
diagnostic agent initially were approved in any major geography for any
indication is shown in parentheses:
Flortaucipir** (Tauvid™) (Q2 2020)-a positron emission tomography (PET) tracer
intended to image tau (or neurofibrillary) tangles in the brain, which are an
indicator of Alzheimer's disease.
Galcanezumab* (Emgality®) (Q3 2018)-a once-monthly subcutaneously injected
calcitonin gene-related peptide (CGRP) antibody for the treatment of migraine
prevention and the treatment of episodic cluster headache. Refer to Note 10 to
the consolidated condensed financial statements for discussion of the legal
proceedings involving Teva Pharmaceuticals International GMBH and Teva
Pharmaceuticals USA, Inc.
Lasmiditan (Reyvow®) (Q4 2019)-an oral 5-HT1F agonist for the acute treatment of
migraine.
Nasal glucagon* (Baqsimi®) (Q3 2019)-a glucagon nasal powder formulation for the
treatment of severe hypoglycemia in patients with diabetes ages four years and
above.
                                       38
--------------------------------------------------------------------------------

Selpercatinib (Retevmo™) (Q2 2020)-an oral drug for the treatment of patients
with cancers that harbor abnormalities in the rearranged during transfection
(RET) kinase, specifically thyroid cancer and lung cancer.
Ultra-rapid Lispro* (Lyumjev™) (Q1 2020)-an ultra-rapid insulin for the
treatment of type 1 and type 2 diabetes.
The following NME has been submitted for regulatory review in at least one of
the major geographies for potential use in the conditions described. The first
quarter in which the NME initially was submitted in any major geography for any
indication is shown in parentheses:
Tanezumab* (Q4 2019)-an anti-nerve growth factor monoclonal antibody for the
treatment of osteoarthritis pain (in collaboration with Pfizer Inc. (Pfizer)).
The following NMEs are currently in Phase III clinical trial testing for
potential use in the conditions described below but have not yet been submitted
for regulatory approval for any indication. The first quarter in which each NME
initially entered Phase III or was acquired for any indication is shown in
parentheses:
Lebrikizumab* (acquired in Q1 2020)-a monoclonal antibody designed for the
treatment of moderate-to-severe atopic dermatitis (in collaboration with
Almirall, S.A. in Europe).
Mirikizumab* (Q2 2018)-a monoclonal antibody designed for the treatment of
autoimmune diseases.
Solanezumab* (Q2 2009)-an anti-amyloid beta monoclonal antibody for the
treatment of preclinical Alzheimer's disease.
Tirzepatide* (Q4 2018)-a long-acting, combination therapy of glucose-dependent
insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide 1 for the treatment
of type 2 diabetes and obesity.
* Biologic molecule subject to the U.S. Biologics Price Competition and
Innovation Act
** Diagnostic agent
The following table reflects the status of the recently approved products, NMEs,
and diagnostic agent set forth above, as well as certain other developments to
our late-stage pipeline since January 1, 2020:
Compound           Indication              U.S.         Europe        Japan       Developments
Endocrinology
                                                                                                                     Approved in
                                                                                                                     Japan in
                                                                                                                     the first
                                                                                                                     quarter of
Baqsimi            Severe hypoglycemia              Launched                                   Approved              2020.
                                                                                                                     Launched in
                                                                                                                     Europe in
                                                                                                                     the second
                                                                                                                     quarter of
                                                                                                                     2020.
                   Type 2 diabetes                       Phase III                                                               Phase III trials
                                                                                                                                 are ongoing.
Tirzepatide                                                                                                                                        Phase III
                                           Obesity                               Phase III                                                         trials are
                                                                                                                                                   ongoing.
                                                                                                                                 Approved in
                                                                                                                                 Europe and Japan
                                                                                                                                 in the first
                                                                                                                                 quarter of 2020.
                                                                                                                                 Approved in the
                                                                                                                                 U.S. in the
Lyumjev            Type 1 and 2 diabetes                  Launched                                                               second quarter of
                                                                                                                                 2020. Launched in
                                                                                                                                 Japan in the
                                                                                                                                 second quarter of
                                                                                                                                 2020. Launched in
                                                                                                                                 the U.S. and
                                                                                                                                 Europe in July
                                                                                                                                 2020.
Immunology
                                                                                                                                 Acquired in the
                                                                                                                                 Dermira
                                                                                                                                 acquisition in
                                                                                                                                 February 2020.
                                                                                                                                 Granted Fast
                                                                                                                                 Track
Lebrikizumab       Atopic dermatitis                     Phase III                                                               Designation(1) by
                                                                                                                                 the U.S. Food and
                                                                                                                                 Drug
                                                                                                                                 Administration
                                                                                                                                 (FDA). Phase III
                                                                                                                                 trials are
                                                                                                                                 ongoing.


                                       39
--------------------------------------------------------------------------------

Compound           Indication            U.S.                   Europe             Japan                   Developments
                                                                                                                                                                     Phase III
                   Crohn's Disease                                   Phase III                                                                                       trials are
                                                                                                                                                                     ongoing.
                                                                                                                                                                                    In July 2020,
                                                                                                                                                                                    announced
                                                                                                                                                                                    Phase III
Mirikizumab                              Psoriasis                                                  Phase III                                                                       trials met the
                                                                                                                                                                                    primary and
                                                                                                                                                                                    all key
                                                                                                                                                                                    secondary
                                                                                                                                                                                    endpoints.
                                                                                                                                                                                    Phase III
                                         Ulcerative colitis                                         Phase III                                                                       trials are
                                                                                                                                                                                    ongoing.
Neuroscience
                                                                                                           European Medicines Agency did not
                   Cluster headache             Launched           Not approved     Not pursuing approval  approve in the second quarter of 2020.
                                                                                                           We do not plan to pursue approval in
                                                                                                           Europe.
                                                                                                                                                                     Submitted to
Emgality                                                                                                                                                             Japanese
                                                                                                                                                                     regulatory
                                         Migraine prevention                     Launched                                                              Submitted     authorities in
                                                                                                                                                                     the first
                                                                                                                                                                     quarter of
                                                                                                                                                                     2020.
                                                                                                                                                   Approved in the
Tauvid             Alzheimer's disease          Approved                  Not pursuing approval                                                    U.S. in the
                   diagnostic                                                                                                                      second quarter of
                                                                                                                                                   2020.
                                                                                                                                                   Received Schedule
                                                                                                                                                   V classification
                                                                                                                                                   from the Drug
Reyvow             Acute treatment of           Launched                        Phase III                                                          Enforcement
                   migraine                                                                                                                        Agency and
                                                                                                                                                   launched in the
                                                                                                                                                   U.S. in the first
                                                                                                                                                   quarter of 2020.
                                                                                                                                                                     Announced in
                                                                                                                                                                     the first
                                                                                                                                                                     quarter of
                                                                                                                                                                     2020 that a
                                                                                                                                                                     Phase III
                                                                                                                                                                     trial for
                                                                                                                                                                     people with
                                                                                                                                                                     dominantly
                                                                                                                                                                     inherited
                                                                                                                                                                     Alzheimer's
                                                                                                                                                                     disease (DIAD)
Solanezumab        Preclinical                                       Phase III                                                                                       did not meet
                   Alzheimer's disease                                                                                                                               the primary
                                                                                                                                                                     endpoint. We
                                                                                                                                                                     do not plan to
                                                                                                                                                                     pursue
                                                                                                                                                                     submission for
                                                                                                                                                                     DIAD. Phase
                                                                                                                                                                     III trial is
                                                                                                                                                                     ongoing for
                                                                                                                                                                     Anti-Amyloid
                                                                                                                                                                     Treatment in
                                                                                                                                                                     Asymptomatic
                                                                                                                                                                     Alzheimer's.
                                                                                                                                                   In partnership
                                                                                                                                                   with Pfizer, we
                                                                                                                                                   submitted to the
                                                                                                                                                   FDA in the fourth
                                                                                                                                                   quarter of 2019
                   Osteoarthritis pain                   Submitted                                                        Phase III                and submitted in
                                                                                                                                                   Europe in the
Tanezumab                                                                                                                                          first quarter of
                                                                                                                                                   2020. We intend
                                                                                                                                                   to pursue
                                                                                                                                                   submission in
                                                                                                                                                   Japan in 2020.
                                                                                                                                                                                    Phase III
                                         Cancer pain                                                Phase III                                                                       trial is
                                                                                                                                                                                    ongoing.
Oncology
                   Thyroid cancer               Launched            Submitted             Phase III        Granted accelerated approval(2) by the
Retevmo                                                                                                    FDA based on Phase II data and launched
                                         Lung cancer                 Launched             Submitted        in the U.S. in the second quarter of        Phase III
                                                                                                           2020. Phase III trials are ongoing.


(1) The Fast Track Designation is designed to expedite the development and
review of new therapies to treat serious conditions and address unmet medical
needs.
(2) Continued approval may be contingent on verification and description of
clinical benefit in confirmatory Phase III trials.
Other Matters
Patent Matters
We depend on patents or other forms of intellectual property protection for most
of our revenue, cash flows, and earnings.
Our formulation patents for Forteo® expired in December 2018, and our use
patents expired in August 2019 in major European markets and the U.S. Both the
formulation patent and the use patent expired in August 2019 in Japan. We expect
further volume decline as a result of the entry of generic and biosimilar
competition following the loss of patent exclusivity in these markets. In the
aggregate, we expect that the decline in revenue will have a material adverse
effect on our consolidated results of operations and cash flows.
                                       40
--------------------------------------------------------------------------------

The Alimta® vitamin regimen patents, which we expect to provide us with patent
protection for Alimta through June 2021 in Japan and major European countries,
and through May 2022 in the U.S., have been challenged in each of these
jurisdictions. In the U.S., most challenges have been finally resolved in our
favor and two remain in active litigation. We and Eagle Pharmaceuticals, Inc.
(Eagle) reached an agreement in December 2019 to settle all pending litigation,
allowing Eagle a limited initial entry into the market with its product starting
February 2022 (up to an approximate three-week supply) and subsequent unlimited
entry starting April 2022. An unfavorable outcome to patent challenges in the
U.S. could have a material adverse impact on our future consolidated results of
operations, liquidity, and financial position. We are aware that several
companies have received approval to market generic versions of pemetrexed in
major European markets (including generics currently on the market at risk in
France and the Netherlands) and that additional generic competitors may choose
to launch at risk. Following a final decision in the Supreme Court of Germany in
July 2020 overturning the lower court and upholding the validity of our Alimta
patent, several generics who were on the market at risk in Germany left. We have
removed the remaining generics from the market in Germany by obtaining
preliminary injunctions in our favor. Although we will continue to seek to
remove any such products in other European countries, generic product entry is
resulting in some loss in revenue in these jurisdictions. Our vitamin regimen
patents have also been challenged in other smaller European jurisdictions. We
expect that further entry of generic competition for Alimta following the loss
of effective patent protection will cause a rapid and severe decline in future
revenue for the product. See Note 10 to the consolidated condensed financial
statements for a more detailed account of the legal proceedings currently
pending in the U.S., Europe, and Japan regarding our Alimta patents.
The compound patent for Humalog® (insulin lispro) has expired in major markets.
Global regulators have different legal pathways to approve similar versions of
insulin lispro. A competitor launched a similar version of insulin lispro in
certain European markets in 2017 and in the U.S. in the second quarter of 2018.
While it is difficult to estimate the severity of the impact of insulin lispro
products entering the market, we do not expect and have not experienced a rapid
and severe decline in revenue; however, we expect additional pricing pressure
and some loss of market share that would continue over time.
Our compound patent protection for Cymbalta expired in Japan in January 2020. We
expect generics to enter the market in mid 2021. We expect that the entry of
generic competition will cause a rapid and severe decline in revenue and that
the decline in revenue will have a material adverse effect on our consolidated
results of operations and cash flows.
Currency Exchange Rates
As a global company with substantial operations outside the U.S., we face
foreign currency risk exposure from fluctuating currency exchange rates,
primarily the U.S. dollar against the euro and Japanese yen. While we manage a
portion of these exposures through hedging and other risk management techniques,
significant fluctuations in currency rates can have a substantial impact, either
positive or negative, on our revenue, cost of sales, and operating expenses.
While there is uncertainty in the future movements in foreign exchange rates,
fluctuations in these rates could negatively impact our future consolidated
results of operations and cash flows.
Trends Affecting Pharmaceutical Pricing, Reimbursement, and Access
U.S.
In the U.S., public concern over access to and affordability of pharmaceuticals
continues to drive the regulatory and legislative debate. These policy and
political issues increase the risk that taxes, fees, rebates, or other cost
control measures may be enacted to manage federal and state budgets. Key health
policy initiatives affecting biopharmaceuticals include:
•the Coronavirus Aid, Relief and Economic Security (CARES) Act and subsequent
stimulus bills that focus on ensuring availability and access to lifesaving
drugs during a public health crisis,
•foreign reference pricing in Medicare and private insurance,
•modifications to Medicare Parts B and D,
•provisions that would allow the Department of Health and Human Services to
negotiate prices for biologics and drugs in Medicare,
•a reduction in biologic data exclusivity,
•proposals related to Medicaid prescription drug coverage and manufacturer drug
rebates,
•proposals that would require biopharmaceutical manufacturers to disclose
proprietary drug pricing information, and
                                       41
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• proposte a livello statale relative ai prezzi dei farmaci da prescrizione e alla riduzione dei costi
di prodotti farmaceutici acquistati dai programmi sanitari del governo.


On July 24, U.S. President Donald Trump signed four Executive Orders related to
the 340B Prescription Drug Program, rebate reform in Medicare Part D, drug
importation including insulin, and foreign reference pricing. We are currently
reviewing those Executive Orders which have been issued, the impact of which is
uncertain at this time.

California and several other states have enacted legislation related to
prescription drug pricing transparency and it is unclear the effect this
legislation will have on our business. Several states passed importation
legislation, including Colorado, Florida, Maine, and Vermont. Specifically, the
state of Florida is working with the Administration to implement an importation
program from Canada as early as 2020. We are currently reviewing this state
legislation, as well as corresponding proposed federal rulemaking and guidance
published by the Department of Health and Human Services and the FDA, the impact
of which is uncertain at this time. Minnesota recently passed legislation
requiring the establishment of two insulin patient assistance programs,
effective July 1, 2020, the impact of which is uncertain at this time.
In the private sector, consolidation and integration among healthcare providers
is also a major factor in the competitive marketplace for
pharmaceuticals. Health plans, pharmacy benefit managers, wholesalers, and other
supply chain stakeholders have been consolidating into fewer, larger entities,
increasingly through vertical integration, thus enhancing their purchasing
strength and importance. Payers typically maintain formularies which specify
coverage (the conditions under which drugs are included on a plan's formulary)
and reimbursement (the associated out-of-pocket cost to the consumer). Formulary
placement can lead to reduced usage of a drug for the relevant patient
population due to coverage restrictions, such as prior authorizations and
formulary exclusions, or due to reimbursement limitations that result in higher
consumer out-of-pocket cost, such as non-preferred co-pay tiers, increased
co-insurance levels and higher deductibles. Consequently, pharmaceutical
companies compete for formulary placement not only on the basis of product
attributes such as greater efficacy, fewer side effects, or greater patient ease
of use, but also by providing rebates. Value-based agreements are another tool
which may be utilized between payers and pharmaceutical companies as formulary
placement and pricing are negotiated. Price is an increasingly important factor
in formulary decisions, particularly in treatment areas in which the payer has
taken the position that multiple branded products are therapeutically
comparable. These downward pricing pressures could continue to negatively affect
future consolidated results of operations. In addition to formulary placement,
changes in insurance designs continue to drive greater consumer cost sharing
through high deductible plans and higher co-insurance or co-pays (including
co-pay accumulator and maximizer programs). We continue to invest in patient
affordability solutions (resulting in lower revenue) in an effort to assist
patients in affording their medicines.
The main coverage expansion provisions of the Affordable Care Act (ACA) are
currently in effect through both state-based exchanges and the expansion of
Medicaid. A trend has been the prevalence of benefit designs containing high
out-of-pocket costs for patients, particularly for pharmaceuticals. In addition
to the coverage expansions, many employers in the commercial market continue to
evaluate strategies such as private exchanges and wider use of consumer-driven
health plans to reduce their healthcare liabilities over time. Federal
legislation, litigation, or administrative actions to repeal or modify some or
all of the provisions of the ACA could have a material adverse effect on our
consolidated results of operations and cash flows. At the same time, the broader
paradigm shift towards performance-based reimbursement and the launch of several
value-based purchasing initiatives have placed demands on the pharmaceutical
industry to offer products with proven real-world outcomes data and a favorable
economic profile.
International
International operations also are generally subject to extensive price and
market regulations. Cost-containment measures exist in a number of countries,
including additional price controls and mechanisms to limit reimbursement for
our products. Such policies are expected to increase in impact and reach, given
the pressures on national and regional health care budgets that come from a
growing, aging population and ongoing economic challenges. As additional reforms
are finalized, we will assess their impact on future revenues. In addition,
governments in many emerging markets are becoming increasingly active in
expanding health care system offerings. Given the budget challenges of
increasing health care coverage for citizens, policies may be proposed that
promote generics and biosimilars only and reduce current and future access to
branded human pharmaceutical products.
Tax Matters
We are subject to income taxes and various other taxes in the U.S. and in many
foreign jurisdictions; therefore, changes in both domestic and international tax
laws or regulations could adversely affect our effective tax rate, results of
operations, and cash flows. Countries around the world, including the U.S.,
actively consider and enact
                                       42
--------------------------------------------------------------------------------

tax law changes. Further, actions taken with respect to tax-related matters by
associations such as the Organisation for Economic Co-operation and Development
and the European Commission could influence tax policy in countries in which we
operate. Modifications to U.S. and foreign tax laws or regulations are
frequently enacted and could result in material impacts to our results of
operations and financial position.
Acquisitions
We strategically invest in external research and technologies that we believe to
complement and strengthen our own efforts. These investments can take many
forms, including licensing arrangements, collaborations, and acquisitions. We
view our business development activity as an important way to achieve our
strategies, as we seek to bolster our pipeline and enhance shareholder value. We
continue to evaluate business development transactions that have the potential
to strengthen our business.
In 2019, we acquired all shares of Loxo for a purchase price of $6.92 billion,
net of cash acquired. Under the terms of the agreement, we acquired a pipeline
of investigational medicines, including selpercatinib (Retevmo), an oral RET
inhibitor, and LOXO-305, an oral BTK inhibitor. In the second quarter of 2020,
the FDA approved selpercatinib (Retevmo) under its Accelerated Approval
regulations and continued approval may be contingent upon verification and
description of clinical benefit in confirmatory trials.
In February 2020, we acquired all shares of Dermira for a purchase price of
$849.3 million, net of cash acquired. Under terms of the agreement, we acquired
lebrikizumab, a novel, investigational, monoclonal antibody being evaluated for
the treatment of moderate-to-severe atopic dermatitis. Lebrikizumab was granted
Fast Track designation from the FDA. We also acquired Qbrexza® cloth, a
medicated cloth for the topical treatment of primary axillary hyperhidrosis
(uncontrolled excessive underarm sweating).
See Note 3 to the consolidated condensed financial statements for further
discussion regarding our recent acquisitions.
Legal Matters
Information regarding contingencies relating to certain legal proceedings can be
found in Item 1, "Legal Proceedings," of Part II of this Quarterly Report on
Form 10-Q and is incorporated here by reference.
                                       43
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                     Revenue

La seguente tabella riassume la nostra attività di entrate per regione:

                                          Three Months Ended                                                                 Six Months Ended
                                               June 30,                                                                          June 30,
                                        2020               2019            Percent Change       2020                   2019                Percent Change
U.S. (1)                            $ 3,144.8$ 3,252.5                 (3)        $  6,473.6$        6,143.3                  5
Outside U.S.                          2,354.6            2,384.2                 (1)           4,885.6                   4,585.6                  7
Revenue                             $ 5,499.4$ 5,636.7                 (2)        $ 11,359.2$       10,728.9                  6


Numbers may not add due to rounding.
(1) U.S. revenue includes revenue in Puerto Rico.
The following are components of the change in revenue compared with the prior
year:
                                                     Three Months Ended                                                                      Six Months Ended
                                                          June 30,                                                                               June 30,
                                                        2020 vs. 2019                                                                          2020 vs. 2019
                                      U.S.          Outside U.S.          Consolidated                U.S.          Outside U.S.            Consolidated
Volume                                     4  %                  7  %                  6  %               11  %                 16  %                     13  %
Price                                     (8)                   (7)                   (7)                 (6)                   (7)                       (7)
Foreign exchange rates                     -                    (2)                   (1)                  -                    (2)                       (1)
Percent change                            (3 %)                  (1%)                 (2 %)                5  %                  7  %                       6 %


Numbers may not add due to rounding.
We estimate that the COVID-19 pandemic negatively impacted worldwide revenue for
the three months ended June 30, 2020 by approximately $250 million of decreased
customer buying that largely offset product stocking that occurred in the first
quarter of 2020 and approximately $250 million resulting from delayed new
patient prescription trends. We estimate that the COVID-19 pandemic negatively
impacted worldwide revenue for the six months ended June 30, 2020 by
approximately $250 million due to delayed new patient prescription trends, while
product stocking in the first quarter of 2020 was largely offset by decreased
customer buying in the second quarter of 2020. We estimate that the decreased
customer buying in second quarter of 2020 that largely offset product stocking
that occurred in the first quarter of 2020 lowered revenue in the U.S. by $200
million and revenue outside the U.S. by approximately $50 million for the three
months ended June 30, 2020. We estimate that the delayed new patient
prescription trends decreased revenue in the U.S. by approximately $150 million
and revenue outside the U.S. by approximately $100 million for both the three
and six months ended June 30, 2020.
In the U.S. for the three and six months ended June 30, 2020 the decrease in
realized prices was driven primarily by changes to estimates for rebates and
discounts, mainly for diabetes products, reflecting both a favorable adjustment
in the Medicaid segment in the second quarter of 2019 and an unfavorable
adjustment in the commercial segment in the second quarter of 2020. The decrease
in realized prices in the U.S. also reflects higher growth in lower net price
segments across numerous products and increased rebates to gain and maintain
broad commercial access across the portfolio. In the U.S. for the three months
ended June 30, 2020 the increase in volume was primarily driven by Trulicity,
Taltz®, Emgality, and Verzenio®, partially offset by lower volume for products
including Trajenta®, Forteo, and Alimta. In the U.S. for the six months ended
June 30, 2020 the volume increase was primarily driven by Trulicity, Taltz,
Humalog, Emgality, Verzenio, and Humulin®, partially offset by decreased volume
for Cialis®, Trajenta and Forteo.
Outside the U.S. for the three and six months ended June 30, 2020, the decrease
in realized prices was driven primarily by the inclusion of Tyvyt® and Alimta in
government reimbursement programs in China and bi-annual government mandated
price decreases in Japan. Outside the U.S. for the three months ended June 30,
2020, the increase in volume was primarily driven by Tyvyt, Trulicity,
Olumiant®, Verzenio, Gemzar®, Jardiance®, and Taltz, partially offset by
decreased volume for Cialis, Forteo, Trajenta, and Strattera®. Outside the U.S.
for the six months ended June 30, 2020, the volume increase was primarily driven
by Tyvyt, Trulicity, Alimta, Olumiant, Verzenio, Taltz, Jardiance, Cymbalta®,
and Cyramza®, partially offset by decreased volume for Strattera, Trajenta,
Forteo, and Cialis.
                                       44
--------------------------------------------------------------------------------

La tabella seguente riassume la nostra attività di entrate per prodotto per i tre
i mesi si sono conclusi 30 giugno 2020 e 2019:

                                       Three Months Ended
                                            June 30,
                                      2020                                                                2019
Product            U.S. (1)       Outside U.S.         Total           Total         Percent Change
Trulicity        $   952.5$      277.2$ 1,229.8$ 1,028.5              20
Humalog (2)          281.7              273.3           555.1           677.6             (18)
Alimta               317.2              221.9           539.1           577.8              (7)
Taltz                289.2              106.0           395.2           353.8              12
Humulin              214.3               99.3           313.6           322.6              (3)
Basaglar®            229.7               60.7           290.4           290.7               -
Jardiance (3)        145.1              116.9           262.0           231.9              13
Cyramza®              94.1              162.7           256.7           241.8               6
Forteo               119.6              133.0           252.7           360.8             (30)
Verzenio             141.7               66.9           208.6           133.9              56
Cymbalta               7.7              172.1           179.9           187.2              (4)
Olumiant              13.2              131.8           145.0           102.4              42
Cialis                23.4              107.3           130.7           200.2             (35)
Erbitux®             115.8               13.7           129.5           159.3             (19)
Zyprexa®               9.1               87.5            96.6           104.3              (7)
Emgality              80.6                6.8            87.4            34.3              NM
Trajenta (4)          16.4               60.5            76.8           153.9             (50)
Other products        93.5              257.0           350.3           475.7             (26)
Revenue          $ 3,144.8$    2,354.6$ 5,499.4$ 5,636.7              (2)


Numbers may not add due to rounding.
NM - not meaningful
(1) U.S. revenue includes revenue in Puerto Rico.
(2) Humalog revenue includes insulin lispro.
(3) Jardiance revenue includes Glyxambi®, Synjardy®, and Trijardy® XR.
(4) Trajenta revenue includes Jentadueto®.
                                       45
--------------------------------------------------------------------------------

La tabella seguente riassume la nostra attività di entrate per prodotto per i sei
i mesi si sono conclusi 30 giugno 2020 e 2019:

                                         Six Months Ended
                                             June 30,
                                       2020                                                                 2019
Product            U.S. (1)       Outside U.S.          Total            Total         Percent Change
Trulicity        $ 1,882.0$      577.1$  2,459.1$  1,908.3              29
Humalog (2)          680.3              570.5          1,250.8          1,408.4             (11)
Alimta               641.5              457.7          1,099.2          1,076.9               2
Taltz                616.7              222.0            838.7            606.3              38
Humulin              428.4              200.8            629.3            620.3               1
Basaglar             460.1              134.0            594.1            542.1              10
Jardiance (3)        289.7              239.8            529.5            435.5              22
Forteo               242.2              282.9            525.0            673.7             (22)
Cyramza              183.2              312.5            495.7            440.0              13
Verzenio             271.1              125.6            396.7            243.3              63
Cymbalta              19.3              370.9            390.3            351.3              11
Cialis                49.5              274.3            323.8            508.4             (36)
Olumiant              24.5              260.2            284.7            184.5              54
Erbitux              233.7               26.7            260.3            277.7              (6)
Zyprexa               20.3              174.7            195.0            211.5              (8)
Trajenta (4)          45.1              124.9            170.0            285.9             (41)
Emgality             147.9               13.6            161.5             48.5              NM
Other products       238.1              517.6            755.6            906.1             (17)
Revenue          $ 6,473.6$    4,885.6$ 11,359.2$ 10,728.9               6


Numbers may not add due to rounding.
NM - not meaningful
(1) U.S. revenue includes revenue in Puerto Rico.
(2) Humalog revenue includes insulin lispro.
(3) Jardiance revenue includes Glyxambi, Synjardy, and Trijardy XR.
(4) Trajenta revenue includes Jentadueto.
Revenue of Trulicity, a treatment for type 2 diabetes and to reduce the risk of
major adverse cardiovascular events in adult patients with type 2 diabetes and
established cardiovascular disease, increased 20 percent and 29 percent in the
U.S. during the three and six months ended June 30, 2020, respectively, driven
by increased demand, partially offset by lower realized prices. Trulicity's
lower realized prices in the U.S. were primarily due to higher contracted
rebates and changes in segment mix, partially offset by higher list prices.
Revenue outside the U.S. increased 17 percent and 28 percent during the three
and six months ended June 30, 2020, respectively, driven by increased volume,
partially offset by the unfavorable impact of foreign exchange rates and lower
realized prices.
Revenue of Humalog, an injectable human insulin analog for the treatment of
diabetes, decreased 29 percent and 19 percent in the U.S. during the three and
six months ended June 30, 2020, respectively, driven by lower realized prices
due to changes in estimates for rebates and discounts, reflecting both a
favorable adjustment in the Medicaid segment in the second quarter of 2019 and
an unfavorable adjustment in the commercial segment in the second quarter of
2020. Revenue outside the U.S. decreased 3 percent during the three months ended
June 30, 2020, primarily driven by unfavorable impact of foreign exchange rates.
Revenue outside the U.S. increased 1 percent during the six months ended
June 30, 2020, driven primarily by increased volume, partially offset by the
unfavorable impact of foreign exchange rates. Included in the revenue of Humalog
in the U.S. are our own insulin lispro authorized generics, which began
launching in the second quarter of 2019 in order to lower out-of-pocket costs
for patients. While it is difficult to estimate the severity of the impact of
similar insulin lispro products entering the market, we do not expect and have
not experienced a rapid and severe decline in revenue. Due to the impact of
competition and due to pricing pressure in the U.S. and some international
markets, we expect some price decline and loss of market share to continue over
time.
                                       46
--------------------------------------------------------------------------------

Revenue of Alimta, a treatment for various cancers, decreased 7 percent in the
U.S. during the three months ended June 30, 2020, driven by decreased demand,
partially offset by higher realized prices. Revenue increased 3 percent in the
U.S. during the six months ended June 30, 2020, primarily driven by higher
realized prices. Revenue outside the U.S. decreased 6 percent during the three
months ended June 30, 2020, primarily driven by lower realized prices, partially
offset by increased volume. Revenue outside the U.S. increased 1 percent in the
six months ended June 30, 2020, primarily driven by increased volume, offset by
lower realized prices. We have faced and remain exposed to generic entry in
multiple countries, which has eroded revenue and is likely to continue to erode
revenue in those countries from current levels.
Revenue of Taltz, a treatment for moderate-to-severe plaque psoriasis, active
psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, and active non-radiographic axial
spondyloarthritis, increased 8 percent in the U.S. during the three months ended
June 30, 2020, driven by increased demand, partially offset by lower realized
prices. Revenue increased 37 percent in the U.S. during the six months ended
June 30, 2020, driven by increased volume and, to a lesser extent, higher
realized prices primarily due to changes in estimates for rebates and discounts.
Revenue outside the U.S. increased 24 percent and 41 percent during the three
and six months ended June 30, 2020, respectively, primarily driven by increased
volume, partially offset by lower realized prices and the unfavorable impact of
foreign exchange rates.
Revenue of Humulin, an injectable human insulin for the treatment of diabetes,
decreased 3 percent in the U.S. during the three months ended June 30, 2020,
driven by lower realized prices due to changes in segment mix and, to a lesser
extent, lower demand. Revenue increased 2 percent in the U.S. during the six
months ended June 30, 2020, driven by increased volume, partially offset by
lower realized prices. Revenue outside the U.S. decreased 3 percent due to the
unfavorable impact of foreign exchange rates, partially offset by higher
realized prices. Revenue outside the U.S. increased 1 percent during the six
months ended June 30, 2020, due to increased volume and higher realized prices,
partially offset by the unfavorable impact of foreign exchange rates.
Revenue of Basaglar, a long-acting human insulin analog for the treatment of
diabetes, decreased 1 percent in the U.S. during the three months ended June 30,
2020, driven by lower realized prices, partially offset by increased demand.
Revenue in the U.S. increased 7 percent during six months ended June 30, 2020,
primarily driven by increased demand. Revenue outside the U.S. increased 4
percent and 20 percent during the three and six months ended June 30, 2020,
respectively, driven by increased volume, partially offset by the unfavorable
impact of foreign exchange rates and lower realized prices. See Note 4 to the
consolidated condensed financial statements for information regarding our
collaboration with Boehringer Ingelheim involving Basaglar.
Revenue of Jardiance, a treatment for type 2 diabetes and to reduce the risk of
cardiovascular death in adult patients with type 2 diabetes and established
cardiovascular disease, increased 2 percent and 8 percent in the U.S. during the
three and six months ended June 30, 2020, respectively, driven by increased
demand. Revenue outside the U.S. increased 31 percent and 43 percent during the
three and six months ended June 30, 2020, respectively, driven by increased
volume. See Note 4 to the consolidated condensed financial statements for
information regarding our collaboration with Boehringer Ingelheim involving
Jardiance.
Revenue of Forteo, an injectable treatment for osteoporosis in postmenopausal
women and men at high risk for fracture and for glucocorticoid-induced
osteoporosis in men and postmenopausal women, decreased 31 percent and 19
percent in the U.S. during the three and six months ended June 30, 2020,
respectively, driven by lower demand and lower realized prices primarily due to
the unfavorable impact of higher contracted rates. Revenue outside the U.S.
decreased 29 percent and 25 percent during the three and six months ended
June 30, 2020, respectively, primarily driven by decreased volume and lower
realized prices. We expect further volume decline as a result of competitive
dynamics in the U.S. and the entry of generic and biosimilar competition
following the loss of patent exclusivity in the third quarter of 2019 in the
U.S., Japan, and major European markets. See "Executive Overview - Other Matters
- Patent Matters" for more information.
Revenue of Cyramza, a treatment for various cancers, increased 5 percent in the
U.S. during the three months ended June 30, 2020 driven by higher realized
prices and increased demand. Revenue in the U.S. for the six months ended
June 30, 2020 increased 11 percent primarily driven by increased demand. Revenue
outside the U.S. increased 7 percent and 14 percent during the three and six
months ended June 30, 2020, respectively, driven by increased volume, partially
offset by lower realized prices.
Revenue of Verzenio, a treatment for certain type of metastatic breast cancer,
increased 35 percent and 36 percent in the U.S. during the three and six months
ended June 30, 2020, respectively, driven by increased demand, and to a lesser
extent higher realized prices. Revenue outside the U.S. increased $38.3 million
and $81.0 million during the three and six months ended June 30, 2020,
respectively.
                                       47
--------------------------------------------------------------------------------

Margine lordo, costi e spese


Gross margin as a percent of revenue decreased 2.2 percentage points to 77.8
percent and 0.4 percentage points to 78.5 percent for the three and six months
ended June 30, 2020, respectively. The decrease in gross margin percent for the
three months ended June 30, 2020 was primarily due to the impact of lower
realized prices on revenue and higher intangibles amortization expense
associated with the launch of Retevmo. The decrease for the six months ended
June 30, 2020 was due to the impact of lower realized prices on revenue and
higher intangibles amortization expense associated with the launch of Retevmo,
partially offset by the charges in 2019 resulting from the withdrawal of
Lartruvo® and favorable product mix.
Research and development expenses decreased 1 percent to $1.39 billion and
increased 6 percent to $2.78 billion for the three and six months ended June 30,
2020, respectively. The decrease in research and development expenses for the
three months ended June 30, 2020 was driven primarily by lower development
expenses for late-stage assets and our pause in new clinical trial initiations
and patient enrollment as a result of the COVID-19 pandemic. The increase in
research and development expenses for the six months ended June 30, 2020 was
driven by higher development expenses for late-stage assets.
Marketing, selling, and administrative expenses decreased 9 percent to $1.45
billion and 3 percent to $3.00 billion for the three and six months ended
June 30, 2020, respectively, due to lower marketing expenses.
We recognized $241.8 million and $294.1 million of acquired IPR&D charges for
the three and six months ended June 30, 2020, respectively. The charges for the
three months ended June 30, 2020 were related to the acquisition of a
pre-clinical stage company as well as collaborations with AbCellera Biologics,
Junshi Biosciences, and Evox Therapeutics Ltd. The charges for the six months
ended June 30, 2020 also included a charge related to the collaboration with
Sitryx. We recognized $25.0 million and $161.9 million of acquired IPR&D charges
for the three and six months ended June 30, 2019, respectively. The charge for
the three months ended June 30, 2019 related to the collaboration with Avidity
Biosciences. The charges for the six months ended June 30, 2019 also included
charges related to the collaborations with AC Immune and ImmuNext. See Note 3 to
the consolidated condensed financial statements for additional information.
We recognized asset impairment, restructuring, and other special charges of
$59.9 million for the six months ended June 30, 2020, primarily related to
acquisition and integration costs as part of the closing of the acquisition of
Dermira. We recognized asset impairment, restructuring, and other special
charges of $423.9 million during the six months ended June 30, 2019, which
included $400.7 million related to the acquisition of Loxo, substantially all of
which was associated with the accelerated vesting of Loxo employee equity
awards.
Other-net, (income) expense was income of $446.9 million and $536.0 million for
the three and six months ended June 30, 2020, respectively, compared with
expense of $32.4 million and income of $53.6 million for the three and six
months ended June 30, 2019, respectively. The increase in other income was
driven by favorable mark-to-market adjustments on investment securities,
including equity positions that we hold in Asian biopharmaceutical companies as
well as two U.S.-based companies that had successful initial public offerings in
the second quarter of 2020.
The effective tax rate was 14.1 percent for the three months ended June 30,
2020, compared with 9.5 percent for the three months ended June 30, 2019. The
higher effective tax rate for the three months ended June 30, 2020 was driven by
a mix of earnings in higher tax jurisdictions, a lower net discrete tax benefit,
and a nondeductible acquired IPR&D charge. The effective tax rate was 13.7
percent for the six months ended June 30, 2020, compared with 14.1 percent for
the six months ended June 30, 2019. The lower effective tax rate was driven by
non-recurring 2019 events, primarily the non-deductibility of the accelerated
vesting of Loxo employee equity awards as part of the closing of the acquisition
of Loxo, as well as tax expenses associated with the withdrawal of Lartruvo,
offset by a mix of earnings in higher tax jurisdictions in 2020.
                                       48
--------------------------------------------------------------------------------

Financial Condition
Cash and cash equivalents increased to $2.37 billion as of June 30, 2020,
compared with $2.34 billion as of December 31, 2019. Net cash provided by
operating activities for the six months ended June 30, 2019 included
approximately $360 million of cash paid to settle the accelerated vesting of
Loxo employee equity awards (see Note 6 to the consolidated condensed financial
statements). Refer to the consolidated condensed statements of cash flows for
additional information on the significant sources and uses of cash for the six
months ended June 30, 2020 and 2019.
In addition to our cash and cash equivalents, we held total investments of $2.43
billion and $2.06 billion as of June 30, 2020 and December 31, 2019,
respectively. See Note 7 to the consolidated condensed financial statements for
additional information.
Total debt increased to $16.33 billion as of June 30, 2020, compared with
$15.32 billion as of December 31, 2019. The increase primarily related to the
net proceeds from the issuance of $1.00 billion of 2.25 percent fixed-rate notes
in May 2020. We used the net proceeds from the sale of these notes for general
corporate purposes, which included the repayment of outstanding commercial paper
used to fund a portion of the purchase price for our acquisition of Dermira. See
Note 7 to the consolidated condensed financial statements for additional
information.
As of June 30, 2020, we had a total of $5.21 billion of committed bank credit
facilities, $5.00 billion of which is available to support our commercial paper
program. We believe that amounts accessible through existing commercial paper
markets should be adequate to fund short-term borrowing needs.
During the six months ended June 30, 2020, we repurchased $500.0 million of
shares under our $8.00 billion share repurchase program authorized in June 2018.
As of June 30, 2020, we had $1.00 billion remaining under this program.
In July 2020, we declared a dividend for the third quarter of 2020 of $0.74 per
share on outstanding common stock. The dividend of approximately $700 million is
payable September 10, 2020 to shareholders of record at the close of business on
August 14, 2020.
We believe that cash generated from operations, along with available cash and
cash equivalents, will be sufficient to fund our normal operating needs,
including installment payments of the one-time repatriation transition tax under
the U.S. Tax Cuts and Jobs Act of 2017 (also known as the Toll Tax), dividends
paid to shareholders, share repurchases under our share repurchase program, and
capital expenditures.
See "Executive Overview - Other Matters - Patent Matters" for information
regarding recent and upcoming losses of patent protection.
Both domestically and abroad, we continue to monitor the potential impacts of
the economic environment; the creditworthiness of our wholesalers and other
customers, including foreign government-backed agencies and suppliers; the
uncertain impact of health care legislation; various international government
funding levels; and changes in foreign currency exchange rates (see "Executive
Overview - Other Matters - Foreign Currency Exchange Rates").
                                       49
--------------------------------------------------------------------------------

Financial Expectations
We have updated certain elements of our 2020 financial guidance to reflect
management's current expectations for underlying business performance.
There is uncertainty in our 2020 financial guidance surrounding the extent and
duration of the impact of the COVID-19 pandemic.
Key management assumptions related to the COVID-19 pandemic that support our
2020 guidance include:
•Healthcare activity, including non-COVID-19 related patient visits with their
physicians, will align more closely with historical levels in the second half of
2020;
•New-to-brand prescription trends will improve in the U.S. in the second half of
2020, exceeding pre-pandemic levels by the fourth quarter of 2020 for most
brands;
•Increased utilization of patient affordability programs and changes in segment
mix due to higher U.S. unemployment will have a modestly negative impact on U.S.
pricing;
•Promotional spend will constitute a mix of in-person customer interactions,
direct-to-consumer advertising and investments in digital promotion;
•Clinical trial enrollment in existing studies, as well as initiation of new
clinical trials, will resume in the second half of 2020; and
•Investment in COVID-19 related research, testing and support will continue
throughout 2020.
Full-year 2020 EPS is now anticipated to be in the range of $6.48 to $6.68. We
still expect 2020 revenue between $23.7 billion and $24.2 billion. Revenue
growth is still expected to be driven by volume from Trulicity, Taltz, Basaglar,
Jardiance, Verzenio, Cyramza, Olumiant, Emgality, Baqsimi, Tyvyt, and Retevmo.
Revenue growth is expected to be partially offset by lower revenue for products
that have lost patent exclusivity. Revenue growth is also expected to be
partially offset by a mid-single digit net price decline in the U.S. (driven
primarily by rebates and legislated increases to Medicare Part D cost sharing,
and patient affordability programs), as well as net price declines in China,
Japan and Europe.
Gross margin as a percent of revenue is now expected to be approximately 78
percent. Marketing, selling, and administrative expenses are now expected to be
in the range of $6.0 billion to $6.2 billion. Research and development expenses
are still expected to be in the range of $5.6 billion to $5.9 billion.
Other-net, (income) expense is now expected to be between $350 million to $500
million of income.
The 2020 effective tax rate is now expected to be approximately 14 percent.

Available Information on our Website
We make available through our company website, free of charge, our company
filings with the Securities and Exchange Commission (SEC) as soon as reasonably
practicable after we electronically file them with, or furnish them to, the SEC.
The reports we make available include annual reports on Form 10-K, quarterly
reports on Form 10-Q, current reports on Form 8-K, proxy statements,
registration statements, and any amendments to those documents.
The website link to our SEC filings is http://investor.lilly.com/sec.cfm. The
information contained in, or that can be accessed through, our website is not a
part of, or incorporated by reference in, this quarterly report.
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© Edgar Online, fonte scorci

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  • L'indice FTSE 100 cade a 70 punti
  • L'oro ha quasi raggiunto livelli record
  • Lo IAG conferma un enorme problema di diritti
  • Wall Street inizia in modo misto

3.55pm: flop footsie e

Le blue chip di Londra e Wall Street stanno estendendo le loro cadute, a parte i grandi titoli tecnologici statunitensi.

Il FTSE 100 ha fatto un ulteriore passo in avanti mentre gli investitori digeriscono la nuova posizione cauta del governo britannico riguardo al coronavirus e al peggioramento dei dati economici statunitensi.

In calo di 70 punti o dell'1,2% a 5.919, il Footsie è in rotta per un calo di quasi il 4% per il mese di luglio.

Dopo che è stato annunciato un rinnovato blocco per gran parte dell'Inghilterra settentrionale durante la notte, oggi il Primo Ministro Boris Johnson ha avvertito che il paese “non può essere compiaciuto” del coronavirus.

Ciò è avvenuto quando l'Ufficio per le statistiche nazionali ha affermato che la prevalenza di COVID-19 nella comunità probabilmente aumenterà nel paese per la prima volta da maggio, mentre il gruppo consultivo Sage ha dichiarato che “non ha fiducia che R (il tasso di riproduzione del virus) è attualmente inferiore a 1 in Inghilterra ”.

Sentendo che un nuovo slogan potrebbe provare ad aiutare le cose, Johnson ha svelato una linea di demarcazione per il suo podio di Downing Street: “mani, viso, spazio”.

Questo è progettato per incoraggiare il pubblico a lavarsi le mani assiduamente, indossare maschere e mantenere uno spazio adeguato tra loro e gli altri.

Nel frattempo, attraverso l'Atlantico, il Dow e l'S & P sono entrambi in rosso ora, anche se i tera-cap di Apple e Amazon stanno aiutando a mantenere il Nasdaq sopra l'acqua, sebbene i guadagni precedenti siano stati ridotti.

“Il tentativo di rimbalzo del mercato era quasi scomparso venerdì pomeriggio, gli indici occidentali si stanno esaurendo di fronte a un controllo della realtà del PIL di due giorni”, ha dichiarato Connor Campbell, analista di mercato presso.

Guardando il Footsie ha notato che l'indice del Regno Unito sta registrando i livelli degli scambi visti l'ultima volta a metà maggio.

“Anche se è passato di meno nelle ultime due settimane, sono state le perdite riscontrate giovedì e venerdì a causare il danno. E questo è ancora prima che al Regno Unito venga scontata la propria dannazione per il PIL nel secondo trimestre “.

Le azioni europee hanno sovraperformato gli Stati Uniti e il Regno Unito, nonostante la regione abbia registrato una contrazione record nella crescita economica per il secondo trimestre.

15:00: inizio misto per titoli statunitensi

Le azioni di Wall Street hanno avuto un inizio misto, sebbene le azioni tecnologiche stiano aumentando notevolmente dopo i numeri degli utili a eliminazione diretta di alcuni dei grandi nomi.

Il Dow Jones era sceso in territorio negativo nei primi scambi, scendendo dello 0,2% a 26.268, mentre il Nasdaq Composite alimentato dalla tecnologia era aumentato dell'1% a oltre 10.700 e l'S & P 500 era in qualche punto in mezzo con un aumento dello 0,2%.

Apple () è salito del 6% per aggiungere altri miliardi di dollari alle sue valutazioni, mentre Amazon () è aumentato del 4% e Facebook () è aumentato del 7% dopo che i loro guadagni hanno riportato durante la notte.

Un piccolo torrente di dati economici statunitensi ha aggiunto l'atmosfera incerta, con alcuni dei quali migliori del previsto e altri peggiori.

Il reddito personale è diminuito e la spesa è rallentata a giugno, secondo l'Ufficio di analisi economica, e quel mese era precedente alla ripresa del mese scorso nei casi di coronavirus.

Il reddito delle famiglie è sceso dell'1,1% a giugno rispetto al mese precedente, in peggioramento rispetto allo 0,8% previsto dagli economisti, mentre la spesa per consumi è cresciuta del 5,6%, in calo rispetto al miglioramento dell'8,5% di maggio, sebbene leggermente migliore delle previsioni.

Ciò accade un giorno dopo che le richieste iniziali di disoccupazione sono aumentate per la seconda settimana consecutiva e il prodotto interno lordo degli Stati Uniti nel secondo trimestre ha mostrato un crollo del 32,9% su base annua – il peggior calo registrato – sebbene ciò equivale approssimativamente a un secondo vero declino trimestrale di circa il 9% su base trimestrale.

Di ritorno a Londra, il FTSE 100 ha esteso il suo declino, scendendo di 28 punti o 0,5% a 5.961,86.

Un dollaro più debole, portando la sterlina in rialzo dello 0,5% a 1,3161, non aiuta molte blue chip del Regno Unito.

12.45: PM dice che la riapertura deve rallentare

Il FTSE si sta muovendo più in basso ma non di molto, nonostante l'avvertimento del Primo Ministro Boris Johnson che il Regno Unito deve rallentare la riapertura dell'economia.

Ora è il momento di “premere quel pedale del freno per tenere sotto controllo quel virus”, ha detto, ribaltando la precedente decisione di consentire la riapertura di attività ricreative tra cui casinò e piste da bowling.

Ciò sembrerebbe far sperare in una ripresa a forma di V per il Regno Unito e mettere un freno alle azioni di Hollywood Bowl ().

Queste misure di apertura precedentemente programmate, inclusa la possibilità di riprendere alcuni trattamenti di bellezza, saranno rinviate almeno al 15 agosto, ha detto Downing Street.

Il FTSE è sceso di 11 punti a 5.978,73.

Guardando attraverso lo stagno, i commercianti di IG chiamavano il Dow Jones circa 64 punti più in alto rispetto all'open.

Questo segue i numeri knockout da Facebook (), Apple () e Amazon () durante la notte.

“Con questa pandemia senza precedenti che ha causato un abisso di spesa a breve termine tra consumatori e imprese, i nomi FAANG sono stati visti come coperte di sicurezza relative in questa spaventosa tempesta di categoria 5”, ha affermato il broker Wedbush.

Gli analisti del broker statunitense hanno dichiarato di ritenere che le azioni tecnologiche “potrebbero ancora salire di un altro 20% -30%” (Leggi di più qui).

11.59: chip blu nel rosso

Il benchmark blue chip di Londra è caduto in territorio negativo per il giorno, guidato da un mix di aziende.

Il Footsie ha perso otto punti, pari allo 0,1%, a 5.981,71, con il proprietario della British Airways IAG () e host di altre società focalizzate sui consumatori tra i grandi perdenti.

Ciò include i gruppi multimediali ITV () e WPP (), i bookmaker GVC () e Flutter (), il gruppo alberghiero Whitbread (), insieme a BT (), () e Diageo (), che offrono Internet, fags e alcol, forse il moderno trio di comfort domestici.

Il dollaro ha anche ripreso la sua mossa in ribasso dopo i guadagni del giorno precedente, con l'analista di mercato David Madden di CMC Markets che afferma che ciò accade quando i rivenditori sono “tornati in modalità a rischio”.

Avendo ieri sembrato agire come un bene rifugio, la nuova mossa in basso di nuovo “sottolinea il sentimento aspro che circonda la valuta”, ha detto Madden.

Ciò ha giovato alla sterlina, che crea venti contrari per i molti percettori d'oltremare sul FTSE 100.

10.50: il piedino si appiattisce

Il FTSE 100 ha rinunciato a quasi tutti i suoi primi guadagni ora, scendendo sotto il punteggio di 6.000 con solo 4 punti aggiunti per il giorno a 5.994.

Se la sessione terminasse attorno a quel livello, ciò significherebbe che il mese ha registrato una perdita del 2,8% e un calo di oltre il 7% dall'inizio di giugno e del 22% dal punto più alto di gennaio.

“Luglio è stato un secondo mese negativo per gli investitori in titoli del Regno Unito con l'indice FTSE 100 ora scambiato ai minimi visti l'ultima volta a fine maggio”, ha osservato Russ Mold, direttore degli investimenti di AJ Bell.

“Il mercato ha sicuramente perso slancio e si sta lentamente spostando mentre molte aziende continuano a lottare dalla pandemia.”

Tabacco, banche e media sono stati i tre settori peggiori della LSE a luglio, con i guadagni per NatWest () e British American Tobacco (LON: BAT) che hanno fatto registrare lievi guadagni sulla scia dei risultati odierni, facendo quasi nessuna differenza.

A seguito delle forti accantonamenti per crediti inesigibili annunciati da alcuni dei suoi colleghi all'inizio della settimana, tra il peggioramento delle aspettative per l'economia, NatWest ha guidato le spese di svalutazione per l'intero anno di £ 3,5-4,5 miliardi.

“È interessante notare che i depositi dei clienti sono aumentati di £ 39,1 miliardi nel primo semestre a £ 408,3 miliardi”, ha osservato Mold.

“Ciò è probabilmente dovuto alla riduzione della spesa e alle persone che adottano misure per eseguire il backup di denaro in caso di emergenze o cambiamenti nelle loro circostanze.

Mentre le azioni di NatWest sono avanzate, Mold ha affermato che “questo deve essere visto nel contesto di un grande sell-off all'inizio di questa settimana a seguito di cupi aggiornamenti da altre banche quotate”.

Alla BAT, le azioni sono solo in territorio positivo stamattina dopo che gli utili del primo semestre per numero di azioni sono scesi del 3% al di sotto delle aspettative ma si è tenuto un orientamento per l'intero anno.

10.25: crash della crescita economica europea

Le azioni europee e del Regno Unito restano in territorio positivo ma stanno raggiungendo i massimi dopo che il prodotto interno lordo dell'Eurozona è diminuito del 12,1% nel secondo trimestre dell'anno rispetto al primo

La contrazione dell'economia dell'eurozona è stata la più grande dalla fondazione del blocco, ma solo leggermente peggiore della previsione del 12% degli economisti.

“Alcuni record non devono mai essere battuti”, ha affermato Bert Colijn, economista senior di ING. “Pensa agli obiettivi di Premier League di Alan Shearer, alla partita di basket di 100 punti di Wilt Chamberlain, alle vittorie di Eddy Merckx nel ciclismo. Anche la cifra del PIL dell'eurozona del secondo trimestre dovrebbe probabilmente figurare in quella lista; sarebbe bello se non fosse mai battuto.

“Il tasso di crescita del -12,1% su base trimestrale è il peggiore mai registrato e abbastanza difficile da interpretare. È un calo scioccante, ma completamente comprensibile poiché l'economia è stata chiusa per un periodo considerevole durante il trimestre.

“Pertanto, ciò non ci dice molto dello stato generale dell'economia, che di solito è il motivo per cui si dovrebbero considerare le cifre del PIL in primo luogo.

“Tuttavia, più profondo è il blocco, maggiore è la possibilità di danni permanenti più significativi all'economia e quindi l'entità del declino è ancora rilevante.”

10:00: il crollo dei prezzi delle case sembra improbabile

L'indice FTSE 100 è leggermente vacillato, ma rimane in territorio positivo, in rialzo di 15 punti o dello 0,3% a 6.005, con il supporto proveniente da un acquisto tradizionale di fine mese da parte di fondi e società di costruzione di case dopo alcune notizie positive sui prezzi delle case.

I prezzi delle case sono aumentati dell'1,7% a luglio rispetto al mese precedente, secondo la società edile Nationwide, che ha più che invertito un calo dell'1,6% a giugno.

Su base annua, i prezzi sono ora aumentati dell'1,5%, guadagnando terreno dal dato negativo dello 0,1% visto il mese precedente.

“Insieme al ritiro dei prestiti a giugno, questo rafforza la nostra opinione che un crollo dei prezzi delle case è ora improbabile”, ha dichiarato Hansen Lu a.

“Sebbene, con le vacanze ipotecarie e i programmi di ritiro in scadenza tra breve, potrebbero essere ancora all'orizzonte ulteriori riduzioni dei prezzi”.

Tra i costruttori, blue chip () è stato un forte guadagno, in crescita di oltre l'1%, mentre i rivali tra cui Barratt () e () hanno goduto di guadagni minori.

Il tono positivo nei mercati è stato aiutato dalla “modalità di recupero di fine mese”, ha affermato l'analista di mercato Connor Campbell, più evidentemente nel continente.

“Come sempre durante questa pandemia, i motivi alla base dei guadagni di venerdì sembrano abbastanza arbitrari, quasi controintuitivi. Dopotutto, gli investitori hanno risvegliato un crollo del 13,8% nel secondo trimestre in Francia, spazzando via la crescita di 18 anni, peggiore delle previsioni 18,5 % di contrazione in Spagna e un calo del 12,4% in Italia “.

Il Regno Unito si sta anche scrollando di dosso un nuovo blocco annunciato durante la notte dal governo per coprire aree di Greater Manchester, East e West Yorkshire.

“Eppure, in parte grazie ad alcuni guadagni di successo di Apple e Amazon e ai solidi aggiornamenti di Facebook e Alphabet, il tono del trading è stato positivo”, ha detto Campbell.

8.55: il venerdì inizia in modo positivo

I trader mettono da parte le preoccupazioni per il coronavirus quando l'FTSE 100 si è aperto in territorio positivo.

L'indice delle azioni blue chip del Regno Unito è salito di 35 punti a 6.025,69.

Tuttavia, le preoccupazioni alla base del fragile stato dell'economia mondiale hanno riscaldato il prezzo dell'oro, che stava ribollendo intorno ai 1.975 dollari l'oncia.

Ricorda, il metallo giallo funge da investimento rifugio in periodi di turbolenza, quindi il fatto che si avvicini a un territorio record sottolinea l'umore birichino del mercato.

Cosa sa Roman Abramovich del prezzo dell'oro?

Alla vigilia dell'apparizione della sua squadra nella finale della Coppa d'Inghilterra, il miliardario russo Roman Abramovich, secondo Bloomberg, ha deciso di scaricare le sue quote in Highland Gold Mining ().

Il ricavato può aiutare a finanziare le future incursioni del manager del Chelsea Frank Lampard nel mercato dei trasferimenti.

Altrove, la grande, ma attesa, notizia è stata fornita dal proprietario IAG () di British Airways, che è sceso del 5,8% dopo l'annuncio della sua emissione di diritti da 2,5 miliardi di sterline a lungo termine. Il vettore ha anche avvertito che era improbabile che i viaggi internazionali si riprendessero fino al 2023.

Dopo aver consegnato un messaggio apparentemente cupo in quanto ha aumentato in modo significativo le disposizioni in materia di crediti inesigibili, NatWest () si è trovata nell'elenco delle colonne montanti con un guadagno del 2,2%. Gran parte di questo è stato un recupero dal sell-off di tutto il settore di giovedì indotto dall'aggiornamento piuttosto cupo di Lloyds ().

Titoli di notizie proattivi:

(LON: TILS,) ha presentato una domanda di brevetto relativa all'uso potenziale di Foralumab somministrato per via nasale e assunto per via orale per il trattamento di COVID-19 da solo o in combinazione con altri farmaci antivirali. I metodi per fornire l'anticorpo monoclonale anti-CD3 completamente umano (mAb) potrebbero potenzialmente modulare o stimolare il sistema immunitario per sopprimere le tempeste di citochine e quindi ridurre l'insufficienza respiratoria nei pazienti con coronavirus, ha affermato la società. I suoi ricercatori ritengono che la sua combinazione con altri farmaci antivirali potrebbe migliorare l'efficacia.

() (ASX: THR) ha rivelato che esiste oro visibile dal campionamento del campione della seconda fase di campionamento geochimico di oro, nichel e cromo presso gli appartamenti Pilbara Goldfield di proprietà al 100% (E46 / 1262 ed E46 / 1190) nell'Australia occidentale . Tra i punti salienti, 17 dei 32 campioni di sedimenti di flusso avevano oro visibile nel panning, mentre due dei siti di campionamento del 2019 (19PST22 e 19PST32) avevano oro visibile in più campioni di sedimenti di flusso di follow-up e i campioni 20PST04 e 20PST24 hanno restituito 13 e 11 grani rispettivamente da pan. Mick Billing, presidente esecutivo di Thor Mining ha commentato: “Questo sembra essere un follow-up di grande successo, al precedente, molto riuscito programma di campionamento”.

() Ha annunciato che l'ufficio brevetti e marchi degli Stati Uniti (USPTO) ha completato l'esame della domanda di brevetto dell'azienda (14 / 379.239), intitolata: “Profilo fenotipico delle cellule progenitrici retiniche umane” e ha emesso una notifica di indennità per l'emissione di un brevetto. In una dichiarazione, il leader globale con sede nel Regno Unito nello sviluppo di terapie a base cellulare ha affermato che il brevetto consentito protegge la composizione del candidato terapeutico a base di cellule hRPC dell'azienda per le malattie della retina, coltivato in condizioni specifiche per migliorare la funzione e identificabile dalla presenza e assenza di marcatori di superficie cellulare specifici. Questa notifica di indennità negli Stati Uniti aggiunge ulteriore protezione della proprietà intellettuale alla tecnologia hRPC, che ha già una protezione brevettuale in numerosi altri grandi territori tra cui Europa, Giappone e Australia.

() ha aggiornato gli investitori sullo stato di avanzamento del suo programma di cura della pelle cosmetica e di una sperimentazione sull'integratore alimentare della psoriasi. La società quotata AIM ha dichiarato che Sederma, il suo partner nel programma di cosmetici e una divisione di (), ha replicato con successo il processo di produzione del lisato e ha ottenuto le stesse prestazioni dalla tecnologia SkinBiotix dell'azienda e ora sta lavorando per convalidare un ridimensionamento del processo di produzione a diversi livelli di volume. Nel frattempo, l'azienda ha dichiarato alla luce delle attuali restrizioni sugli studi sull'uomo non correlati al coronavirus, ha stabilito un protocollo per la sua sperimentazione di integratori alimentari “autogestiti” sulla psoriasi e sta procedendo con lo studio.

Impax Environmental Markets PLC (LON: IEX) ha rivelato giovedì che dovrà pagare un primo dividendo provvisorio per l'esercizio 2020 di 1,3 p per azione ordinaria e ha dichiarato che è intenzione del suo consiglio dichiarare un finale, o un secondo , dividendo verso la fine del primo trimestre del 2021. In una dichiarazione rilasciata dopo la chiusura del mercato di Londra, IEX ha affermato che per essere equi con tutti gli azionisti e in seguito a una considerazione analoga del pagamento del dividendo (singolo) dell'anno scorso come piuttosto che una finale successiva, il consiglio ha deciso che d'ora in poi dichiarerà un dividendo provvisorio nella fase semestrale, con un secondo dividendo pagabile dopo la fine dell'anno.

Holdings PLC () ha annunciato che l'European Respiratory Journal – un'importante pubblicazione scientifica incentrata sulla malattia polmonare e rivista di punta della European Respiratory Society – ha pubblicato i risultati peer-reviewed dal trial Early diagnosi of Cancer of the Lung Scotland (ECLS) . Il processo è stato consegnato dalle Università di Dundee e St Andrews con il NHS Tayside e cofinanziato dal Chief Scientist Office scozzese e dal governo scozzese. Il principale gruppo globale di immunodiagnostici ha affermato che l'articolo intitolato “Diagnosi precoce del carcinoma polmonare in uno studio randomizzato di un esame del sangue con autoanticorpi seguito da imaging” – che è ora disponibile online e sarà replicato in stampa prima del terzo trimestre 2020 – valuta l'efficacia di EarlyCDT Test polmonare nel ridurre l'incidenza dei pazienti che presentano diagnosi di carcinoma polmonare in stadio avanzato.

() ha riferito che le sue vendite da inizio anno e il suo portafoglio ordini confermato sono ora superiori a £ 4 mln a seguito della firma di due accordi di fornitura nel suo primo trimestre. In un aggiornamento sugli attuali risultati di trading che accompagnano l'esercizio chiuso al 31 marzo 2020, l'azienda di biomateriali e di farmaci rigenerativi ha anche registrato entrate per £ 900.000 nel suo primo trimestre, aiutata da una riduzione dell'impatto del coronavirus nel quarto trimestre del anno precedente, nonché un saldo in contanti alla fine del periodo di £ 1,6 mln. Per l'anno precedente, Collagen ha registrato ricavi per £ 4,46 mln, in calo dell'1% su base annua, insieme a una perdita ante imposte di £ 2,06 mln rispetto a £ 1,79 mln dell'anno precedente.

() ha ampliato il suo braccio di costruzione con la sua quarta acquisizione del 2020. GS Contracts (Joinery) Limited, specialista in ospitalità di alto livello e lavori di allestimento al dettaglio, si è unito al gruppo per un corrispettivo di £ 1,7 mln di banconote convertibili e obbligazioni. Il pagamento include l'acquisizione di una proprietà commerciale del valore di circa 0,8 mln di sterline poiché GS Contracts porta i propri impianti di produzione interni.

() () (OTCQB: NQMIY) ha dichiarato che è “ottimista” per le sue prospettive che vanno avanti dopo aver segnalato la produzione in aumento dalla sua miniera di Hellyer nella prima parte del 2020. In una dichiarazione prospettica che accompagna i suoi risultati per l'anno conclusosi il 31 dicembre 2019 , la società ha riferito che nel primo trimestre del 2020 ha prodotto 8.127 tonnellate di concentrato di piombo, rispetto a 4.712 di un anno fa, mentre il concentrato di zinco è salito a 4.609 tonnellate da 3.015.

European Metals Holdings Limited (LON: EMH) (ASX: EMH) ha messo in evidenza i “continui progressi” nel suo progetto Cinovec al litio e stagno in Repubblica Ceca. In un aggiornamento per i tre mesi chiusi al 30 giugno 2020, la società quotata AIM ha dichiarato durante il periodo un investimento di € 29,1 mln in Cinovec da parte del gruppo CEZ conglomerato e il lavoro di progetto inizierà immediatamente, mentre un permesso preliminare di mining per il progetto è stato concesso anche per la parte orientale del deposito per otto anni. La società sta inoltre discutendo con la Borsa di Praga in merito a una proposta di quotazione, aggiungendo che ha anche organizzato un meccanismo di finanziamento intermedio per aiutare a finanziare nuove iniziative per le operazioni in corso.

PLC (), la società di esplorazione e sviluppo dell'oro focalizzata su Irlanda e Finlandia, ha dichiarato di aver ricevuto un avviso per esercitare warrant per la sottoscrizione di 1.358.333 azioni ordinarie al prezzo di 16 p per azione ordinaria per le quali sono stati ricevuti fondi di £ 217.333 azienda. I warrant sono stati emessi nell'ambito della collocazione e sottoscrizione di nuove azioni ordinarie annunciate il 18 febbraio 2020. Il gruppo ha aggiunto che i proventi derivanti dall'esercizio dei warrant saranno utilizzati a fini di capitale circolante generale.

(), la società indipendente di produzione, sviluppo ed esplorazione di petrolio e gas focalizzata sulla Nigeria, ha annunciato la nomina di Allenby come consigliere nominato e broker congiunto della società con effetto immediato. Ha inoltre affermato che, in seguito all'acquisizione di Whitman Howard Limited da parte di Panmure Gordon & Co, ha nominato Panmure Gordon come altro broker congiunto con effetto immediato.

(), specialisti nell'esplorazione e produzione di iodio e produttori di prodotti chimici speciali, ha annunciato il lancio del suo nuovo sito Web aziendale all'indirizzo www.iofina.com. Il sito Web includerà le informazioni attuali per clienti e investitori, sarà mobile e tablet e sarà continuamente migliorato e aggiornato.

(), la società di esplorazione e sviluppo mineraria focalizzata sul suo progetto Bougouni al litio nel sud del Mali, ha annunciato che la sua assemblea generale annuale (AGM) si terrà alle 12:00 del 27 agosto 2020, a Prince Frederick House, 35-39 Maddox Street, London W15 2PP. A seguito delle attuali misure attuate dal governo del Regno Unito, gli azionisti non saranno autorizzati a partecipare all'Assemblea generale, ma sono fortemente incoraggiati a presentare i propri voti per delega il più presto possibile. La società ha dichiarato che intende tenere un webcast per gli azionisti dopo l'AGM sotto forma di presentazione seguita da domande e risposte. Ulteriori dettagli saranno comunicati a tempo debito.

6.50: tick up visto dopo il tuffo

L'indice FTSE 100 dovrebbe aprirsi venerdì, consolidandosi dopo il brusco calo della sessione precedente, poiché anche i mercati di Stati Uniti e Asia restano sospesi tra le preoccupazioni per una seconda ondata dell'epidemia di coronavirus, ma con alcuni guadagni ottimistici dai giganti della tecnologia USA che forniscono supporto sottostante .

Diffondere la società di scommesse CMC Markets prevede che l'indice blue-chip si aprirà di circa 18 punti in più a 6.008, dopo essersi tuffato di 114,87 punti giovedì per terminare a 5.989,99.

Durante la notte a New York, la Dow Jones Industrials Average ha chiuso oltre 225 punti, ovvero lo 0,9% a 26.313,65, mentre l'indice S&P 500 più ampio ha perso lo 0,4%.

Ma il Nasdaq Composite è riuscito a guadagnare lo 0,4% con tutti gli occhi su un trio di risultati dai giganti tecnologici Apple Inc (), Amazon Inc () e () che sono stati rilasciati dopo la chiusura a New York.

Questo ottimismo di Nasdaq si è rivelato fondato quando Apple, Amazon e Facebook hanno infranto le aspettative con i loro ultimi numeri trimestrali. Apple ha anche annunciato una suddivisione in azioni 4 per 1, mentre ha pubblicato la sua performance Q3 migliore di sempre, ha osservato l'analista senior CMC Markets (UK) Michael Hewson.

“Questi risultati impressionanti serviranno solo ad allargare il divario tra questi enormi colossi tecnologici e il resto del mercato statunitense sottostante; tuttavia, sembrano pronti a garantire che i mercati statunitensi inizino l'ultimo giorno della settimana e il mese in più quando apriranno più tardi oggi. “

Tuttavia, ha aggiunto: “Lo stesso non si può dire per la sessione asiatica di oggi, che ha visto un grande calo nel Nikkei 225, che sembra aver preso spunto dai dati sulle richieste di sussidi di disoccupazione statunitensi più deboli del previsto, tra preoccupazioni per un secondo onda. Gli ultimi numeri PMI di produzione e servizi in Cina per luglio sono stati un miscuglio, con un modesto aumento del PMI manifatturiero a 51,1, tuttavia i servizi si sono leggermente ridotti a 54,2 “.

I mercati azionari asiatici complessivi sono stati mescolati venerdì, il Nikkei 225 giapponese ha registrato un calo del 2,3% e l'indice blue-chip di Shanghai in calo dello 0,3%, ma l'indice Hang Seng di Hong Kong è salito dello 0,1% in più.

PIL europeo, flusso di utili blue chip nel Regno Unito

Hewson di CMC ha proseguito: “I mercati europei non sembrano certamente trarranno grandi benefici dall'aumento dei profitti della tecnologia statunitense della scorsa notte, dopo le brusche cadute di ieri, con l'obiettivo principale di oggi di concentrarsi sul rilascio delle prime iterazioni della Francia PIL del secondo trimestre, che dovrebbe registrare una contrazione del -15,2%, PIL italiano del secondo trimestre, una contrazione del -15,5%, Spagna una contrazione del -16,6% e PIL del secondo trimestre dell'UE -12,1%.

“Nessuno di questi numeri dovrebbe essere visto con troppa sorpresa, ma saranno comunque visti attraverso una lente di quanta parte di questa attività persa può essere ritirata entro la fine dell'anno.”

“Considerate le preoccupazioni sull'aumento dei tassi di infezione, i divieti di viaggio, i blocchi e le quarantene che vengono imposti, vi è la preoccupazione che potremmo vedere un ulteriore svantaggio economico di alcune delle stime annualizzate del PIL, a meno che questi picchi di virus non vengano eliminati”, ha concluso Hewson.

A parte i dati europei, anche se potrebbe essere la fine di una settimana intensa, lo spigot dei risultati aziendali nel Regno Unito difficilmente rallenta, con un altro grosso lotto di aggiornamenti blue-chip all'ordine del giorno, compresi gli annunci di trading: () e (), e risultati provvisori da PLC (), SA (), (), () e PLC ().

Intorno ai mercati:

  • Sterlina: 1,3128 USD, in calo dello 0,1%
  • Oro: 1.962,60 USD l'oncia, in crescita dello 0,1%
  • Brent: 43,14 USD al barile, in crescita dello 0,5%

6.45: Early Markets – Asia / Australia

Le azioni nell'Asia del Pacifico sono state mescolate oggi a seguito di un calo record del PIL degli Stati Uniti nel secondo trimestre.

Le azioni giapponesi hanno causato perdite tra i principali mercati asiatici, con il Nikkei 225 in calo del 2,24%. In Cina, lo Shanghai Composite ha guadagnato lo 0,3%.

L'S & P / ASX 200 in Australia ha perso il 2,47% entro le 16:00 quando i grandi minatori, le banche e le aziende energetiche si sono affievolite.

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Notizie proattive in Australia:

() continua l'attività di estrazione e lavorazione presso la Thalanga Base Metals Operation nel nord del Queensland mentre accelera le attività di riavvio del Progetto Gold Hillgrove nel Nuovo Galles del Sud.

() è incoraggiato dai risultati dell'oro fino a 58,4 g / t da campioni di chip di roccia che confermano che il Bryah West Project a nord di Meekatharra nell'Australia centro-occidentale ha “un potenziale esplorativo significativo”.

() è più alto dopo aver intersecato ampie zone di oro da buono a pregiato nella roccia fresca nei primi cinque fori di diamante a NE Bankan all'interno del flagship Kaninko Gold Project in Guinea.

() ha iniziato la perforazione del diamante nella prima campagna di perforazione in assoluto sul bersaglio d'oro di Last Chance, che fa parte del più ampio Red Mountain Project nell'Alaska centrale.

Arafura Resources Limited () ha ottenuto il Major Project Status (MPS) per il progetto Nolans Neodymium-Praseodymium (NdPr) al 100% nel Territorio del Nord, rinnovato per altri tre anni dal governo australiano.

Auteco Minerals Ltd () (OTCMKTS: MNXMF) sta avanzando la sua strategia per aggiornare l'inventario dell'oro nel suo progetto Pickle Crow in Ontario, Canada, con l'arrivo di un secondo impianto e la creazione di un campo di 24 persone per tutto l'anno esplorazione.

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(LON: TILS,) ha presentato una domanda di brevetto relativa all'uso potenziale di Foralumab somministrato per via nasale e assunto per via orale per il trattamento di COVID-19 da solo o in combinazione con altri farmaci antivirali. I metodi per fornire l'anticorpo monoclonale anti-CD3 completamente umano (mAb) potrebbero potenzialmente modulare o stimolare il sistema immunitario per sopprimere le tempeste di citochine e quindi ridurre l'insufficienza respiratoria nei pazienti con coronavirus, ha affermato la società. I suoi ricercatori ritengono che la sua combinazione con altri farmaci antivirali potrebbe migliorare l'efficacia.

() (ASX: THR) ha rivelato che esiste oro visibile dal campionamento del campione della seconda fase di campionamento geochimico di oro, nichel e cromo presso gli appartamenti Pilbara Goldfield di proprietà al 100% (E46 / 1262 ed E46 / 1190) nell'Australia occidentale . Tra i punti salienti, 17 dei 32 campioni di sedimenti di flusso avevano oro visibile nel panning, mentre due dei siti di campionamento del 2019 (19PST22 e 19PST32) avevano oro visibile in più campioni di sedimenti di flusso di follow-up e i campioni 20PST04 e 20PST24 hanno restituito 13 e 11 grani rispettivamente da pan. Mick Billing, presidente esecutivo di Thor Mining, ha commentato: “Questo sembra essere un follow-up di grande successo, al precedente, molto riuscito programma di campionamento”.

() Ha annunciato che l'ufficio brevetti e marchi degli Stati Uniti (USPTO) ha completato l'esame della domanda di brevetto dell'azienda (14 / 379.239), intitolata: “Profilo fenotipico delle cellule progenitrici retiniche umane” e ha emesso una notifica di indennità per l'emissione di un brevetto. In una dichiarazione, il leader globale con sede nel Regno Unito nello sviluppo di terapie a base cellulare ha affermato che il brevetto consentito protegge la composizione del candidato terapeutico a base di cellule hRPC dell'azienda per le malattie della retina, coltivato in condizioni specifiche per migliorare la funzione e identificabile dalla presenza e assenza di marcatori di superficie cellulare specifici. Questa notifica di indennità negli Stati Uniti aggiunge ulteriore protezione della proprietà intellettuale alla tecnologia hRPC, che ha già una protezione brevettuale in numerosi altri grandi territori tra cui Europa, Giappone e Australia.

() ha aggiornato gli investitori sullo stato di avanzamento del suo programma di cura della pelle cosmetica e di una sperimentazione sull'integratore alimentare della psoriasi. La società quotata AIM ha dichiarato che Sederma, il suo partner nel programma di cosmetici e una divisione di (), ha replicato con successo il processo di produzione del lisato e ha ottenuto le stesse prestazioni dalla tecnologia SkinBiotix dell'azienda e ora sta lavorando per convalidare un ridimensionamento del processo di produzione a diversi livelli di volume. Nel frattempo, l'azienda ha dichiarato alla luce delle attuali restrizioni sugli studi sull'uomo non correlati al coronavirus, ha stabilito un protocollo per la sua sperimentazione di integratori alimentari “autogestiti” sulla psoriasi e sta procedendo con lo studio.

Impax Environmental Markets PLC (LON: IEX) ha rivelato giovedì che dovrà pagare un primo dividendo provvisorio per l'esercizio 2020 di 1,3 p per azione ordinaria e ha dichiarato che è intenzione del suo consiglio dichiarare un finale, o un secondo , dividendo verso la fine del primo trimestre del 2021. In una dichiarazione rilasciata dopo la chiusura del mercato di Londra, IEX ha affermato che per essere equi con tutti gli azionisti e in seguito a una considerazione analoga del pagamento del dividendo (singolo) dell'anno scorso come piuttosto che una finale successiva, il consiglio ha deciso che d'ora in poi dichiarerà un dividendo provvisorio nella fase semestrale, con un secondo dividendo pagabile dopo la fine dell'anno.

Holdings PLC () ha annunciato che l'European Respiratory Journal – un'importante pubblicazione scientifica incentrata sulla malattia polmonare e rivista di punta della European Respiratory Society – ha pubblicato i risultati peer-reviewed dal trial Early diagnosi of Cancer of the Lung Scotland (ECLS) . Il processo è stato consegnato dalle Università di Dundee e St Andrews con il NHS Tayside e cofinanziato dal Chief Scientist Office scozzese e dal governo scozzese. Il principale gruppo globale di immunodiagnostici ha affermato che l'articolo intitolato “Diagnosi precoce del carcinoma polmonare in uno studio randomizzato su un esame del sangue con autoanticorpi seguito da imaging” – che è ora disponibile online e sarà replicato prima del terzo trimestre 2020 – valuta l'efficacia di EarlyCDT di Oncimmune Test polmonare nel ridurre l'incidenza dei pazienti che presentano diagnosi di carcinoma polmonare in fase avanzata.

() ha riferito che le sue vendite da inizio anno e il suo portafoglio ordini confermato sono ora superiori a £ 4 mln a seguito della firma di due accordi di fornitura nel suo primo trimestre. In un aggiornamento sugli attuali risultati di trading che accompagnano l'esercizio chiuso al 31 marzo 2020, l'azienda di biomateriali e di farmaci rigenerativi ha anche registrato entrate per £ 900.000 nel suo primo trimestre, aiutata da una riduzione dell'impatto del coronavirus nel quarto trimestre del anno precedente, nonché un saldo in contanti alla fine del periodo di £ 1,6 mln. Per l'anno precedente, Collagen ha registrato ricavi per £ 4,46 mln, in calo dell'1% su base annua, insieme a una perdita ante imposte di £ 2,06 mln rispetto a £ 1,79 mln dell'anno precedente.

() ha ampliato il suo braccio di costruzione con la sua quarta acquisizione del 2020. GS Contracts (Joinery) Limited, specialista in ospitalità di alto livello e lavori di allestimento al dettaglio, si è unito al gruppo per un corrispettivo di £ 1,7 mln di banconote convertibili e obbligazioni. Il pagamento include l'acquisizione di una proprietà commerciale del valore di circa 0,8 mln di sterline poiché GS Contracts porta i propri impianti di produzione interni.

() ha dichiarato di aver completato la vendita del suo impianto di produzione di vaccini a Braintree nel Regno Unito alla cellula e terapia genica Catapult per £ 16 mln in contanti. Lo specialista dell'acquacoltura ha dichiarato che la vendita fa parte di un investimento di £ 100 mln da parte del governo del Regno Unito per sviluppare il Centro di innovazione per la produzione di catapulta per terapia cellulare e genica per produrre milioni di dosi di vaccini al coronavirus al mese.

() () (OTCQB: NQMIY) ha dichiarato che è “ottimista” per le sue prospettive che vanno avanti dopo aver segnalato la produzione in aumento dalla sua miniera di Hellyer nella prima parte del 2020. In una dichiarazione prospettica che accompagna i suoi risultati per l'anno conclusosi il 31 dicembre 2019 , la società ha riferito che nel primo trimestre del 2020 ha prodotto 8.127 tonnellate di concentrato di piombo, rispetto a 4.712 di un anno fa, mentre il concentrato di zinco è salito a 4.609 tonnellate da 3.015.

European Metals Holdings Limited (LON: EMH) (ASX: EMH) ha messo in evidenza i “continui progressi” nel suo progetto Cinovec al litio e stagno in Repubblica Ceca. In un aggiornamento per i tre mesi chiusi al 30 giugno 2020, la società quotata AIM ha dichiarato durante il periodo un investimento di € 29,1 mln in Cinovec da parte del gruppo CEZ conglomerato e il lavoro di progetto inizierà immediatamente, mentre un permesso preliminare di mining per il progetto è stato concesso anche per la parte orientale del deposito per otto anni. La società sta inoltre discutendo con la Borsa di Praga in merito a una proposta di quotazione, aggiungendo che ha anche organizzato un meccanismo di finanziamento intermedio per aiutare a finanziare nuove iniziative per le operazioni in corso.

PLC (), la società di esplorazione e sviluppo dell'oro focalizzata su Irlanda e Finlandia, ha dichiarato di aver ricevuto un avviso per esercitare warrant per la sottoscrizione di 1.358.333 azioni ordinarie al prezzo di 16 p per azione ordinaria per le quali sono stati ricevuti fondi di £ 217.333 azienda. I warrant sono stati emessi nell'ambito della collocazione e sottoscrizione di nuove azioni ordinarie annunciate il 18 febbraio 2020. Il gruppo ha aggiunto che i proventi dell'esercizio dei warrant saranno utilizzati a fini di capitale circolante generale.

(), una società che investe in risorse naturali, ha annunciato la nomina del gruppo REYL per supportare la società nello sviluppo e nel finanziamento di progetti energetici in Nigeria e Africa occidentale. Il gruppo REYL è un gruppo bancario con sede a Ginevra che gestisce un patrimonio di oltre 13,5 miliardi di franchi svizzeri. Il gruppo REYL fornirà consulenza ad ADM sulle strutture finanziarie per progetti futuri, tra cui l'acquisizione della partecipazione in OML113 da EER (Colobus) Nigeria Limited, annunciata il 24 febbraio 2020, e qualsiasi accordo successivo con Trafigura Pte Ltd ai sensi del memorandum d'intesa firmato con Trafigura il 3 febbraio 2020.

() ha dichiarato di aver ricevuto la notifica il 31 luglio 2020, che il suo direttore finanziario, David Steel, ha acquistato 75.000 azioni ordinarie della società al prezzo di 12 pesche in quella data. A seguito di questa acquisizione, il gruppo ha osservato che Steel detiene una partecipazione in 1.526.741 azioni ordinarie Enteq, che rappresentano circa il 2,3% del capitale ordinario emesso dalla società.

(), la società indipendente di produzione, sviluppo ed esplorazione di petrolio e gas focalizzata sulla Nigeria, ha annunciato la nomina di Allenby come consigliere nominato e broker congiunto della società con effetto immediato. Ha inoltre affermato che, in seguito all'acquisizione di Whitman Howard Limited da parte di Panmure Gordon & Co, ha nominato Panmure Gordon come altro broker congiunto con effetto immediato.

(), specialisti nell'esplorazione e produzione di iodio e produttori di prodotti chimici speciali, ha annunciato il lancio del suo nuovo sito Web aziendale all'indirizzo www.iofina.com. Il sito Web includerà le informazioni attuali per clienti e investitori, sarà mobile e tablet e sarà continuamente migliorato e aggiornato.

(), la società di esplorazione e sviluppo mineraria focalizzata sul suo progetto Bougouni al litio nel sud del Mali, ha annunciato che la sua assemblea generale annuale (AGM) si terrà alle 12:00 del 27 agosto 2020, a Prince Frederick House, 35-39 Maddox Street, London W15 2PP. A seguito delle attuali misure attuate dal governo del Regno Unito, gli azionisti non saranno autorizzati a partecipare all'Assemblea generale, ma sono fortemente incoraggiati a presentare i propri voti per delega il più presto possibile. La società ha dichiarato che intende tenere un webcast per gli azionisti dopo l'AGM sotto forma di presentazione seguita da domande e risposte. Ulteriori dettagli saranno comunicati a tempo debito.

finnCap Group PLC () ha annunciato che l'assemblea generale annuale (AGM) si terrà presso la sede legale della società, 1 Bartholomew Close, Londra EC1A 7BL lunedì, 21 settembre 2020. Si prevede di tenere l'AGM come riunione chiusa e gli azionisti non sono autorizzati a partecipare, a causa dell'attuale pandemia di coronavirus (COVID-19). Ciò premesso, gli azionisti sono fortemente incoraggiati a votare per delega in anticipo rispetto all'Assemblea.

() ha registrato una forte riduzione delle perdite per l'intero anno insieme agli utili sulle sue attività finanziarie. Per l'esercizio chiuso al 31 dicembre 2019, la società di investimento e consulenza blockchain ha registrato una perdita al lordo delle imposte di £ 258.943, ridotta da £ 982.034 dell'anno precedente, mentre ha anche prodotto un guadagno netto di valore equo sulle sue attività finanziarie di £ 572.805 rispetto a una perdita di £ 188.781 nel 2018.

() ha raggiunto un profitto nell'ultimo anno intero a seguito di una ripresa degli utili dei suoi investimenti digitali. Per l'anno conclusosi il 31 dicembre 2019, l'investitore in criptovaluta e blockchain ha registrato un profitto per l'anno di £ 1,33 mln rispetto a una perdita di £ 8,34 mln dell'anno precedente, rafforzato da un guadagno non realizzato di £ 2,05 mln sugli investimenti digitali rispetto a un Perdita di £ 12,7 mln nel 2018.

() ha evidenziato un nuovo rapporto trimestrale sulle attività che è stato pubblicato da (), una società in cui Metal Tiger detiene una partecipazione di circa il 18,8%. “Questo è stato un trimestre forte per Cobre, con la perforazione in corso nel progetto Perrinvale, che ha dato risultati significativi in ​​rame-oro di alta qualità”, ha affermato Michael McNeilly, amministratore delegato di Metal Tiger. Separatamente, la società ha anche stipulato un ulteriore accordo di finanziamento collettivo in derivati ​​azionari in relazione alla sua partecipazione in Sandfire Resources ().

Inc. () () ha visto le sue azioni iniziare a negoziare sul mercato AIM della Borsa di Londra alle 8000 del mattino di venerdì con il ticker AEXG. Il debutto AIM della società indipendente dell'oro con un portafoglio di licenze d'oro in Groenlandia ha fatto seguito a una raccolta di fondi che comprendeva un collocamento e sottoscrizioni dirette per un totale di 94.444.445 nuove azioni ordinarie al prezzo di 45 pence per azione o 77 centesimi canadesi per azione, sollevando un ricavo lordo di £ 42,5 milioni (C $ 72,7 milioni), con le nuove azioni rappresentano il 53,3% del capitale sociale allargato della società. ha inoltre annunciato che Sigurbjorn (Siggi) Thorkelsson è entrato a far parte del consiglio di amministrazione come amministratore indipendente non esecutivo e presidente del Comitato di revisione contabile il 27 luglio 2020.

(ha affermato che il pagamento del dividendo finale previsto di 6,89 p per l'anno conclusosi il 29 febbraio 2020, mediante emissione di bonus, è stato ampiamente approvato dagli azionisti nell'assemblea ordinaria della società il 21 luglio 2020. La società ha annunciato oggi che il prezzo delle azioni di riferimento per l'emissione di bonus è di 216.80p. Le azioni di emissione di bonus saranno emesse e ammesse alla negoziazione il 28 agosto 2020. A seguito dell'avviso di AGM, non verrà emessa alcuna frazione di azione di emissione di bonus.

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  • FTSE 100 index tumbles 92 points at the close
  • Gold holds near record highs
  • IAG confirms massive rights issue
  • Wall Street gets off to mixed start

5.10pm: Footsie loses 92 points on the day

The FTSE 100 erased any gains to end at 10-week lows on Friday after Britain postponed the easing of a coronavirus-induced lockdown thanks to surging cases in the country.

The UK’s blue-chip index lost 1.5% at the closing bell to finish at 5,898 — a 92-point loss.

“The UK’s move away from further easing of lockdowns… put bullish sentiment on the back foot, and further reduced the desire to move back into stocks at month end,” said Chris Beauchamp, chief market analyst at IG on Friday.

US/Canada 5pm/12pm EST

Stocks were mixed on Wall Street, with the big tech firms leading the Nasdaq into positive territory at the midday point.

The Dow Jones was down 177 points at 26,137, while the S&P 500 lost 12 points at 3,234. Only the Nasdaq was in the green, up nearly 33 points at 10,620.

Proactive NA headlines

Inc (NASDAQ:HUGE) (CSE:HUGE.CN) announces US$10 million registered direct offering as it advances FSD201 as possible COVID-19 treatment

Noble repeats Outperform rating on Newrange Gold Corp () (OTCQB:NRGOF) following positive drilling results at Pamlico gold project

Ltd () gets FDA approval to start Phase 3 of possible COVID-19 treatment Bucillamine

Karora Resources Inc (), formerly known as RNC Minerals Corp (TSE:RNX) says share consolidation effective as the market opens on Friday

Cannabis One Holdings Inc () (OTCMKTS:CAAOF) announces strategic rebrand to INDVR Brands to put the spotlight on its cannabis distribution model

Conscience Capital Inc (CVE:DGTL.P) announces name change to DGTL Holdings Inc, commencement of trading on TSX Venture Exchange

TIMIA Capital Corporation () () swings to profit in 2Q thanks to growing fintech portfolio of SaaS companies

() () submits Statistical Analysis Plan to FDA for TRILOGY 2 Phase 3 trial of flagship drug CaPre

Loop Insights Inc () (OCTMKTS:VRZPF) accelerates discussions with schools across North America to implement contact tracing solution prior to reopening

3.55pm: Footsie flops and

London and Wall Street blue chips are extending their falls, apart from the big US tech stocks.

The FTSE 100 has taken a further leg lower as investors digest the newly cautious stance from the UK government about the coronavirus and worsening US economic data.

Down 70 points or 1.2% to 5,919, the Footsie is on course for almost a 4% decline for the month of July.

After a renewed lockdown was announced for a large part of northern England overnight, today PM Boris Johnson warned the country “cannot be complacent” about the coronavirus.

This came as the Office for National Statistics said that the prevalence of COVID-19 in the community is likely to be rising in the country for the first time since May, while the Sage advisory group said it “does not have confidence that R (the reproduction rate of the virus) is currently below 1 in England”.

Feeling that a new slogan might try and help matters, Johnson unveiled a strapline for his Downing Street podium: “hands, face, space”.

This is designed to encourage the public to wash their hands assiduously, wear face masks and maintain suitable space between themselves and others.

Meanwhile, across the Atlantic, the Dow and the S&P are both in the red now, though tera-caps of Apple and Amazon are helping keep the Nasdaq above water, though earlier gains have been cut.

“The market’s attempt at a rebound was all but gone by Friday afternoon, the Western indices wilting in the face of a two-day GDP reality check,” said Connor Campbell, market analyst at .

Looking at the Footsie he noted the UK index is trading levels last seen in the middle of May.

“Though it has been erring lower for the past couple of weeks, it is the losses encountered on Thursday and Friday that really did the damage. And this is even before the UK is served its own Q2 GDP damnation.”

European stocks have outperformed the US and UK, despite the region recording a record contraction in economic growth for the second quarter.

3pm: Mixed start for US stocks

Wall Street stocks have made a mixed start, though tech stocks are rattling higher after knockout earnings numbers from some of the big names.

The Dow Jones had dropped in the negative territory in early trading, falling 0.2% to 26,268, while the tech-fuelled Nasdaq Composite shot up 1% to above 10,700 and the S&P 500 was somewhere in between with a 0.2% rise.

Apple () has climbed 6% to add several more billion dollars to its valuations, while Amazon () was up 4% and Facebook () surged 7% after their earnings reports overnight.

A small torrent of US economic data added to the uncertain vibe, with some of it better than expected and some worse.

Personal income fell and spending slowed in June, according to the Bureau of Economic Analysis, and that month was before the past month’s resurgence in coronavirus cases.

Household income fell 1.1% in June compared to the prior month, worse than the 0.8% economists expected, while consumer spending rose 5.6%, which was down from the 8.5% improvement in May, although slightly better than forecast.

This comes a day after initial jobless claims rose for the second consecutive week and US gross domestic product in the second quarter was shown to have collapsed 32.9% year-on-year — the worst fall on record — though this roughly equates to a true second-quarter decline of nearer 9% on a quarterly basis.

Back in London, the FTSE 100 has extended its decline, dropping 28 points or 0.5% to 5,961.86.

A softer dollar, leading to the pound being up 0.5% at 1.3161 is not helping many UK blue chips.

12.45pm: PM says reopening must slow

The FTSE is meandering lower but not by much, despite a warning from Prime Minister Boris Johnson that the UK needs to slow the reopening of the economy.

Now is the time to “squeeze that brake pedal in order to keep that virus under control”, he said, reversing the previous decision to allow the reopening of leisure businesses including casinos and bowling alleys.

This would seem to put the kibosh on hopes for a V-shaped recovery for the UK and put a definite dent in the shares of Hollywood Bowl ().

These previously planned opening-up measures, including allowing certain beauty treatments to resume, will be postponed until at least August 15, Downing Street said.

The FTSE has fallen 11 points to 5,978.73.

Looking across the pond, traders at IG were calling the Dow Jones around 64 points higher ahead of the open.

This follows knockout numbers from Facebook (), Apple () and Amazon () overnight.

“With this unprecedented pandemic causing a near-term consumer/enterprise spending abyss, the FAANG names have been viewed as relative safety blankets in this scary Category 5 storm”, said broker Wedbush.

Analysts at the US broker said they believed the tech stocks “could still go another 20%-30% higher” (Read more here).

11.59am: Blue chips into the red

London’s blue chip benchmark has dropped into negative territory for the day, led lower by a mix of companies.

The Footsie has lost eight points or 0.1% to 5,981.71, with British Airways owner IAG () and host of other consumer-focused corporations among the big losers.

This includes media groups ITV () and WPP (), bookies GVC () and Flutter (), hotels group Whitbread (), along with BT (), () and Diageo (), offering internet, fags and booze, perhaps the modern trio of home comforts.

The dollar has also resumed its move lower after gains the previous day, with market analyst David Madden at CMC Markets saying this comes as dealers are “back in risk-on mode”.

Having yesterday appeared to act as a safe haven asset, the new move lower again “underlines the sour sentiment surrounding the currency”, said Madden.

This has benefitted the pound, which creates headwinds for the many overseas earners on the FTSE 100.

10.50am: Footsie flattens off

The FTSE 100 has given up almost all of its early gains now, dropping below the 6,000 mark with just 4 points added for the day at 5,994.

If the session finished around that level it would mean the month has seen a 2.8% loss and down more than 7% since early June and 22% since January’s highest point.

“July has been a second bad month in a row for investors in UK stocks with the FTSE 100 index now trading at lows last seen in late-May,” noted Russ Mould, investment director at AJ Bell.

“The market has most certainly lost momentum and is slowly drifting down as many companies continue to struggle from the pandemic.”

Tobacco, banks and media have been the three worst performing sectors on the LSE in July, with gains for NatWest () and British American Tobacco (LON:BAT) slight gains on the back of results today making hardly a difference.

Following the hefty provisions for bad debts announced by several of its peers earlier in the week, amid worsening expectations for the economy, NatWest guided full-year impairment charges of £3.5-4.5bn.

“Interestingly, it said customer deposits increased by £39.1bn in the first-half period to £408.3bn,” observed Mould.

“This is probably as a result of lower spending and people taking steps to have back-up cash in case of emergencies or a change in their circumstances.

While NatWest’s shares advanced, Mould said “this must be seen in the context of a big sell-off earlier this week following gloomy updates from other listed banks”.

Over at BAT, the shares is only just in positive territory this morning after its first-half earnings per share number came in 3% below expectations but full year guidance was held.

10.25am: European economic growth crashes

European and UK shares are remaining in positive territory but coming off their highs after Eurozone gross domestic product fell by 12.1% in the second quarter of the year compared to the first

The shrinking in the eurozone economy was the largest since the bloc was founded, but only slightly worse than the 12% forecast by economists.

“Some records are never to be beaten,” said Bert Colijn, ING senior economist. “Think of Alan Shearer’s Premier League goals, Wilt Chamberlain’s 100 point basketball game, Eddy Merckx’s victories in cycling. The second quarter eurozone GDP figure should probably go on that list as well; it would be great if it were never to be beaten.

“The -12.1% quarter-on-quarter growth rate is the worst ever recorded and a pretty difficult one to interpret. It is a shocking drop, but completely understandable as the economy was shut for a considerable period during the quarter.

“It, therefore, doesn’t tell us all that much about the general state of the economy, which is usually why one would look at GDP figures in the first place.

“Still, the deeper the lockdown, the higher the chance of more significant lasting damage to the economy and therefore the extent of the decline is still relevant.”

10am: House prices crash looks unlikely

The FTSE 100 has faltered slightly but remains in positive territory, up 15 points or 0.3% to 6,005, with support coming from a traditional end-of-month buying by funds and housebuilding companies after some positive news on house prices.

House prices rose by 1.7% in July compared to the month before, according to building society Nationwide, which more than reversed a 1.6% fall in June.

On an annual basis, prices are now up 1.5%, gaining ground from the negative figure of 0.1% seen the previous month.

“Along with the pickup in lending in June, this reinforces our view that a house price crash is now unlikely,” said Hansen Lu at .

“Although, with the mortgage holiday and furlough schemes due to end soon, further modest price falls may still be on the horizon.”

Among the builders, blue chip  () was a strong gainer, up more than 1%, while rivals including Barratt () and () were enjoying smaller gains.

The positive tone in markets was helped by “end of the month recovery mode”, said market analyst Connor Campbell at , more noticeably over in the continent.

“As ever during this pandemic, the reasons behind Friday’s gains feel quite arbitrary, almost counterintuitive. After all, investors have woken up to a 13.8% second quarter collapse in France, wiping out 18 years’ worth of growth, a worse than forecast 18.5% contraction in Spain, and a 12.4% fall in Italy.”

The UK is also shrugging off a new lockdown announced overnight by the government to cover swathes of Greater Manchester, East and West Yorkshire.

“And yet, in part thanks to some blockbuster earnings from the likes of Apple and Amazon, and solid updates from Facebook and Alphabet, the tone of trading was positive,” Campbell said.

8.55am: Friday starts positively

Traders cast aside their coronavirus worries as the FTSE 100 opened in positive territory.

The index of UK blue-chip shares rose 35 points to 6,025.69.

Still, underlying concerns about the fragile state of the world economy reheated the gold price, which was bubbling around US$1,975 an ounce.

Remember, the yellow metal acts as a haven investment in times of turmoil, so the fact it is nearing record territory underlines the market’s skittish mood.

What does Roman Abramovich know about the gold price?

On the eve of his team’s appearance in the FA Cup final, Russian billionaire Roman Abramovich has, according to Bloomberg, decided to offload his shares in Highland Gold Mining ().

The proceeds may help fund Chelsea manager Frank Lampard’s future forays into the transfer market.

Elsewhere, the big, but expected, news was provided by British Airways owner IAG (), which fell 5.8% after the announcement of its long-mooted £2.5bn rights issue. The carrier also warned that international travel was unlikely to recover until 2023.

After delivering a seemingly gloomy message as it significantly increased bad debt provisions, NatWest () found itself in the list of risers with a 2.2% gain. Much of that was a recovery from Thursday’s sector-wide sell-off prompted by the rather grim update from Lloyds ().

Proactive news headlines:

(LON:TILS, ) has submitted a patent application covering the potential use of nasally-administered and orally taken Foralumab for the treatment of COVID-19 either alone or in combination with other antiviral drugs. The methods of delivering the fully human anti-CD3 monoclonal antibody (mAb) could potentially modulate or stimulate the immune system to suppress cytokine storms and therefore reduce respiratory failure in coronavirus patients, the company said. Its researchers believe its combination with other anti-viral drugs could improve efficacy.

() (ASX:THR) has revealed that there is visible gold from sample panning of the second phase of gold, nickel, and chromium geochemical sampling at the 100% owned Pilbara Goldfield tenements (E46/1262 and E46/1190) in Western Australia. Among the highlights, 17 of the 32 stream sediment samples had visible gold in panning, while two of the 2019 sample sites (19PST22 and 19PST32) had visible gold in multiple follow-up stream sediment samples, and samples 20PST04 and 20PST24 returned 13 and 11 grains respectively from panning. Mick Billing, Thor Mining’s executive chairman commented: “This appears to be a highly successful follow up, to the previous, very successful, sampling program.”

()  has announced that the US Patent and Trademark office (USPTO) has completed its examination of the company’s patent application (14/379,239), entitled: “Phenotype profile of human retinal progenitor cells” and has issued a notification of allowance for the issuance of a patent. In a statement, the UK-based global leader in the development of cell-based therapeutics said the allowed patent protects the composition of the company’s hRPC cell-based therapeutic candidate for retinal diseases, cultured under specific conditions to enhance function and identifiable by the presence and absence of specific cell surface markers. This notification of allowance in the US adds further intellectual property protection to the hRPC technology, which already has patent protection in a number of other major territories including Europe, Japan and Australia, it added.

() has updated investors on the progress of its cosmetic skincare programme and a psoriasis food supplement trial. The AIM-listed firm said Sederma, its partner in the cosmetics programme and a division of (), has successfully replicated the lysate manufacturing process and achieved the same performance from the company’s SkinBiotix technology and is now working to validate a scale-up of the manufacturing process at different volume levels. Meanwhile, the firm said in light of current restrictions on non-coronavirus related human studies, it has established a protocol for its ‘ self-managed’ psoriasis food supplement trial and was proceeding with the study.

Impax Environmental Markets PLC (LON:IEX) revealed on Thursday that it is to pay a first interim dividend for the 2020 financial year of 1.3p per ordinary share, and said it is the intention of its board to declare a final, or second interim, dividend towards the end of the first quarter of 2021. In a statement released after the London market close, IEX said that in order to be equitable to all shareholders, and following a similar consideration of paying last year’s (single) dividend as an interim rather than a later final, the board has decided that henceforth it will declare an interim dividend at the half-year stage, with a second dividend payable after the year-end.

Holdings PLC () has announced that The European Respiratory Journal – a leading lung disease-focused scientific publication and flagship journal of the European Respiratory Society – has published the peer-reviewed results from the Early detection of Cancer of the Lung Scotland (ECLS) trial. The trial was delivered by the Universities of Dundee and St Andrews with NHS Tayside, and co-funded by , the Scottish Chief Scientist Office and the Scottish Government. The leading global immunodiagnostics group said the paper titled ‘Earlier diagnosis of lung cancer in a randomised trial of an autoantibody blood test followed by imaging’ – which is now available online and will be replicated in print before Q3 2020 – evaluates the effectiveness of ‘s EarlyCDT Lung test in reducing the incidence of patients presenting with late-stage lung cancer at diagnosis.

() has reported that its year-to-date sales plus its confirmed order book are now over £4mln following the signing of two supply agreements in its first quarter. In an update on current trading accompanying results for the year ended March 31, 2020, the biomaterials and regenerative medicines firm also reported revenue of £900,000 for its first quarter, helped by a reduction in the impact of coronavirus experienced in the fourth quarter of the prior year, as well as a cash balance at the end of the period of £1.6mln. For the prior year, Collagen reported revenues of £4.46mln, down 1% year-on-year, alongside a pre-tax loss of £2.06mln compared to £1.79mln in the prior year.

() has expanded its construction arm with its fourth acquisition of 2020. GS Contracts (Joinery) Limited, a specialist in high-end hospitality and retail fit-out work, has joined the group for a consideration of £1.7mln in convertible notes and bonds. The payment includes the acquisition of a commercial property worth roughly £0.8mln as GS Contracts brings their own in-house production facilities.

() () (OTCQB:NQMIY) said it is “optimistic” for its prospects moving forward after reporting rising production from its Hellyer mine in the first part of 2020. In an outlook statement accompanying its results for the year ended December 31, 2019, the company reported that in the first quarter of 2020 it produced 8,127 tonnes of lead concentrate, up from 4,712 a year ago, while zinc concentrate rose to 4,609 tonnes from 3,015.

European Metals Holdings Limited (LON:EMH) (ASX:EMH) has highlighted “continued progress” at its Cinovec lithium and tin project in Czechia. In an update for the three months ended June 30, 2020, the AIM-listed firm said during the period a €29.1mln investment in Cinovec by conglomerate CEZ Group was completed and project work will commence immediately, while a preliminary mining permit for the project has also been granted relating to the eastern part of the deposit for eight years. The company is also in discussions with the Prague Stock Exchange regarding a proposed listing, adding that it has also arranged an interim funding facility to assist in financing new initiatives for ongoing operations.

PLC (), the gold exploration and development company focused on Ireland and Finland, said it has received a notice to exercise warrants to subscribe for 1,358,333 ordinary shares at a price of 16p per ordinary share for which funds of £217,333 have been received by the company. The warrants were issued as part of the placing and subscription for new ordinary shares announced on February 18, 2020. The group added that proceeds from the exercise of the warrants will be used for general working capital purposes.

(), the independent oil and gas production, development and exploration company focused on Nigeria, has announced the appointment of Allenby as the company’s nominated adviser and joint broker with immediate effect. It also said that, following the acquisition of Whitman Howard Limited by Panmure Gordon & Co, it has appointed Panmure Gordon as its other joint broker with immediate effect.

(), specialists in the exploration and production of iodine and manufacturers of specialty chemical products, has announced the launch of its new corporate website at www.iofina.com. The website will include current information for customers and investors, be mobile and tablet friendly, and will be continuously improved and updated.

(), the mineral exploration and development company focused on its Bougouni Lithium Project in southern Mali, has announced that it’s annual general meeting (AGM) will be held at 12.00pm on August 27, 2020, at Prince Frederick House, 35-39 Maddox Street, London W15 2PP. As a consequence of the current measures implemented by the UK Government, shareholders will not be permitted to attend the AGM but are strongly encouraged to submit their votes by proxy as soon as possible. The company said it is intending to hold a webcast for shareholders after the AGM in the form of a presentation followed by Q&As.  Further details will be announced in due course.

6.50am: Tick up seen after plunge

The FTSE 100 index is expected to open higher on Friday, consolidating after the previous session’s sharp falls as US and Asian markets also remain on tenterhooks amid worries over a second wave of the coronavirus outbreak but with some upbeat earnings from US tech giants providing underlying support.

Spread betting firm CMC Markets expects the blue-chip index to open around 18 points higher at 6,008, having dived by 114.87 points on Thursday to end at 5,989.99.

Overnight in New York, the Dow Jones Industrials Average closed down over 225 points, or 0.9% at 26,313.65, while the broader S&P 500 index shed 0.4%.

But the Nasdaq Composite managed to gain 0.4% with all eyes on a trio of results from West coast-based tech giants Apple Inc (), Amazon Inc (), and () which were released after the close in New York.

This Nasdaq optimism turned out to be well-founded as Apple, Amazon and Facebook all smashed expectations with their latest quarterly numbers. Apple also announced a 4 for 1 stock split, while posting its best-ever Q3 performance noted CMC Markets (UK) senior analyst Michael Hewson.

“These impressive results will only serve to widen the divide between these huge tech behemoths and the rest of the underlying US market; however, they look set to ensure that US markets start the last day of the week and the month higher when they open later today.”

However, he added: “The same can’t be said for today’s Asia session which has seen a big fall in the Nikkei 225, which appears to have taken its cues from the weaker than expected US jobless claims data, amidst concerns over a second wave. The latest China manufacturing and services PMI numbers for July were a mixed bag, with a modest increase in manufacturing PMI to 51.1, however, services softened a little to 54.2.”

Overall Asian stock markets were mixed on Friday, Japan’s Nikkei 225 nursing a 2.3% drop and China’s blue-chip Shanghai index down 0.3%, but Hong Kong’s Hang Seng index edged 0.1% higher.

European GDP, UK blue-chip earnings flow

CMC’s Hewson continued: “European markets certainly don’t look like they will see much of a benefit from last night’s blow out US tech earnings, after yesterday’s sharp falls, with today’s main focus set to be on the release of the first iterations of France Q2 GDP, which is expected to see a contraction of -15.2%, Italy Q2 GDP, a -15.5% contraction, Spain a -16.6% contraction and EU Q2 GDP -12.1%.

“None of these numbers should be viewed with too much surprise, but they will still be viewed through a lens of how much of this lost activity can be pulled back by the end of the year.”

“Given the concerns about rising infection rates, travel bans, lockdowns and quarantines that are being imposed there is a concern that we could see further economic downside to some of the annualised GDP estimates, unless these virus spikes are stamped out,” Hewson concluded.

Aside from the European data, even though it might be the end of a busy week, the UK corporate results spigot is hardly slowing, with another big batch of blue-chip updates on the agenda, including trading announcements: () and (), and interim results from PLC (), SA (), (), () and PLC ().

Around the markets:

  • Sterling: US$1.3128, down 0.1%
  • Gold: US$1,962.60 an ounce, up 0.1%
  • Brent crude: US$43.14 a barrel, up 0.5%

6.45am: Early Markets – Asia/Australia

Stocks in the Asia Pacific were mixed today following a record fall in US GDP in the second quarter.

Japanese stocks led losses among Asia’s major markets, with the Nikkei 225 down 2.24%. In China, the Shanghai Composite gained 0.3%.

The S&P/ASX 200 in Australia lost 2.47% by 4 pm as the big miners, banks, and energy firms sagged.

READ OUR ASX REPORT FOR MORE INFORMATION

Proactive Australia news:

() continues mining and processing at Thalanga Base Metals Operation in Northern Queensland while it accelerates restart activities at Hillgrove Gold Project in New South Wales.

() is encouraged by gold results of up to 58.4 g/t from rock chip samples which confirm that the Bryah West Project north of Meekatharra in central Western Australia has “significant exploration potential”.

() is higher after intersecting wide zones of good to high-grade gold in fresh rock in the first five diamond holes at NE Bankan within the flagship Kaninko Gold Project in Guinea.

() has started diamond drilling in the first-ever drill campaign at Last Chance gold target, which is part of the wider Red Mountain Project in central Alaska.

Arafura Resources Limited () has had Major Project Status (MPS) for the 100%-owned Nolans Neodymium-Praseodymium (NdPr) Project in the Northern Territory renewed for a further three years by the Australian Government.

Auteco Minerals Ltd () (OTCMKTS:MNXMF) is advancing its strategy to upgrade the gold inventory at its Pickle Crow project in Ontario, Canada, with the arrival of a second rig and the setting up of a 24-person camp for year-round exploration.

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Le azioni di SmartSpace Software PLC () sono aumentate vertiginosamente dopo che il gigante delle infrastrutture informatiche ha dichiarato che avrebbe iniziato a rivendere il software di tracciamento dei contatti sul luogo di lavoro della società quotata AIM e il software di social distance

SmartSpace, che un tempo si chiamava, e il gruppo FTSE 250 hanno firmato un accordo di distribuzione per quest'ultimo per rivendere il software di gestione dello spazio di lavoro Space Connect, che si dice includa “una gamma di soluzioni per supportare il tuo ufficio di ritorno sul posto di lavoro” come parte della sua nuova funzionalità Covid-19.

Lo specialista del software di “gestione dello spazio” ha anche fornito un aggiornamento commerciale che ha rivelato una relazione allargata con una banca standard, nuovi contratti con uno studio legale internazionale e un'agenzia di stampa internazionale, oltre a notizie che c'erano £ 1,7 mln di liquidità netta in banca.

Le azioni di SmartSpace, che sono scese di oltre il 90% negli ultimi tre anni e mezzo a un minimo di 13 p di aprile, sono aumentate del 46% a 50,25 p venerdì pomeriggio.

13.48: Physiomics perde fizz dopo aver confermato l'entità del contratto

Venerdì la società di consulenza per la cura del cancro () è scesa del 12% a 8,22 p nelle negoziazioni pomeridiane venerdì confermando un contratto che aveva precedentemente segnalato.

In effetti, il contratto era stato trombato in anticipo dalla società quotata AIM a maggio, giugno e all'inizio di luglio, contribuendo forse a far avanzare le azioni.

Physiomics ha affermato che lavorerà con un nuovo cliente, il giapponese Astellas Pharma, ma non ha potuto rivelare il valore preciso dell'operazione oltre a dire che è “circa il 20%” del reddito complessivo dell'ultimo anno intero di £ 783.101.

11.28: Pets at Home riceve premi per la fedeltà dei nuovi clienti

() le azioni sono salite del 15% a un massimo di cinque mesi di quasi 300 p, poiché le vendite del rivenditore e del veterinario sono diminuite meno del previsto.

I ricavi sono diminuiti del 13% nelle prime otto settimane del trimestre, prima di recuperare un balzo del 12% nelle successive otto settimane.

I risultati indicano che i nuovi clienti conquistati dal blocco stanno iniziando a diventare fedeli, ha affermato il broker di analisti Peel Hunt (Leggi di più qui).

10.35: Coro Energy canta lamento per il collasso dell'accordo italiano

() gli azionisti avevano probabilmente alzato le braccia in un gesto di delusione per il Mediterraneo dopo che la società aveva concluso un accordo per vendere il suo portafoglio italiano.

Le azioni di Coro, che è italiano per “coro”, sono scese del 17% a 0,34 p in quanto non è stato possibile ottenere l'approvazione normativa italiana prima della scadenza del 31 luglio per concludere l'affare.

L'oliatore quotato AIM ha dichiarato che continuerà a privilegiare la vendita di queste operazioni non core.

9.22: Lansdowne salta quando rivelano i membri del consorzio Barryroe

Le azioni di PLC () sono cresciute del 16% in più rispetto a 1,25 p nelle prime negoziazioni di venerdì, dopo un incoraggiante aggiornamento da parte dei partner del progetto sulla proposta azienda agricola dal giacimento di petrolio e gas di Barryroe, di cui detiene un interesse del 20%.

Il consorzio SpotOn Energy, che è stato rivelato includere i fornitori di servizi Schlumberger e Maersk Drilling, gestirà lo sviluppo di Barryroe una volta concluso l'accordo di distribuzione.

L'amministratore delegato di Lansdowne Steve Boldy ha salutato la composizione del consorzio e ha dichiarato: “Con il consorzio ora in atto, ci concentreremo sulla conclusione di discussioni in merito a un programma di lavoro adeguato e sulla successiva finalizzazione di accordi commerciali per lo sviluppo di Barryroe.”

Altrove, () (ASX: THR) è aumentato del 14% a 0,43 p dopo aver rivelato che ha trovato l'oro visibile dall'ultima fase del panning del campione nei suoi appartamenti Pilbara Goldfield, posseduti al 100%, nell'Australia occidentale.

Tra i punti salienti, 17 dei 32 campioni di sedimenti di flusso avevano oro visibile nel panning, mentre due dei siti di campionamento del 2019 avevano oro visibile in più campioni di sedimenti di flusso di follow-up.

Il presidente esecutivo Mick Billing ha dichiarato: “Trovare oro visibile in più siti in prossimità dei precedenti campioni d'oro è molto incoraggiante”.

Titoli di notizie proattivi:

(LON: TILS,) ha presentato una domanda di brevetto relativa all'uso potenziale di Foralumab somministrato per via nasale e assunto per via orale per il trattamento di COVID-19 da solo o in combinazione con altri farmaci antivirali. I metodi per fornire l'anticorpo monoclonale anti-CD3 completamente umano (mAb) potrebbero potenzialmente modulare o stimolare il sistema immunitario per sopprimere le tempeste di citochine e quindi ridurre l'insufficienza respiratoria nei pazienti con coronavirus, ha affermato la società. I suoi ricercatori ritengono che la sua combinazione con altri farmaci antivirali potrebbe migliorare l'efficacia.

() (ASX: THR) ha rivelato che esiste oro visibile dal campionamento del campione della seconda fase di campionamento geochimico di oro, nichel e cromo presso gli appartamenti Pilbara Goldfield di proprietà al 100% (E46 / 1262 ed E46 / 1190) nell'Australia occidentale . Tra i punti salienti, 17 dei 32 campioni di sedimenti di flusso avevano oro visibile nel panning, mentre due dei siti di campionamento del 2019 (19PST22 e 19PST32) avevano oro visibile in più campioni di sedimenti di flusso di follow-up e i campioni 20PST04 e 20PST24 hanno restituito 13 e 11 grani rispettivamente da pan. Mick Billing, presidente esecutivo di Thor Mining ha commentato: “Questo sembra essere un follow-up di grande successo, al precedente, molto riuscito programma di campionamento”.

() Ha annunciato che l'ufficio brevetti e marchi degli Stati Uniti (USPTO) ha completato l'esame della domanda di brevetto dell'azienda (14 / 379.239), intitolata: “Profilo fenotipico delle cellule progenitrici retiniche umane” e ha emesso una notifica di indennità per l'emissione di un brevetto. In una dichiarazione, il leader globale con sede nel Regno Unito nello sviluppo di terapie a base cellulare ha affermato che il brevetto consentito protegge la composizione del candidato terapeutico a base di cellule hRPC dell'azienda per le malattie della retina, coltivato in condizioni specifiche per migliorare la funzione e identificabile dalla presenza e assenza di marcatori di superficie cellulare specifici. Questa notifica di indennità negli Stati Uniti aggiunge ulteriore protezione della proprietà intellettuale alla tecnologia hRPC, che ha già una protezione brevettuale in numerosi altri grandi territori tra cui Europa, Giappone e Australia.

() ha aggiornato gli investitori sullo stato di avanzamento del suo programma di cura della pelle cosmetica e di una sperimentazione sull'integratore alimentare della psoriasi. La società quotata AIM ha dichiarato che Sederma, il suo partner nel programma di cosmetici e una divisione di (), ha replicato con successo il processo di produzione del lisato e ha ottenuto le stesse prestazioni dalla tecnologia SkinBiotix dell'azienda e ora sta lavorando per convalidare un ridimensionamento del processo di produzione a diversi livelli di volume. Nel frattempo, l'azienda ha dichiarato alla luce delle attuali restrizioni sugli studi sull'uomo non correlati al coronavirus, ha stabilito un protocollo per la sua sperimentazione di integratori alimentari “autogestiti” sulla psoriasi e sta procedendo con lo studio.

Impax Environmental Markets PLC (LON: IEX) ha rivelato giovedì che dovrà pagare un primo dividendo provvisorio per l'esercizio 2020 di 1,3 p per azione ordinaria e ha dichiarato che è intenzione del suo consiglio dichiarare un finale, o un secondo , dividendo verso la fine del primo trimestre del 2021. In una dichiarazione rilasciata dopo la chiusura del mercato di Londra, IEX ha affermato che per essere equi con tutti gli azionisti e in seguito a una considerazione analoga del pagamento del dividendo (singolo) dell'anno scorso come piuttosto che una finale successiva, il consiglio ha deciso che d'ora in poi dichiarerà un dividendo provvisorio nella fase semestrale, con un secondo dividendo pagabile dopo la fine dell'anno.

Holdings PLC () ha annunciato che l'European Respiratory Journal – un'importante pubblicazione scientifica incentrata sulla malattia polmonare e rivista di punta della European Respiratory Society – ha pubblicato i risultati peer-reviewed dal trial Early diagnosi of Cancer of the Lung Scotland (ECLS) . Il processo è stato consegnato dalle Università di Dundee e St Andrews con il NHS Tayside e cofinanziato dal Chief Scientist Office scozzese e dal governo scozzese. Il principale gruppo globale di immunodiagnostici ha affermato che l'articolo intitolato “Diagnosi precoce del carcinoma polmonare in uno studio randomizzato di un esame del sangue con autoanticorpi seguito da imaging” – che è ora disponibile online e sarà replicato in stampa prima del terzo trimestre 2020 – valuta l'efficacia di EarlyCDT Test polmonare nel ridurre l'incidenza dei pazienti che presentano diagnosi di carcinoma polmonare in stadio avanzato.

() ha riferito che le sue vendite da inizio anno e il suo portafoglio ordini confermato sono ora superiori a £ 4 mln a seguito della firma di due accordi di fornitura nel suo primo trimestre. In un aggiornamento sugli attuali risultati di trading che accompagnano l'esercizio chiuso al 31 marzo 2020, l'azienda di biomateriali e di farmaci rigenerativi ha anche registrato entrate per £ 900.000 nel suo primo trimestre, aiutata da una riduzione dell'impatto del coronavirus nel quarto trimestre del anno precedente, nonché un saldo in contanti alla fine del periodo di £ 1,6 mln. Per l'anno precedente, Collagen ha registrato ricavi per £ 4,46 mln, in calo dell'1% su base annua, insieme a una perdita ante imposte di £ 2,06 mln rispetto a £ 1,79 mln dell'anno precedente.

() ha ampliato il suo braccio di costruzione con la sua quarta acquisizione del 2020. GS Contracts (Joinery) Limited, specialista in ospitalità di alto livello e lavori di allestimento al dettaglio, si è unito al gruppo per un corrispettivo di £ 1,7 mln di banconote convertibili e obbligazioni. Il pagamento include l'acquisizione di una proprietà commerciale del valore di circa 0,8 mln di sterline poiché GS Contracts porta i propri impianti di produzione interni.

() () (OTCQB: NQMIY) ha dichiarato che è “ottimista” per le sue prospettive che vanno avanti dopo aver segnalato la produzione in aumento dalla sua miniera di Hellyer nella prima parte del 2020. In una dichiarazione prospettica che accompagna i suoi risultati per l'anno conclusosi il 31 dicembre 2019 , la società ha riferito che nel primo trimestre del 2020 ha prodotto 8.127 tonnellate di concentrato di piombo, rispetto a 4.712 di un anno fa, mentre il concentrato di zinco è salito a 4.609 tonnellate da 3.015.

European Metals Holdings Limited (LON: EMH) (ASX: EMH) ha messo in evidenza i “continui progressi” nel suo progetto Cinovec al litio e stagno in Repubblica Ceca. In un aggiornamento per i tre mesi chiusi al 30 giugno 2020, la società quotata AIM ha dichiarato durante il periodo un investimento di € 29,1 mln in Cinovec da parte del gruppo CEZ conglomerato e il lavoro di progetto inizierà immediatamente, mentre un permesso preliminare di mining per il progetto è stato concesso anche per la parte orientale del deposito per otto anni. La società sta inoltre discutendo con la Borsa di Praga in merito a una proposta di quotazione, aggiungendo che ha anche organizzato un meccanismo di finanziamento intermedio per aiutare a finanziare nuove iniziative per le operazioni in corso.

PLC (), la società di esplorazione e sviluppo dell'oro focalizzata su Irlanda e Finlandia, ha dichiarato di aver ricevuto un avviso per esercitare warrant per la sottoscrizione di 1.358.333 azioni ordinarie al prezzo di 16 p per azione ordinaria per le quali sono stati ricevuti fondi di £ 217.333 azienda. I warrant sono stati emessi nell'ambito della collocazione e sottoscrizione di nuove azioni ordinarie annunciate il 18 febbraio 2020. Il gruppo ha aggiunto che i proventi derivanti dall'esercizio dei warrant saranno utilizzati a fini di capitale circolante generale.

(), la società indipendente di produzione, sviluppo ed esplorazione di petrolio e gas focalizzata sulla Nigeria, ha annunciato la nomina di Allenby come consigliere nominato e broker congiunto della società con effetto immediato. Ha inoltre affermato che, in seguito all'acquisizione di Whitman Howard Limited da parte di Panmure Gordon & Co, ha nominato Panmure Gordon come altro broker congiunto con effetto immediato.

(), specialisti nell'esplorazione e produzione di iodio e produttori di prodotti chimici speciali, ha annunciato il lancio del suo nuovo sito Web aziendale all'indirizzo www.iofina.com. Il sito Web includerà le informazioni attuali per clienti e investitori, sarà mobile e tablet e sarà continuamente migliorato e aggiornato.

(), la società di esplorazione e sviluppo mineraria focalizzata sul suo progetto Bougouni al litio nel sud del Mali, ha annunciato che la sua assemblea generale annuale (AGM) si terrà alle 12:00 del 27 agosto 2020, a Prince Frederick House, 35-39 Maddox Street, London W15 2PP. A seguito delle attuali misure attuate dal governo del Regno Unito, gli azionisti non saranno autorizzati a partecipare all'Assemblea generale, ma sono fortemente incoraggiati a presentare i propri voti per delega il più presto possibile. La società ha dichiarato che intende tenere un webcast per gli azionisti dopo l'AGM sotto forma di presentazione seguita da domande e risposte. Ulteriori dettagli saranno comunicati a tempo debito

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Sono stati tutti abbronzati a spruzzo dall'esperto di abbronzatura di celebrità, Jules Von Hep, usando il marchio di abbronzatura che ha creato; Isola del paradiso

Classificato il numero uno del marchio conciario a Sephora, ha davvero preso d'assalto il mondo. Solo quest'anno Isle of Paradise ha battuto i record di QVC – vendendo oltre 1 prodotto ogni secondo – ed è diventato anche virale su TikTok mentre i fan chiedevano a gran voce le caratteristiche iconiche del marchio nei loro contenuti.

Non c'è da meravigliarsi che l'Isola del Paradiso sia il punto di riferimento per gli A-lister in tutto il mondo.

Quindi può sorprendere che essere un innovatore abbronzante non sia stato il fondatore della carriera, Jules Von Hep aveva in mente quando ha iniziato a lavorare nel settore della bellezza.

L'artista abbronzato di celebrità Jules Von Hep è il creatore del rivoluzionario marchio di abbronzatura Isle of Paradise

L'artista abbronzato di celebrità Jules Von Hep è il creatore del rivoluzionario marchio di abbronzatura Isle of Paradise

“In realtà non ho mai voluto essere un abbronzante spray. È stata una carriera che mi ha trovato “, afferma. “Mi sono davvero innamorato della connessione che avevo con le persone e del fatto che ogni volta che avrei dato un'abbronzatura spray, avrei fatto sentire qualcuno più sicuro”.

Dopo solo pochi mesi di lavoro come abbronzante spray, gli è stato chiesto di unirsi al team di truccatori di The X Factor dove ha davvero iniziato a lasciare il segno. Tanto che è stato presto messo in camicia per assumere lo stesso ruolo in Strictly Come Dancing.

“Quando ho iniziato a quello show era molto noto per le abbronzature arancioni e ciò che volevano che facessi, era renderlo non noto per quello”, spiega. “Ho dovuto insegnare molto a me stesso su come l'abbronzatura reagisce sotto le luci dello studio, come l'abbronzatura si trova sulla pelle e come è necessario renderla un bagliore perfetto e costante.

“Ho anche imparato come ha funzionato con diverse forme del corpo e tonalità della pelle e come cose come i cicli ormonali possono influenzare l'abbronzatura. È stato come un corso intensivo. “

“Ognuno è un essere umano, tutti hanno il corpo appeso e tutti hanno giorni buoni e giorni cattivi”, dice Jules. “Si tratta di farli sentire fiduciosi.

Accendi il tuo splendore con l'Isola del Paradiso! Prima e dopo l'uso dell'Isola del Paradiso Acqua autoabbronzante media

Accendi il tuo splendore con l'Isola del Paradiso! Prima e dopo l'uso dell'Isola del Paradiso Acqua autoabbronzante media

Ben presto, Jules è stato l'artista che ha abbronzato le celebrità, i modelli e i VIP ed è stato conosciuto per le sue impeccabili abbronzature naturali e per essere regolarmente in soccorso quando una brutta abbronzatura finta doveva essere riparata al più presto!

Non c'era soluzione sul mercato, tuttavia, che rispondesse a tutte le sue preghiere o ai bisogni dei suoi clienti, quindi dovette improvvisare.

“Stavo già mescolando il trucco correttivo per il colore con l'abbronzatura, quindi avrei messo le basi verdi sul rossore, la pesca per schiarire le tonalità della pelle più chiare e poi il viola per annullare i toni tradizionali dell'abbronzatura scura.”

Fu da lì che arrivò il momento della lampadina. Ha iniziato a sperimentare, realizzando i suoi prodotti autoabbronzanti a casa e l'Isola del Paradiso è nata, sconvolgendo le industrie della bellezza e dell'abbronzatura lungo il percorso.

Jules afferma che la sua priorità numero uno era quella di lanciare un marchio che racchiudesse i segreti del backstage che aveva appreso negli anni.

“Abbiamo completamente sradicato i problemi che le persone odiano per l'abbronzatura”, spiega. “Striature arancioni, odori di rango, lenzuola e vestiti macchiati, macchie. Non solo, ma la nostra gamma è progettata per adattarsi alla routine quotidiana della cura della pelle.

“Quindi, che tu sia un conciatore esperto o che non abbia mai acquistato abbronzatura prima, l'Isola del Paradiso è per te. Sempre più persone si convertono al marchio mentre cercano un bagliore più naturale e sano che sia letteralmente infallibile “.

Il movimento di fiducia del corpo dell'Isola del Paradiso

Jules:

Jules: “Tutti meritiamo di essere rappresentati. Non esiste un ideale che dobbiamo raggiungere, non esiste.”

Hacks di bellezza nel backstage di Jules!

Sia che tu voglia abbronzarti in fretta o sia necessario correggere un'abbronzatura andata storta, i segreti del backstage di Jules mostrano che puoi fare tutto con l'Isola del Paradiso …

* Una stella della lista A che ha mancato l'appuntamento con l'abbronzatura spray, prenotata con Jules all'ultimo minuto. Ha applicato la mousse Clear Glow media e lei è stata sul tappeto rosso in sole 4 ore.

* A un presentatore televisivo è rimasta un'abbronzatura irregolare da un altro abbronzatore spray. Jules rimosse il residuo con lo spray Over It prima di applicare Instant Disco Tan per uniformare quelle terribili strisce.

* Jules ADORA usare le Acque di abbronzatura negli scatti in studio perché sono brillanti nel truccarsi. Raffredda anche la pelle sotto le luci calde dello studio.

* Mancanza di sonno e giornate impegnative sono le principali lamentele che Jules sente dai suoi clienti. Quindi raccomanda di aggiungere le gocce di autoabbronzatura alla loro routine notturna. Questi donano un bagliore graduale, ma lasciano anche la pelle grassoccia, rugiadosa e fresca.

* Jules dà gocce di autoabbronzatura alle celebrità da portare ai loro visisti, in modo che possano mescolarle con la loro crema idratante o olio dopo il viso del tappeto rosso.

Fin dall'inizio Jules voleva fare un'abbronzatura adatta a tutti i CORPI; uno che celebra tutte le tonalità della pelle, le dimensioni, i sessi e le capacità, un messaggio riflesso nei diversi modelli e influenzatori che lavorano con Isola del paradiso.

Si tratta di celebrare le nostre differenze, accettare e amare i nostri corpi e trovare un bagliore interiore, oltre che esteriore.

“Stavo guardando molti diversi tipi di corpi nudi, ma solo un tipo veniva rappresentato in campagne di abbronzatura”, spiega. “Non ero arrabbiato ma volevo cambiare quella rappresentazione. Tutti meritiamo di essere rappresentati. Non esiste un ideale che dobbiamo raggiungere, non esiste. Quindi penso che sia stata la mia missione.”

E questo manifesto del marchio proviene da un posto davvero personale per Jules.

“Ad essere onesti, l'abbronzatura spray ha totalmente salvato me e la mia fiducia nel mio corpo”, afferma. “Ho sempre odiato la mia riflessione fino a quando avevo circa 25 o 26 anni e poi ho iniziato a rendermi conto che tutti odiavano la loro riflessione e non ero solo.

“Tutti si stavano scusando per quando si stavano togliendo i vestiti e io ero tipo, non lo vedo. Vedo solo qualcuno che è assolutamente meraviglioso, gentile e divertente.

“Così abbronzarsi e stare attorno a molti corpi nudi giorno dopo giorno, in realtà ha cambiato tutta la mia percezione della nudità e della fiducia individuale. È stato un vero colpo d'occhio per me.”

Il segreto dell'isola del paradiso

L'Isola del Paradiso ha sconvolto l'industria conciaria con il suo uso della teoria del colore

L'Isola del Paradiso ha sconvolto l'industria conciaria con il suo uso della teoria del colore

L'Isola del Paradiso ha sconvolto l'industria conciaria con il suo uso della teoria del colore

Cosa imposta il marchio di abbronzatura numero 1 Isola del paradiso a parte, è il suo uso di formule correttive di colore; il primo marchio al mondo a farlo con i prodotti per l'abbronzatura.

Il principio di correzione del colore è essenzialmente quello della teoria del colore in base alla quale tonalità opposte si annullano a vicenda.

Quindi puoi ridurre il rossore con i toni del verde, ad esempio, o schiarire le carnagioni giallastre con i toni lilla e funziona anche per uniformare qualsiasi scolorimento e iper-pigmentazione.

“L'abbronzatura correttiva a colori si basa sulla risposta ai problemi che le persone hanno con l'abbronzatura tradizionale”, spiega. “È venuto da me solo ascoltando anni e anni di persone che mi chiedevano di riparare i loro brutti abbronzanti falsi.”

E Jules non ha mai guardato indietro!

Il basso

I prodotti Isle of Paradise sono realizzati per ogni CORPO

I prodotti Isle of Paradise sono realizzati per ogni CORPO

Ti senti ispirato a diventare splendido e radioso quest'estate?

Non solo otterrai i vantaggi della teoria dei colori con Isola del paradiso, ma puoi essere certo che tutti i suoi prodotti sono vegani al 100%, privi di crudeltà e realizzati con ingredienti biologici e amanti della pelle.

Le formulazioni chiare creano abbronzature dall'aspetto naturale senza striature, tonalità arancioni o strani profumi e non macchiano le lenzuola o i vestiti, quindi puoi applicarle al mattino e uscire direttamente dalla porta!

E se tutto ciò non bastasse, tutti i prodotti Isle of Paradise fanno ora parte di una vendita “risparmia fino a metà prezzo”, esclusivamente su Boots (instore e online).

Qui, Jules ci fornisce i dettagli sui prodotti dell'isola * del paradiso preferiti *.

Acqua media autoabbronzante

Acque autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso in chiaro, medio (il preferito di Jules) e scuro

Acque autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso in chiaro, medio (il preferito di Jules) e scuro

Prima e dopo l'utilizzo dell'Isola del Paradiso Acqua autoabbronzante media, il prodotto preferito di Jules

Prima e dopo l'utilizzo dell'Isola del Paradiso Acqua autoabbronzante media, il prodotto preferito di Jules

“Questo è il mio prodotto preferito. Quando lo stavamo testando, ogni volta che indossavo l'acqua verde la gente diceva 'che cosa hai sulla pelle? È incredibile.' Per me, offre solo risultati facili, meravigliosi e fantastici.

“L'acqua verde è un ottimo punto di partenza se non sei sicuro di quale prodotto scegliere.

“Spruzza la pelle fino a quando non sei visibilmente bagnata e poi puoi strofinarla usando i palmi delle mani o semplicemente lasciarti sedere sulla pelle. Ricordati di lavarti i palmi dopo l'uso.

“E puoi tenere l'acqua in frigo, soprattutto in questo periodo dell'anno, quindi l'abbronzatura è ancora più rinfrescante quando la applichi. Inoltre, è così adorabile come uno spray spray sopra il trucco, perché quando ti trucchi fuori, sei abbronzato sotto. “

Acquista acqua autoabbronzante media dell'Isola del Paradiso QUI

Gocce autoabbronzanti leggere

Le gocce autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso sono disponibili in Light, Medium e Dark, quindi puoi adattarle perfettamente per creare l'abbronzatura che desideri

Le gocce autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso sono disponibili in Light, Medium e Dark, quindi puoi adattarle perfettamente per creare l'abbronzatura che desideri

“Le gocce sono così sorprendenti se sei un ossessionato dalla cura della pelle.

“Se hai già molti prodotti per la cura della pelle e non riesci a capire dove abbronzarti nel tuo regime, le gocce sono così facili perché puoi mescolarle con la crema idratante o il siero, il balsamo o l'olio di notte.

“Le gocce sono completamente personalizzabili in modo da avere il pieno controllo del tuo bagliore. Più gocce aggiungi, più profondo sarà il bagliore.

“Per il viso consiglierei da 2 a 4 gocce e per il resto del corpo da 2 a 12 gocce per cucchiaiata di crema idratante ogni volta che si applica.”

Acquista Gocce autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso QUI.

Mousse autoabbronzante chiara di bagliore scuro

Jules dice che la mousse autoabbronzante chiara di Dark Glow dell'Isola del Paradiso dovrebbe essere applicata con un guanto applicatore. Clear Mouse è disponibile anche in Light e Medium.

Jules dice che la mousse autoabbronzante chiara di Dark Glow dell'Isola del Paradiso dovrebbe essere applicata con un guanto applicatore. Clear Mouse è disponibile anche in Light e Medium.

Prima e dopo l'utilizzo di Isle of Paradise Dark Glow Clear Self Tanning Mousse

Prima e dopo l'utilizzo di Isle of Paradise Dark Glow Clear Self Tanning Mousse

“Devi applicare questa mousse usando un guanto applicatore.

“In primo luogo, idrata le mani, i gomiti, le ginocchia e i piedi e poi pompa la mousse su un guanto. Un suggerimento professionale è quello di unire le punte delle dita verso il fondo del palmo mentre la tua mano è nel guanto per diffondere la mousse intorno.

“Quindi distribuisci la mousse sulla pelle con movimenti longitudinali – non con movimenti circolari – perché otterrai una copertura più uniforme. Quando fai la schiena, capovolgi il guanto al contrario, in modo che la schiuma si trovi sul dorso delle nocche e quindi strofinare dietro la schiena.

“Dico sempre” non temere se stai andando lontano “, ma se sei nervoso che la mousse sia chiara puoi mescolarvi un evidenziatore liquido in modo da poter vedere dove hai applicato perché la pelle brillerà. “

Acquista qui la mousse autoabbronzante Clear Glow Clear dell'Isola del Paradiso QUI.

Siero viso autoabbronzante ialuronico HYGLO

Sieri autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso HYGLO

Sieri autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso HYGLO

“Adoro il nostro nuovo siero viso e corpo HYGLO. Sono abbronzatura graduale, sieri ialuronici che applichi ogni giorno e non ho mai sentito un siero abbronzante che sia così setoso.

“Non sembra appiccicoso, non è appiccicoso, è facile da usare. Penso che sia stato davvero un ottimo posto per le persone che non hanno mai provato l'abbronzatura prima di iniziare.”

Acquista il siero autoabbronzante Isola del Paradiso HYGLO QUI.

Ricariche d'acqua autoabbronzanti

Ricarica autoabbronzante dell'Isola del Paradiso

Ricarica autoabbronzante dell'Isola del Paradiso

“La sostenibilità è molto importante per noi, quindi abbiamo appena lanciato le nostre ricariche Paradise.

“Sono le nostre acque in un sacchetto di ricarica. Stiamo davvero lavorando duramente per concentrarci sulla sostenibilità e siamo anche molto onesti con il nostro pubblico.

“Siamo in viaggio, stiamo facendo del nostro meglio e ci arriveremo”.

Acquista QUI le ricariche d'acqua autoabbronzanti dell'Isola del Paradiso.

I consigli di Jules per un'abbronzatura perfetta

Se qualcuno ha i migliori hack interni per ottenere l'abbronzatura perfetta è Jules Von Hep.

Quindi, che tu sia un esperto o un novizio abbronzante, dai un'occhiata ai suoi consigli per ottenere lo splendore meraviglioso che tutti desideriamo.

1. Ricorda che la pratica rende perfetti e ci sono molti video fantastici online, quindi se sei nervoso guardali. Ho filmato molti tutorial per Instagram dell'Isola del Paradiso.

2. Esfoliare la pelle prima di applicare l'abbronzatura. Idrata le aree asciutte, quindi mani, gomiti, ginocchia, sopracciglia e se hai eczema o psoriasi, idrata sempre anche quelle aree.

3. Quindi applicare l'abbronzatura. Dico sempre di fare due generose applicazioni sul corpo e una sul viso.

4. Dopo aver terminato l'applicazione, soprattutto se fa caldo, puoi impostare l'abbronzatura con una polvere traslucida per impedirne il movimento durante l'impostazione. Oppure puoi asciugarti con un asciugacapelli fresco.

5. Dopo aver applicato l'abbronzatura, lava i palmi delle mani, idrata di nuovo le mani e quindi leviga l'eccesso delle sopracciglia e dell'attaccatura dei capelli.

E voilà! Avrai un edificio di fiducia, una bella abbronzatura luminosa.

Fai clic QUI per acquistare la collezione Isle of Paradise su Boots dove puoi risparmiare fino a metà prezzo ora.

* Isle of Paradise consiglia ai clienti di eseguire il patch test 24 ore prima di utilizzare i prodotti.

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Psorilax: prezzo, funziona, recensioni, opinioni, quanto costa

  • Il Brasile registra quasi 70.000 nuovi casi in un solo giorno
  • L'India riporta 52.123 nuove infezioni, un nuovo record giornaliero per il paese duramente colpito
  • Il bilancio delle vittime negli Stati Uniti supera i 150.000
  • Più di 17 milioni di persone hanno contratto il virus in tutto il mondo, causando oltre 660.000 morti

23:59 Ora chiuderemo questi aggiornamenti live per oggi e per il futuro immediato. Ovviamente continueremo a fornirti tutte le novità più importanti. Tuttavia, per ora, utilizzeremo questo particolare formato solo se gli eventi lo giustificano. Grazie per l'interesse e rimanete sintonizzati su DW!

23:00 Un farmaco anticorpale, originariamente testato come trattamento per la psoriasi, può aiutare a ridurre il rischio di complicanze e morte tra le persone anziane affette da COVID-19, ha dimostrato un piccolo studio a Cuba.

Dopo 19 pazienti – tutti di età superiore ai 64 anni – da una singola casa di cura risultata positiva per il coronavirus ad aprile, hanno ricevuto una o due dosi endovenose di itolizumab in aggiunta al trattamento standard al momento.

I ricercatori dicono che la combinazione di trattamenti ha aiutato a ridurre l'infiammazione e tutti tranne uno sono stati dimessi dall'ospedale in 14 giorni.

22:30 Ecco uno sguardo agli sviluppi dei virus da Africa:

Mentre il continente si avvicina a 1 milione di infezioni confermate, il direttore del Centri africani per il controllo e la prevenzione delle malattie ha affermato che “non è il momento di farci prendere dal panico e temere”, dato che l'Africa ha ancora “ottime possibilità di respingere questo virus” con una strategia globale che include test assertivi.

Il Sudafrica sta alleggerendo il coprifuoco del virus di un'ora per aiutare il recupero del settore della ristorazione in difficoltà, ha annunciato il ministro del turismo.

Il presidente Cyril Ramaphosa aveva imposto un 21:00 coprifuoco il 12 luglio, che secondo i ristoranti ha impedito ai clienti di venire a cena, portando via guadagni significativi dal settore già in rovina.

Con oltre 471.000 infezioni confermate, il Sudafrica ha il quinto più grande caso di conferme al mondo.

Il vicepresidente della Gambia, il dott. Isatou Touray, è risultato positivo per il coronavirus, ha detto la Camera di Stato del paese. Per precauzione, il presidente entrerà in quarantena per due settimane. La nazione dell'Africa occidentale ha riportato poco più di 400 infezioni confermate.

Il Fondo monetario internazionale ha approvato $ 171,9 milioni in finanziamenti per il Madagascar per aiutare la nazione insulare ad affrontare la pandemia.

“Le prospettive economiche del Madagascar sono peggiorate … a causa di un ulteriore deterioramento dell'ambiente globale e di un approfondimento dell'impatto della pandemia di COVID-19”, si legge nella dichiarazione del FMI. Ciò porta il sostegno totale di emergenza al coronavirus in Madagascar a 337,9 milioni di dollari.

Il World Food Program (WFP) ha richiesto ulteriori $ 250 milioni in aiuti allo Zimbabwe, poiché il paese affronta una grave crisi economica solo aggravata dal virus.

L'agenzia alimentare delle Nazioni Unite ha avvertito che quasi il 60% della popolazione dello Zimbabwe, o 8,6 milioni di persone, potrebbe diventare “insicuro dal cibo” entro dicembre se non fosse fornita assistenza.

22:00 Ecco una carrellata di tutti gli sviluppi di Asia alla fine di giovedì:

La Cina sta lottando per contenere un focolaio di virus nella regione nord-occidentale dello Xinjiang con 105 nuovi casi di virus segnalati. Di questi, 96 sono stati segnalati dallo Xinjiang.

Autorità indiane afferma che l'immunità da gregge non è un'opzione per il secondo paese più popoloso del mondo e che un vaccino è l'unico modo per l'India di sconfiggere il virus.

“Con la popolazione indiana, costruire l'immunità del gregge senza vaccinazione non è una scelta o un'opzione strategica”, ha affermato Rajesh Bhushan, un alto funzionario del Ministero della Sanità. Il paese ha segnalato quasi 1,6 milioni di infezioni confermate con circa 35.000 decessi.

Lo stato australiano di Victoria ha reso obbligatorio indossare maschere, subito dopo aver riportato un nuovo record giornaliero di 723 infezioni confermate. Dopo essere stato lodato per la sua risposta virale nella fase iniziale, l'Australia sta affrontando una ripresa del COVID-19.

Restrizioni di virus nella capitale indonesiana di Jakarta sono stati prorogati fino al 13 agosto, poiché il numero di nuove infezioni continua ad aumentare, ha detto giovedì il governatore di Jakarta Anies Baswedan. Con 20.969 casi confermati e 817 morti, la capitale è diventata il primo epicentro della nazione insulare.

Con quasi 4.000 nuove infezioni confermate, il Filippine ha registrato il totale giornaliero più alto. Ciò porta il numero totale di casi a quasi 90.000. Il paese ha il più alto carico di virus nel sud-est asiatico dopo l'Indonesia.

Dopo quasi cinque mesi, Lo Sri Lanka sta riaprendo le scuole il 10 agosto, il Ministero dell'istruzione ha detto giovedì. Tutte le scuole pubbliche e private approvate dal governo riporteranno gli studenti seguendo rigide misure di allontanamento sociale.

21:00 I paesi dovrebbero iniziare a ridurre gradualmente le restrizioni di viaggio, l'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha raccomandato. La priorità dovrebbe essere data ai viaggi essenziali per le emergenze, le azioni umanitarie, i viaggi del personale essenziale e il rimpatrio, ha affermato.

Un'ondata di nuove infezioni in molte parti del mondo ha costretto molti paesi a reimpostare alcune restrizioni.

L'OMS ha ora esortato ogni paese a condurre una propria analisi rischio-beneficio e a decidere sulle sue priorità, prima di riprendere i viaggi internazionali.

Nel suo ultimo avviso di viaggio, l'OMS ha affermato che i paesi devono tenere conto dell'epidemiologia locale e dei modelli di trasmissione, delle misure sanitarie e sociali nazionali già in atto.

20:00 Pilota di Formula 1 Sergio Perez è risultato positivo per il coronavirus e mancherà il prossimo Gran Premio di Gran Bretagna, ha confermato il suo team Racing Point.

Il messicano trentenne è il primo pilota ad essere risultato positivo per COVID-19 da quando il campionato del mondo ha iniziato la sua partenza ritardata in Austria all'inizio di luglio, secondo rigorosi protocolli di collaudo. Finora la stagione della F1 ha visto oltre 15.000 test di coronavirus.

Fino ad ora sono stati registrati solo due risultati positivi, entrambi provenienti da personale di installazione locale.

“In seguito all'annuncio che Sergio è risultato positivo per COVID-19 sul circuito di Silverstone in vista del Gran Premio di Gran Bretagna, il team si rammarica di annunciare che non sarà in grado di partecipare alla gara di questo fine settimana”, ha dichiarato il suo team in una nota.

Il campionato del mondo ha tenuto tre gare a porte chiuse, eventi consecutivi in ​​Austria seguiti dal Gran Premio ungherese.

Racing Point ha dichiarato che Perez, che aveva partecipato a tutte e tre le gare, non era tornato in Messico dal Gran Premio di Ungheria 10 giorni prima.

18:29 Diverse società globali e governi nazionali hanno riportato risultati finanziari record per il secondo trimestre 2020. In Germania, il prodotto interno lordo è sceso del 10,1%, negli Stati Uniti l'economia ha registrato un record del 33% e in Messico si è registrato un contrazione del 17,3%.

L'operatore ferroviario tedesco Deutsche Bahn ha registrato la peggiore performance trimestrale di sempre e la Volkswagen ha registrato una perdita al lordo delle imposte di 1,4 miliardi di euro per la prima metà del 2020.

Leggi di più: Le aziende paralizzate dal coronavirus riportano miserabili risultati del secondo trimestre

16:10 Il leggendario club techno di Berlino Berghain ha annunciato che la musica riprenderà per la prima volta da quando ha chiuso a causa della pandemia a metà marzo. Invece di far rientrare i clubbers nel suo cavernoso edificio industriale, ospiterà invece una festa in giardino con una serie di misure.

“Si prega di portare maschere che coprano sufficientemente la bocca e il naso ed evitare il contatto diretto con altri ospiti, a meno che non si provenga dalla stessa famiglia”, ha detto sul suo sito web. Le maschere sono obbligatorie nell'area d'ingresso, sulla pista da ballo e nei servizi igienici. Hanno anche installato ventilatori sulla pista da ballo e nei servizi igienici “per prevenire la diffusione di aerosol.

In precedenza, il club aveva annunciato un'installazione di arte sonora all'interno della Kessel Hall dell'edificio. Cinquanta persone alla volta dovevano essere autorizzate nell'ex centrale elettrica ad ascoltare un paesaggio sonoro di pulsazioni ritmiche, rumori di città morbidi, mormorii e persino il vortice delle pale dell'elicottero.

La rinomata scena techno di Berlino è stata colpita duramente dalle chiusure, con molti club che ora organizzano rave clandestine illegali in violazione delle normative sulla pandemia.

Leggi di più: Curiosi rave, feste di blocco e gioia della ribellione

15:36 La società di biotecnologia statunitense Inovio Pharmaceuticals ha annunciato che la sua il candidato al vaccino INO-4800 si è dimostrato efficace nella protezione dei macachi di rhesus dal virus 13 settimane dopo l'ultima vaccinazione.

Il suo studio ha dimostrato che il vaccino ha ridotto la carica virale nei polmoni inferiori e nei passaggi nasali nelle scimmie che hanno ricevuto due dosi del vaccino a quattro settimane di distanza. Lo studio non è stato rivisto tra pari.

La notizia ha spinto le azioni dell'azienda a saltare del 6% prima della campana.

15:21 Un quinto il ministro federale in Brasile si è rivelato positivo per il virus. Il ministro della Scienza e della Tecnologia Marcos Pontes è l'ultimo gabinetto del presidente brasiliano Jair Bolsonaro a catturare il virus. Il 57enne ha rivelato la sua diagnosi su Twitter. Ora si sta isolando dopo aver sperimentato sintomi simil-influenzali e mal di testa. Arriva dopo che il ministro della cittadinanza Onyx Lorenzoni e il ministro dell'Istruzione Milton Ribeiro si sono entrambi dimostrati positivi la scorsa settimana e lo stesso Bolsonaro ha annunciato il suo risultato positivo il 7 luglio.

Il Brasile è il secondo paese più colpito al mondo con oltre 2,5 milioni di casi confermati e oltre 90.000 decessi.

10:40 Di 21 paesi europei, il Regno Unito ha subito il più alto tasso di morti in eccesso finora durante la pandemia, un confronto ha mostrato i paesi.

L'analisi condotta dall'Ufficio britannico per le statistiche nazionali (ONS) ha affermato che l'eccesso di mortalità – il numero di decessi per tutte le cause che superano la media quinquennale per il periodo dell'anno – è il modo migliore per calcolare i decessi dovuti a un focolaio poiché è comparabile a livello internazionale .

L'analisi ONS ha confermato la posizione della Gran Bretagna come uno dei paesi più colpiti da una pandemia che ha ucciso oltre 666.000 persone in tutto il mondo.

Circa 65.000 persone in più del solito sono morte per tutte le cause nel Regno Unito finora quest'anno, il totale più alto in Europa.

Le statistiche mostrano che anche il Regno Unito ha avuto il più alto tasso di mortalità in eccesso in Europa, se adeguato alla dimensione e all'età della sua popolazione.

Oltre 303.000 persone sono state infettate e oltre 46.000 persone sono morte di COVID-19 nel Regno Unito.

10:00 L'economia austriaca si è ridotta del 10,7% nel secondo trimestre in mezzo alla pandemia di COVID-19 – la più grande contrazione dalla seconda guerra mondiale.

Il dato del think tank Wifo, che raccoglie i dati per il governo austriaco, è stato confrontato con i tre mesi precedenti. C'è stato un calo ancora maggiore – del 12,8% – rispetto allo stesso periodo dell'anno precedente.

Nel frattempo, Il PIL belga è diminuito del 12,2% nel secondo trimestre rispetto ai tre mesi precedenti, secondo la Banca nazionale del Belgio.

La notizia arriva lo stesso giorno in cui la Germania ha visto la sua produzione economica scendere a un ritmo record, con un calo del prodotto interno lordo del 10,1%.

08:30 Il Monte Everest e le altre principali montagne del Nepal verranno riaperte ai visitatori stranieri una volta che le restrizioni sui viaggi internazionali saranno revocate a metà agosto, i funzionari hanno detto.

“Da oggi gli alpinisti possono richiedere il permesso”, ha dichiarato all'agenzia di stampa DPA Mira Acharya, capo del dipartimento locale del turismo. “Stiamo ancora discutendo della modalità di quarantena per i turisti che potranno volare dal 17 agosto.”

Sono previste misure di allontanamento sociale. Le autorità stanno anche prendendo in considerazione misure come chiedere ai turisti di dimostrare che hanno avuto un test COVID-19 negativo e di autoisolarsi per due settimane prima di partire per la loro spedizione.

La nazione himalayana consente l'alpinismo su 414 cime, ma i permessi di arrampicata sono stati annullati a marzo.

un uccello vola mentre l'Everest è visto da Namche Bajar, distretto di Solukhumbu, Nepal (alleanza con le foto / AP Photo / N. Shrestha)

Il Nepal ha annullato e aveva smesso di rilasciare nuovi permessi di arrampicata a marzo

08:20 La pandemia di coronavirus ha portato gente in Germania a bere meno birra, dicono gli statistici. Il consumo di birra a livello nazionale è calato del 5,9% nella prima metà del 2020 rispetto alla prima metà dello scorso anno, secondo l'Ufficio federale di statistica.

Le fabbriche di birra e le imprese tedesche hanno venduto circa 4,3 miliardi di litri di birra (1,36 miliardi di galloni) tra gennaio e giugno 2020, segnando un deficit di circa 303 milioni di litri rispetto allo scorso anno. Oltre l'82% di questo importo è stato consumato nel paese dell'UE.

08:00 La Germania ha visto la sua produzione economica scendere a un ritmo record, secondo i dati diffusi dall'Ufficio federale di statistica. Il prodotto interno lordo del paese è diminuito del 10,1%.

“Questo è stato il calo più marcato da quando i calcoli del PIL trimestrale per la Germania sono iniziati nel 1970”, ha detto l'ufficio statistico.

07:45 La casa automobilistica tedesca Volkswagen ha registrato una perdita di € 1,4 miliardi ($ 1,6 miliardi) al lordo delle imposte nella prima metà del 2020 a causa del crollo delle vendite durante la crisi del coronavirus.

Nello stesso periodo dell'anno precedente, l'utile ante imposte si è attestato a 9,6 miliardi di euro.

Leggi di più: Scandalo Volkswagen: principali regole giudiziarie in materia di richieste di risarcimento danni “dieselgate”

VW, la più grande casa automobilistica europea, ha detto le entrate sono diminuite del 23% a € 96 miliardi anno dopo anno i blocchi hanno chiuso gli showroom e fermato le linee di produzione.

“La prima metà del 2020 è stata una delle più difficili della storia della nostra azienda a causa della pandemia di COVID-19”, ha dichiarato il capo finanziario Frank Witter.

Complessivamente, il gruppo – che comprende i marchi Porsche, Audi e Skoda – ha venduto 3,9 milioni di veicoli tra gennaio e giugno, circa il 27% in meno di auto rispetto alla prima metà del 2019. Il crollo più grande è stato registrato in aprile, quando molti paesi erano in blocco per frenare la diffusione del virus.

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Witter ha dichiarato che la VW è stata sulla buona strada per chiudere l'anno in “territorio positivo”, con l'attenuazione delle restrizioni in tutto il mondo che dovrebbero stimolare le vendite.

“A causa della tendenza positiva mostrata nella nostra attività nelle ultime settimane e dell'introduzione di numerosi modelli interessanti, sembriamo cautamente ottimisti verso la seconda metà dell'anno”, ha affermato.

07:27 Il leader del Stato tedesco del Baden-Württemberg, Winfried Kretschmann, pensa andare in vacanza all'estero non è “appropriato” nel tempo di una pandemia globale.

“Non ho intenzione di farlo, perché è troppo complicato e anche non appropriato”, ha detto all'agenzia di stampa tedesca DPA. “In tempi come questi, puoi semplicemente rimanere in campagna e non dover viaggiare per il mondo.”

Il politico del partito verde di 72 anni ha detto che avrebbe trascorso la sua estate camminando nella foresta bavarese nella Germania meridionale e avrebbe anche portato i suoi nipoti allo zoo o al parco giochi.

La Germania ha revocato molti dei suoi avvertimenti di pandemia sui viaggi, permettendo alle persone di fare le vacanze estive dopo mesi di ritardo. Al momento non ci sono restrizioni per i visitatori provenienti da altri paesi UE e Schengen. Tuttavia, gli incidenti che hanno coinvolto turisti tedeschi ubriachi sull'isola spagnola di Maiorca hanno suscitato preoccupazioni per un rinnovato focolaio e blocchi da parte delle autorità spagnole.

06:59 Il segretario alla salute britannico Matt Hancock dice che lo è “preoccupato per una seconda ondata” delle infezioni da coronavirus in Europa e che il governo non esiterà a ricomporre le misure di quarantena se la situazione dovesse peggiorare.

“Penso che tu possa vedere una seconda ondata iniziare a rotolare in tutta Europa, e dobbiamo fare tutto il possibile per impedirle di raggiungere queste coste e affrontarla”, ha detto Hancock in un'intervista a Sky News.

“Non è solo la Spagna … ma ci sono anche altri paesi in cui il numero di casi è in aumento. E siamo assolutamente determinati a fare tutto il possibile per proteggere questo paese”, ha detto.

La Gran Bretagna ha riportato una regola di quarantena di due settimane per le persone che arrivavano dalla Spagna la scorsa settimana, scatenando una protesta da Madrid. Altri paesi europei sono esenti dalla misura, ma un aumento delle infezioni in paesi come la Francia ha portato a temere che la politica potesse essere ampliata.

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06:41 Il mondo del tennis n. 1 Ashleigh Barty si è ritirato dagli US Open citando “rischi significativi” dalla pandemia di coronavirus.

L'australiano è il giocatore più alto finora a ritirarsi dal torneo, che dovrebbe iniziare a New York ad agosto.

“La mia squadra e io abbiamo deciso che non viaggeremo negli Stati Uniti per l'Ovest e il Southern Open e gli US Open quest'anno”, ha detto il 24enne in una nota.

“È stata una decisione difficile ma ci sono ancora rischi significativi a causa del COVID-19 e non mi sento a mio agio nel mettere io e la mia squadra in quella posizione.”

La campionessa dei single ha dichiarato che stava ancora decidendo se competere nei tornei europei previsti per settembre e ottobre.

Altri giocatori hanno anche espresso preoccupazione per i loro viaggi negli Stati Uniti, dove oltre 150.000 persone sono morte a causa del coronavirus.

06:06 Produttore europeo di aeromobili Airbus ha annunciato perdite nette di € 1,9 miliardi ($ 2,2 miliardi) nei primi sei mesi dell'anno a causa degli effetti a catena del coronavirus.

In una dichiarazione, la società ha dichiarato di aver utilizzato risorse per 12,4 miliardi di euro nella prima metà del 2020 e sperava che nuove misure l'avrebbero aiutata a “non bruciare di più” nei prossimi sei mesi.

Il CEO di Airbus Guillaume Faury ha dichiarato che l'impatto della pandemia sulla società è stato evidente, con consegne di aerei in calo del 50% rispetto allo stesso semestre nel 2019.

Le perdite nette di Airbus nel secondo trimestre 2020 sono state pari a 1,4 miliardi di euro, rispetto agli utili di 1,2 miliardi di euro dello stesso periodo dell'anno scorso.

L'epidemia di virus ha causato un pesante tributo finanziario all'industria aeronautica, con i viaggi internazionali sostanzialmente bloccati e la stragrande maggioranza dei voli è stata messa a terra in tutto il mondo. Nel tentativo di far fronte al calo di attività tra i clienti delle sue compagnie aeree, Airbus il mese scorso ha annunciato l'intenzione di tagliare 15.000 posti di lavoro in tutto il mondo e ridurre la produzione del 40% per due anni.

05:48 L'India ha registrato oltre 50.000 casi in un solo giorno per la prima volta dall'inizio della pandemia.

Il nuovo massimo giornaliero di 52.123 infezioni ha portato il conteggio complessivo del paese a 1.583.792.

Il Ministero della Sanità ha anche riportato 775 decessi nelle ultime 24 ore, portando il numero totale di decessi a 34.968.

L'India è il terzo paese più colpito dietro gli Stati Uniti e il Brasile in termini di casi segnalati, sebbene il suo tasso di mortalità sia significativamente più basso.

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05:18 La Francia prevede un calo del 10% del PIL quest'anno, tuttavia, “potrebbe essere un po 'meglio”, ha detto il capo della banca centrale del paese, Francois Villeroy de Galhau.

Ha anche previsto un “forte rimbalzo” dopo la fine dell'anno “speriamo di riguadagnare un livello di attività pre-COVID all'inizio del 2022”.

Commentando i grandi pacchetti di incentivi offerti dallo stato, Villeroy ha affermato che il governo deve spendere saggiamente e che l'alloggio e la fiducia nel settore privato sono stati la chiave per accelerare la ripresa.

“Il denaro pubblico non è illimitato”, ha detto Partita di Parigi rivista. “Il” qualunque cosa serva “deve progressivamente lasciare il posto a” quando è necessario “.”

04:57 Il Vietnam ha imposto più coronavirus le restrizioni dopo uno scoppio nella località costiera di Da Nang si estesero in altre cinque città.

Il Ministero della sanità ha riferito nove nuove infezioni giovedì – otto di loro a Da Nang e uno nella capitale, Hanoi, in un uomo che era appena tornato dalla località balneare.

Le autorità della città di Hanoi hanno dichiarato che avrebbero vietato raduni e chiusure di bar e club a partire da giovedì testare 21.000 persone che sono tornati da Da Nang prima che la città fosse chiusa all'inizio di questa settimana.

Le province vicine Da Nang, Quang Nam e Quang Ngai, hanno chiuso le loro spiagge e attività non indispensabili. Più a sud, la provincia di Dak Lak ha reintrodotto giovedì le misure di allontanamento sociale, chiudendo i servizi non essenziali e vietando le riunioni pubbliche di oltre 20 persone.

Fino allo scoppio a Da Nang, il Vietnam era passato più di tre mesi senza un singolo caso di trasmissione comunitaria di COVID-19.

03:35 Azienda biofarmaceutica sudcoreana Celltrion ha ricevuto l'approvazione dal Regno Unito per iniziare una sperimentazione clinica di fase I per il suo farmaco di trattamento COVID-19.

Il trattamento antivirale di Celltrion prende di mira la superficie del virus ed è progettato per impedire che si attacchi alle cellule umane.

La società ha ricevuto l'approvazione della Corea del Sud per uno studio precoce all'inizio di questo mese, che è stato il primo farmaco antivirale ad essere testato sull'uomo.

Kee Wo-sung, CEO di Celltrion, ha affermato che il trattamento sarà più economico del remdesivir del farmaco antivirale di Gilead. Kee ha chiesto ai produttori di farmaci di rendere i trattamenti COVID-19 accessibili per aiutare a porre fine alla pandemia.

03:05 Brasile è pronto ad accogliere visitatori stranieri che entrano nel paese in aereo nonostante abbia registrato un numero record di infezioni e decessi confermati.

Il paese ha esteso il suo divieto ai visitatori che arrivano via terra o via mare per altri 30 giorni. Tuttavia, coloro che arrivano in aereo saranno ammessi nel paese nel tentativo di rilanciare l'industria turistica del Brasile, che è stata devastata dal blocco di quattro mesi.

Secondo le stime della Confederazione nazionale del commercio di beni, servizi e turismo (CNC), l'industria ha perso quasi $ 23,6 miliardi.

Il paese ha il secondo maggior carico di virus al mondo con infezioni confermate che attraversano 2,5 milioni. Sono stati segnalati oltre 90.000 decessi.

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03:00 Il Giappone consentirà ad alcuni residenti stranieri di rientrare nel Paese la prossima settimana, revoca un divieto progettato per limitare la diffusione del coronavirus.

Circa 90.000 cittadini stranieri con permesso di soggiorno in Giappone sono bloccati all'estero dopo che le autorità hanno vietato il rientro da oltre 100 paesi.

Dal 5 agosto, studenti, uomini d'affari e tirocinanti saranno in grado di tornare in Giappone a condizione che abbiano una “lettera di conferma del rientro” dalla più vicina missione diplomatica giapponese e possano dimostrare di essere risultati negativi entro 72 ore dal volo di ritorno.

I cittadini stranieri di altre categorie, compresi i residenti permanenti a lungo termine e i coniugi e i figli di residenti giapponesi, possono rientrare dal 1 ° settembre.

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02:12 Il Costa Rica inizierà un piano di riapertura scaglionato sabato per aiutare l'economia assediata, nonostante un aumento dei casi.

Secondo i termini del piano del presidente Carlos Alvarado, i ristoranti apriranno durante i primi nove giorni di agosto, ma poi si fermeranno per 12 giorni e riprenderanno le restrizioni – un ciclo che verrà ripetuto.

“Stiamo cercando l'equilibrio adeguato per continuare a proteggere la salute e allo stesso tempo riprendere le attività produttive che sono state chiuse”, ha detto. “Stiamo fissando un determinato calendario in modo che le aziende possano pianificare in anticipo”.

Il Costa Rica ha riportato 16.800 casi di coronavirus e 133 morti dall'inizio della pandemia. Tre quarti dei casi e il 90% dei decessi sono stati registrati a luglio.

01:35 China recorded another 105 new cases of the coronavirus on Thursday, up from 101 cases the day before, but no new deaths.

Of the new infections, 96 were in the northwest region of Xinjiang, which has experienced a recent outbreak.

Mainland China has recorded 84,270 cases since the beginning of the pandemic, which originated in the northern city of Wuhan in the Hubei province.

01:27 The state premier David Andrews of Victoria in Australia confirmed 723 new coronavirus cases, a new daily record.

Victoria, Australia's second-most popular state, has struggled with a second wave of infections, recording 1,934 thus far this week.

To combat the outbreak, Andrews said face coverings will be mandatory from Sunday. Masks are already compulsory in the state capital of Melbourne, which is halfway through a six-week lockdown.

00:51 Mexico's Health Ministry reported 5,752 new cases and 485 further deaths.

Mexico has the fifth-highest number of coronavirus cases worldwide with 408,449 and the fourth-most fatalities with 45,361 since the pandemic began.

The government has said the real case number may be higher than the confirmed tally.

00:33 The chairman of an antitrust panel in the US House of Representatives accused Facebook of making money off of conspiracy theories related to the coronavirus pandemic.

Addressing Facebook CEO Mark Zuckerberg during an antitrust hearing, Democrat David Cicilline noted that a series of conspiracy theories, including ones claiming that the pandemic was a hoax, have thrived on Facebook's platform.

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“It brings the most activity which, of course, produces great profit,” Cicilline said.

Zuckerberg defended the social media giant's misinformation policies, saying the company has been “quite aggressive in taking some of that down.”

00:24 Nancy Pelosi, the speaker of the US House of Representatives, said masks will be required on the House floor after a Republican representative tested positive for COVID-19.

She said House members will be provided a mask if he or she forgets one and masks can be removed when addressing the chamber.

“The chair expects all members of staff to adhere to this requirement as a sign of respect for the health, safety and well-being of others in the chamber and surrounding areas,” Pelosi said on the House floor.

Texas Republican Louie Gohmert tested positive just before he was set to travel to his home state with US President Donald Trump. He often shunned wearing a mask and frequently voted without one.

00:05 Here's a wrap of the news elsewhere in North and South America:

The death toll from COVID-19 in the stati Uniti has exceeded 150,000, according to data from Johns Hopkins University. More than half of the country's 50 states have recorded 1,000 deaths. The US has also recorded more than 4.4 million cases since the pandemic began.

Ecuador's capital Quito has seen a surge in coronavirus cases since the South American country eased lockdown measures last month. The city has recorded 12,474 cases and 605 deaths since the pandemic began, but half of the cases and 141 deaths have been recorded since June 30. Ecuador has a whole has registered 83,193 cases and 5,623 deaths.

Hospital officials in Guatemala say they have had to bury dozens of unidentified COVID-19 death victims. A hospital has been creating an archive with the hopes of eventually identifying the deceased when the pandemic passes. Workers at one of the country's largest hospitals have begun photographing people too ill to give their personal details when they enter the premises. Guatemala has recorded 47,605 cases and 1,800 deaths since the pandemic began.

Argentina has approved clinical trials of a COVID-19 treatment involving hyperimmune serum from horses. The serum is obtained by injecting a horse with a SARS-CoV-2 protein and extracting plasma with the neutralizing antibodies the horse creates. The clinical trial, which is being conducted by biotech firm Inmunova, will be carried out on 242 people diagnosed with the disease.

00:01 Brazil's Health Ministry has confirmed 69,074 new cases and 1,595 deaths, both new single-day records. The figures push the country's totals over 2.5 million cases and 90,000 fatalities.

“Brazil is experiencing the worst phase of the pandemic,” said Alexandre Naime, who heads the department of infectious diseases at Sao Paulo University. “Paradoxically, public policy and personal behavior are going in the opposite direction, as if we are not going through a daily tragedy.

00:00 Catch up on Wednesday's coronavirus news here.

In reporting on the coronavirus pandemic, unless otherwise specified, DW uses figures provided by the Johns Hopkins University (JHU) Coronavirus Resource Center in the United States. JHU updates figures in real-time, collating data from world health organizations, state and national governments, and other public official sources, all of whom have their own systems for compiling information.

Germany's national statistics are compiled by its public health agency, the Robert Koch Institute (RKI). These figures depend on data transmission from state and local levels and are updated around once a day, which can lead to deviation from JHU.

dv/rt (AFP, AP, dpa, Reuters)