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L'ulcera di Buruli, una malattia infettiva tropicale trascurata, è causata da Mycobacterium ulcerans. Senza trattamento, le sue lesioni possono progredire fino a ulcere cutanee croniche, ma nel 5% dei casi si osserva una guarigione spontanea, il che suggerisce la possibile istituzione di una strategia ospite per contrastare gli effetti di M. ulcerans. Riveliamo qui una firma umorale locale specifica della pelle del processo di guarigione spontanea, associata a un aumento delle cellule produttrici di anticorpi e al riconoscimento specifico del miocolattone da parte della sottoclasse di immunoglobuline IgG2a di topo. Dimostriamo la produzione di anticorpi specifici per la pelle che neutralizzano l'attività immunomodulatoria della tossina del micolattone e confermiamo il ruolo dei macchinari dell'ospite umano nell'innescare risposte immunitarie locali efficaci mediante il rilevamento di anticorpi anti-micolattone nei pazienti con ulcera di Buruli. Le nostre scoperte aprono la strada a sostanziali progressi sia nella diagnosi che nel trattamento dell'ulcera di Buruli in conformità con le sfide più recenti emesse dall'Organizzazione mondiale della sanità.

INTRODUZIONE

Ulcera di Buruli, una malattia tropicale trascurata causata da Mycobacterium ulcerans, è la terza malattia micobatterica più comune al mondo dopo la tubercolosi e la lebbra (1). Questa malattia infettiva cronica è caratterizzata dalla distruzione del tessuto cutaneo, che porta allo sviluppo di grandi lesioni ulcerative. Questa distruzione dei tessuti è causata da una tossina lipidica unica chiamata mycolactone, prodotta da M. ulcerans. Il micolattone è citotossico ad alte dosi, ma, a dosi più basse, modula il dolore e le risposte immunitarie, facilitando la colonizzazione dell'ospite (26). Nonostante questa secrezione di tossina, gli approcci sperimentali, supportati da osservazioni nei pazienti umani, hanno rivelato che la modulazione della risposta immunitaria da parte del micolattone è locale e regionale piuttosto che sistemica (7, 8). Inoltre, la risposta umorale sistemica a M. ulcerans l'infezione è debole (8), e M. ulcerans è scarsamente riconosciuto dagli anticorpi circolanti (9). Le analisi istologiche dei tessuti dei pazienti hanno dimostrato che le lesioni dell'ulcera di Buruli sono circondate da una massiccia infiltrazione infiammatoria dei leucociti (10). Questa infiltrazione locale è stata caratterizzata nei topi e ha dimostrato di essere costituita principalmente da fagociti (principalmente macrofagi e neutrofili) e linfociti (8). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la risposta immunitaria non può controllare lo sviluppo della lesione, nonostante il reclutamento di diversi attori principali del sistema immunitario. Questo fallimento dell'immunità dell'ospite è una conseguenza della strategia utilizzata da M. ulcerans per sfuggire al sistema immunitario.

I precedenti studi sopra descritti sono stati eseguiti durante le fasi preulcerative e ulcerative. Nessuno studio ha mai preso in considerazione questi processi immunitari durante la fase di guarigione spontanea. L'ulcera di Buruli può essere trattata con antibiotici nelle prime fasi. Tuttavia, nonostante il significativo miglioramento dei trattamenti, circa il 10-15% dei pazienti con ulcera di Buruli diventa invalido permanente secondo l'Organizzazione mondiale della sanità (1114). Inoltre, le lesioni non trattate possono diffondersi agli arti interi e progredire verso ulcere cutanee croniche (11). Tuttavia, in assenza di cure mediche, la guarigione spontanea si verifica nel 5% dei casi, come recentemente riportato in Africa e confermato dalla guarigione spontanea di pazienti australiani non trattati con M. ulcerans infezioni (15, 16), suggerendo la possibile istituzione di una strategia per contrastare gli effetti di M. ulcerans nell'host. Questa osservazione rivela un ruolo dell'ospite nel controllo dello sviluppo della lesione. Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi attorno ai siti di M. ulcerans infezione, suggerendo una risposta adattativa locale specifica (10, 17). Le cellule B producono immunoglobulina (Ig) e costituiscono il braccio umorale del sistema immunitario. Questi linfociti hanno ruoli sia proinfiammatori che soppressivi nella fisiopatologia dei disturbi infiammatori della pelle (18). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule B associate alla pelle sono diverse dalle cellule linfonodali B (19). Questa specifica risposta umorale locale può migliorare la difesa e l'immunità locali nel contesto delle malattie infiammatorie croniche della pelle (20). Tuttavia, la risposta umorale locale mediata da anticorpi, per quanto ne sappiamo, non è mai stata studiata nel corso di M. ulcerans infezione, compresa la fase di guarigione spontanea. Utilizzando il nostro modello di topo originale che riproduce le caratteristiche chiave della malattia umana (inclusa la guarigione spontanea dopo la fase ulcerosa, come precedentemente descritto da Marion et al. (8)), abbiamo studiato il ruolo potenziale degli anticorpi locali naturali, riconoscendo il micolattone prodotto da M. ulcerans. I nostri risultati confermano la presenza di questi anticorpi nell'uomo.

RISULTATI

Produzione di Igs cutanee durante M. ulcerans infezione

Abbiamo studiato la risposta umorale locale durante M. ulcerans infezione, incluso il processo di guarigione spontanea, valutando l'espressione del gene Ig attraverso analisi dei livelli di mRNA nei campioni di tessuto cutaneo. Il modello del mouse FVB / N (che mostra la guarigione spontanea) è stato confrontato con il mouse C57BL / 6 (che non mostra tale guarigione). I livelli relativi di mRNA per IgM, IgA e IgG sono rimasti stabili in entrambi i modelli durante le prime fasi dell'infezione (fig. S2). Tuttavia, i livelli di mRNA per tutti e tre gli isotipi Ig sono aumentati significativamente nei topi FVB / N nella fase ulcerosa (giorno 45), raggiungendo un picco durante la fase di guarigione (giorno 75). I livelli di mRNA che codificano questi tre isotipi erano significativamente più alti (P <0,05 per IgM e IgG e P <0,01 per IgA, Mann-Whitney U test) nei topi FVB / N nella fase di guarigione rispetto ai topi C57BL / 6 nella fase necrotica. Abbiamo caratterizzato i profili di Ig dei tessuti infetti stimando le concentrazioni di IgM, IgA e IgG mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Coerentemente con i dati di mRNA, i livelli totali di Ig sono aumentati nei tessuti cutanei dei topi FVB / N durante M. ulcerans infezione (Fig. 1, da A a C). Tuttavia, nonostante l'assenza di chiari cambiamenti nei livelli locali di mRNA Ig nei topi C57BL / 6, abbiamo osservato un aumento della concentrazione di Ig nei tessuti durante M. ulcerans infezione in questi topi (Fig. 1, da A a C). Sono state rilevate differenze nelle concentrazioni di IgM e IgG tra i due ceppi di topo. I livelli di IgG nei topi FVB / N erano due volte quelli nei topi C57BL / 6 (P <0,01, Mann-Whitney U test) sia durante il rossore che nelle fasi ulcerative ed erano 1,6 volte più alti (P <0,05, Mann-Whitney U test) durante il processo di guarigione rispetto allo stadio necrotico, mentre i livelli di IgM erano più alti nei topi C57BL / 6 dallo stadio ulcerativo (2,7 volte più alti; P <0,01, Mann-Whitney U test) fino alla necrosi (7,8 volte superiore; P <0,01, Mann-Whitney U test). Queste differenze, evidenti fin dalle prime fasi, potrebbero riflettere alti livelli di Ig in circolazione. Tuttavia, non sono state rilevate differenze significative nei livelli di queste Ig tra i campioni di siero dei due ceppi di topo durante le prime fasi dell'infezione (Fig. 1, da D a F). Nonostante l'assenza di cambiamenti sistemici rilevabili, le Ig possono accumularsi nei tessuti durante l'infiammazione (come recentemente descritto (21)), potenzialmente tenendo conto delle differenze osservate tra RNA e livelli proteici. Infine, il corso di M. ulcerans l'infezione è associata a una risposta umorale locale, con i seguenti profili di Ig: IgM> IgG> IgA nei topi C57BL / 6 e IgG> IgM> IgA nei topi FVB / N. Sembra quindi che ci sia una specifica firma di immunità umorale del processo di guarigione, in cui prevale l'IgG.

Fig. 1 Quantificazione di IgM, IgA e IgG nei tessuti cutanei nel sito di inoculazione e nel siero.

Cinetica della produzione di Ig, dopo inoculazione con vitale M. ulcerans bacilli, valutata da ELISA quantitativa. (UN per C) Campioni di tessuto cutaneo (n = 5 per ciascun ceppo), per i quali sono state normalizzate le concentrazioni proteiche e (D per F) campioni di siero (n = 5 per ogni ceppo). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 e **P <0,01 (confronto della titolazione di Ig nei topi FVB / N e C57BL / 6 in ogni stadio della malattia; Mann Whitney U test).

Riconoscimento di M. ulcerans lisato da anticorpi IgG locali

Come tutti i micobatteri, M. ulcerans ha un vasto repertorio antigenico (lipoarabinomannano (LAM), proteine ​​di membrana superficiale e vescicole extracellulari) che può innescare la produzione di anticorpi specifici da parte dell'ospite (22). Abbiamo quindi studiato la specificità della produzione locale di Ig, valutandone la capacità di riconoscere M. ulcerans lisato a cellule intere in ELISA. Le IgG erano l'unico isotipo di Ig in grado di legarsi M. ulcerans componenti di lisato (fig. S3A). Questo riconoscimento è diventato più forte con successive fasi di infezione nei topi FVB / N e C57BL / 6 ed è stato massimo durante le fasi di guarigione e necrosi (P <0,01, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi valutato la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti (fig. S3B). Alti livelli di IgG1 che si legano a M. ulcerans componenti di lisato sono stati osservati in entrambi i modelli di topo. Il legame con IgG1 è stato rilevato all'inizio nella fase di arrossamento nei topi FVB / N e successivamente nella fase di edema nei topi C57BL / 6 (P <0,01 per la differenza tra i due modelli di topo nella fase di arrossamento, Mann-Whitney U test). Al contrario, IgG3 ha riconosciuto M. ulcerans componenti di lisato molto debolmente ma allo stesso modo nei due ceppi di topo. La principale differenza tra i topi FVB / N e C57BL / 6 riguardava le sottoclassi di IgG2a / b. IgG2a riconosciuta M. ulcerans componenti in tutte le fasi dell'infezione (dallo stadio ulcerativo a quello di guarigione) nei topi FVB / N ma sembra essere assente nei topi C57BL / 6. L'ultima sottoclasse, IgG2b, riconosciuta M. ulcerans lisare significativamente più fortemente nei topi C57BL / 6, dallo stadio ulcerativo a quello necrotico, rispetto ai topi FVB / N in stadi equivalenti (P <0,05, Mann-Whitney U test). In conclusione, le risposte umorali locali differivano tra i topi FVB / N (modello di guarigione) e i topi C57BL / 6 (nessuna guarigione spontanea). Questa differenza riguardava principalmente due sottoclassi di Ig specifiche: (i) IgG2a, prodotta solo nel modello di guarigione, e (ii) IgG2b, che riconosceva M. ulcerans componenti fortemente solo nel modello C57BL / 6. Questi risultati suggeriscono un ruolo potenziale per IgG2a nel controllo M. ulcerans infezione nel modello di guarigione FVB / N.

Riconoscimento del mycolactone da parte di anticorpi cutanei locali

La capacità dei topi FVB / N di guarire spontaneamente dopo M. ulcerans l'infezione potrebbe essere spiegata, in parte, dalla produzione di anticorpi che riconoscono la tossina batterica, il micolattone. Abbiamo studiato la specificità di questi anticorpi locali per il micolattone nei tessuti della pelle eseguendo ELISA (Fig. 2). Le IgM prodotte localmente in entrambi i ceppi di topo non sono state in grado di riconoscere il miocolattone. IgA, che è noto per proteggere i tessuti (cioè le cellule epiteliali) dalle tossine batteriche (23), legato il micolattone a bassi livelli solo durante lo stadio ulcerativo nei topi FVB / N. Come osservato per M. ulcerans lisato, IgG ha riconosciuto il micolattone ad alti livelli in entrambi i modelli di topo durante l'infezione. Livelli significativamente più alti di riconoscimento del miocolattone da parte delle IgG sono stati osservati nei topi C57BL / 6 nella fase necrotica rispetto ai topi FVB / N nella fase di guarigione (P <0,05, Mann-Whitney U test). Abbiamo quindi analizzato i sottotipi di IgG in ogni fase dell'infezione. Dallo stadio dell'edema allo stadio ulcerativo, IgG1 sembrava essere una sottoclasse in grado di legare il micolattone a livelli più alti nei topi FVB / N rispetto a C57BL / 6, mentre IgG2b sembrava riconoscere il micolattone a livelli più alti e dalle fasi precedenti esclusivamente in C57BL / 6 topi (P <0,01 per IgG1 in FVB / N rispetto a topi C57BL / 6 e P <0,01 per IgG2b nello stadio ulcerativo nei topi C57BL / 6 rispetto ai topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Durante l'ultima fase dell'infezione (necrosi contro guarigione), sono state fatte le stesse osservazioniP <0,05 contro topi FVB / N, Mann-Whitney U test). Il profilo legante il miocolattone di IgG3 era simile in entrambi i modelli di topo. Infine, per quanto riguarda il riconoscimento di M. ulcerans lisato, la principale differenza riguardava la sottoclasse di IgG2a, che sembrava essere specifica per topi FVB / N. Questa sottoclasse ha legato la tossina dallo stadio ulcerativo allo stadio di guarigione. La mancanza del rilevamento di IgG2a nei test eseguiti su topi C57BL / 6 può essere spiegata da una mutazione del gene IgG2a in questi topi (24). Abbiamo eseguito saggi in un altro modello di topo che non mostravano guarigione spontanea (topi BALB / c), in cui il gene IgG2a è presente e funzionale, per escludere la possibilità di esclusione di un fenotipo specifico del ceppo e confermare l'importanza di questa proteina nella guarigione processo e nel legame con il miocolattone. L'anticorpo IgG2a prodotto dai topi BALB / c non ha riconosciuto il miocolattone (vedere fig. S4). Insieme, questi risultati rivelano l'esistenza di diversi profili di riconoscimento del miocolattone tra i modelli murini di guarigione e infezione necrotica. IgG2b sembra essere una sottoclasse specifica in grado di riconoscere M. ulcerans tossina nei topi C57BL / 6, ma non è in grado di controllare efficacemente l'infezione. Al contrario, IgG2a era specifica per il modello di guarigione spontanea (topi FVB / N) e può essere coinvolta nel controllo di M. ulcerans infezione associata a guarigione spontanea.

Fig.2 Rilevazione del legame IgG cutaneo al micolattone mediante ELISA quantitativo.

Ogni pozzetto di una piastra ELISA MaxiSorp è stato rivestito con 3 ng di micolattone e le concentrazioni di Ig dei campioni di tessuto cutaneo sono state normalizzate prima della loro aggiunta alla piastra. Gli anticorpi che si legano al micolattone sulla piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP). (UN) Rilevazione di IgG, IgM e IgA e (B) IgG1, IgG2a, IgG3 e IgG2b che riconoscono il micolattone nel tessuto cutaneo da topi FVB / N e C57BL / 6 in varie fasi dell'infezione (sano, arrossamento, ulcera, necrosi o guarigione) (n = Da 3 a 5 topi per ceppo di topo). Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,1. Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,5, **P <0,01 (Mann-Whitney U test).

Neutralizzazione del micolattone da parte degli anticorpi presenti nella pelle

Abbiamo studiato la capacità di questi anticorpi di riconoscere e neutralizzare il miocolattone, valutando la loro capacità di neutralizzare le proprietà immunomodulanti della tossina. È noto che il micolattone inibisce la produzione di citochine infiammatorie legandosi al translocon Sec61 (25). Abbiamo basato il nostro test di neutralizzazione su questo effetto e quindi incubato i linfociti T stimolati (modello cellulare che produce citochine qui usato come strumento di lettura) con solo il miocolattone o con il miocolattone precedentemente incubato con IgG purificato dalla pelle di topi FVB / N e C57BL / 6 e quindi confrontato la produzione di interleuchina-2 (IL-2) e interferone-γ (IFN-γ) dopo 6 ore. Il contatto tra le cellule T e la tossina ha notevolmente ridotto i livelli di produzione di IL-2 e IFN-γ rispetto al controllo positivo (solo cellule T stimolate) in entrambi i modelli di topo (Fig. 3). Al contrario, la produzione di queste due citochine era simile al controllo positivo per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate dalla pelle di topi FVB / N ma non per le cellule T a contatto con micolattone precedentemente incubate con IgG purificate da Topi C57BL / 6. Pertanto, le IgG prodotte nella pelle dei topi FVB / N durante la fase di guarigione possono neutralizzare la M. ulcerans tossina. Questa neutralizzazione può essere coinvolta nel processo di guarigione.

Fig. 3 Neutralizzazione del micolattone da Ig cutanea da topi FVB / N infetti da M. ulcerans.

CD4+ i linfociti sono stati stimolati con phorbol 12-miristate 13-acetate / ionomicina. Il micolattone è stato usato ad una concentrazione di 4 ng / ml. Igs purificate dalla pelle di (UN) Topi FVB / N o (B) C57BL / 6 topi infetti da M. ulcerans sono stati usati con un rapporto di 10 molecole di Ig per molecola di micolattone. Sinistra: quantificazione IL-2; a destra: quantificazione IFN-γ. I dati mostrati corrispondono a un esperimento eseguito in triplicato (significa ± SD). *P <0,05 e **P <0,01 (Student's t test).

Emersione locale di cellule produttrici di anticorpi durante M. ulcerans infezione

Sulla base dell'ipotesi di una risposta immunitaria umorale locale stabilita durante la guarigione spontanea, abbiamo valutato la rilevanza fisiologica di questo processo studiando la presenza di cellule B che producono anticorpi in vivo. Abbiamo usato la colorazione a quattro colori per analizzare le popolazioni di cellule B da topi FVB / N e identificato tre popolazioni: (P1) cellule con un CD45+, CD19+, B220+ fenotipo corrispondente alle cellule B; (P2) CD45+, CD19+, B220int cellule corrispondenti ai plasmablasti; e (P3) CD45+, CD19, B220int, CD138+ cellule, corrispondenti ai marcatori murini dell'ultimo stadio della maturazione delle cellule B, cellule del plasma (26). La frequenza delle cellule linfoidi (CD45+) aumentato di 37 volte rispetto al controllo della pelle durante il processo di guarigione spontanea (Fig. 4A). Di conseguenza, il numero totale di cellule B è aumentato, ma le proporzioni dei vari sottoinsiemi sono rimaste costanti. L'unica modifica osservata è stata un aumento della proporzione di cellule linfoidi totali rappresentate dal sottogruppo di plasmacellule, che è aumentato dallo 0,04 allo 0,63% (corrispondente ad un aumento di 43-19,732 plasmacellule / g di pelle) durante i primi passi del processo di guarigione spontanea (giorno 55), mentre tale aumento non è stato osservato nella pelle non infetta (controllo), come mostrato in Fig. 4C. La presenza di questo sottotipo di cellula B specifica è stata confermata dall'analisi istologica (Fig. 4B). La proporzione di cellule B simili a B1 (CD45+, CD19+, B220int, CD43+), un sottoinsieme specifico che ha dimostrato di produrre anticorpi specificamente nella pelle (27), aumentato durante la guarigione spontanea, raggiungendo lo 0,07% delle cellule linfoidi totali (vedi fig. S5). La proporzione di queste cellule produttrici di anticorpi è diminuita quando la lesione sembra essere completamente guarita (giorno 75) ma è rimasta più alta di quella nella pelle di controllo. I nostri risultati mostrano quindi che il numero di cellule produttrici di anticorpi aumenta fortemente nella pelle durante il processo di guarigione spontanea, supportando un ruolo per la risposta umorale locale in questo fenomeno, attraverso la produzione di anticorpi anti-micolattone.

Fig. 4 Apparizione di plasmacellule (CD138+) nella pelle durante M. ulcerans infezione nel modello murino FVB / N di guarigione spontanea.

(UN) Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso a quattro colori con la colorazione specifica delle cellule linfoidi totali (CD45+), Cellule B (popolazione P1 = CD45+, CD19+, B220+), plasmablasti (popolazione P2 = CD45+, CD19+, B220int) e plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+). I risultati mostrati qui provengono da un esperimento rappresentativo eseguito in duplicato. (B) Infiltrazione infiammatoria locale (inserto) nel derma di M. ulcerans topi infetti nella fase ulcerosa, tipici di M. ulcerans infezione. ep, epidermide. Immunocolorazione mostra CD138+ plasmacellule (cellule B attivate in grado di produrre anticorpi) nel derma. (C) Analisi di citometria a flusso che mostra l'emergenza di plasmacellule (CD45+, CD19, B220int, CD138+) durante le prime fasi del processo di guarigione spontanea (il controllo è la pelle non infetta). Gli istogrammi mostrano i mezzi ± SD. *P <0,05 (Student's t test). Barre di scala, 160 μm (parte superiore B), 80 μm (parte superiore B, inserto), 100 μm (parte inferiore B) e 20 μm (parte inferiore B, inserto).

Riconoscimento del mycolactone da parte di IgG locali purificate da campioni di biopsia cutanea da pazienti con ulcera di Buruli

Oltre a questa dettagliata caratterizzazione delle Ig anti-micolattone nei topi, abbiamo anche valutato i livelli di queste IgG nei pazienti con ulcera di Buruli. Abbiamo utilizzato ELISA per rilevare gli anticorpi anti-micolattone nei campioni di pelle di pazienti (con o senza diagnosi di ulcera di Buruli) forniti dal Centro di diagnosi e trattamento della Lèpre e dell'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin ). Nel 73% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), è stata diagnosticata la forma più grave della malattia: una lesione ulcerosa (che può essere associata ad altre forme, come edema o placche). Il micolattone è stato riconosciuto dagli anticorpi locali recuperati dalle lesioni del 60% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (9 su 15) (tutti presentanti un'ulcera), mentre il micolattone è stato rilevato in un solo campione di biopsia dai pazienti di controllo (non diagnosticato Ulcera di Buruli; P <0,05, Mann-Whitney U test; Fig. 5). Da allora questo particolare paziente ha sviluppato un carcinoma a cellule squamose, una malattia che si verifica dopo alcune lesioni dell'ulcera di Buruli (27, 28). Pertanto, non possiamo escludere la possibilità che questo paziente abbia già avuto una lesione a causa M. ulcerans infezione. Infine, potrebbero esserci diverse ragioni per la mancanza di rilevazione di IgG leganti il ​​miocolattone nel 40% dei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR (6 su 15) come il tipo di lesione, il sito di campionamento (distanza dal sito di infezione) e la durata del trattamento. Infine, forniamo qui la prima dimostrazione che l'organismo umano può generare un'efficace risposta umorale che coinvolge la produzione di anticorpi che riconoscono il miocolattone durante M. ulcerans infezione.

Fig. 5 Rilevazione di Ig cutanee che si legano al micolattone nelle lesioni dei pazienti con diagnosi di ulcera di Buruli.

I pozzetti sono stati rivestiti con mycolactone e gli anticorpi che si legano al mycolactone nella piastra sono stati riconosciuti dagli anticorpi secondari coniugati con HRP. Il CDTUB di Pobè (Benin) ha fornito campioni di biopsia da pazienti con ulcera di Buruli sospetta e / o confermata dalla PCR. Nei pazienti con ulcera di Buruli confermata dalla PCR, sono state eseguite biopsie su lesioni attive. Pertanto, non è stato possibile identificare i pazienti che successivamente manifestano una guarigione spontanea. Il limite di rilevazione era un'assorbanza di 0,150. **P <0,05 (Mann Whitney U test). Gruppo dell'ulcera di Buruli, n = 15; gruppo di controllo, n = 19. OD, densità ottica.

DISCUSSIONE

L'ulcera del buruli è una malattia tropicale trascurata che rimane la terza malattia micobatterica più comune al mondo. Questa malattia della pelle debilitante è causata da M. ulcerans, che produce una tossina lipidica, il micolattone, il principale fattore di virulenza del bacillo. Senza trattamento, le lesioni possono evolvere in ulcere cutanee croniche. Tuttavia, queste gravi lesioni possono guarire spontaneamente, come osservato nel 5% dei casi, suggerendo che i meccanismi per contrastare gli effetti di M. ulcerans può svilupparsi nell'host. Nonostante lo sviluppo di modelli animali, i meccanismi del processo di guarigione spontanea rimangono poco chiari. In precedenza avevamo mostrato (i) l'assenza di una firma di risposta cellulare immunitaria sistemica e (ii) un debole coinvolgimento della risposta immunitaria cellulare locale nel passaggio dall'infezione acuta a quella cronica (8). Questi risultati evidenziano le conseguenze locali della malattia, osservate con altri approcci (7, 29). Recenti studi istologici hanno dimostrato che le cellule B si accumulano in gruppi intorno al sito di M. ulcerans infezione (10). Sono stati osservati infiltrati di cellule B in condizioni infiammatorie croniche della pelle, tra cui la leishmaniosi cutanea e la dermatite atopica (30, 31). Il dibattito sul ruolo pro o antinfiammatorio delle cellule B della pelle continua, ma queste cellule hanno dimostrato di essere coinvolte nella risoluzione dell'infiammazione cutanea in un modello murino di infiammazione simile alla psoriasi (32). Inoltre, oltre a produrre localmente anticorpi, è stato dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo nel processo di guarigione delle ferite (33).

In questo contesto, abbiamo usato il nostro modello murino di guarigione spontanea per studiare la risposta umorale in tutte le fasi M. ulcerans infezione, compresa la guarigione spontanea. Abbiamo dimostrato la presenza di cellule B che producono anticorpi durante l'infezione e il loro aumento del numero durante l'infezione, raggiungendo un picco durante le prime fasi della guarigione spontanea (il passaggio dall'ulcerazione alla guarigione). Abbiamo rilevato Igs in grado di riconoscere la tossina lipidica di M. ulcerans, mycolactone, in tutte le fasi dell'infezione. Queste Ig sono state trovate nella pelle dei topi infetti ma non nei loro sieri. Forniamo anche la prima dimostrazione della presenza di queste Ig nei campioni di biopsia di pazienti con ulcera di Buruli. Nessun anticorpo anti-micolattone è mai stato rilevato nel siero di pazienti. Collettivamente, questi risultati evidenziano l'esistenza di una firma umorale distinta in risposta a M. ulcerans infezione, con la produzione specifica di pelle di anticorpi contro il miocolattone.

Sembra probabile che la guarigione spontanea osservata nei topi FVB / N sia innescata da fattori genetici dell'ospite. In particolare, i topi FVB / N presentano modifiche di due elementi coinvolti nella risposta immunitaria: (i) una carenza nella secrezione del componente 5 del complemento e (ii) un polimorfismo NLRP. Tuttavia, abbiamo precedentemente osservato che i topi AKR, che ospitano la prima di queste modifiche, (dati non mostrati) e i topi BALB / c (8), che ospitano la seconda mutazione, hanno caratteristiche simili ai topi C57BL / 6, senza guarigione spontanea. Questo ci ha portato a studiare il coinvolgimento della risposta immunitaria mediata dagli anticorpi nel processo di guarigione spontanea. Le Ig specifiche prodotte localmente e in grado di riconoscere M. ulcerans i componenti, incluso il miocolattone in particolare, possono contribuire al controllo dell'infezione osservata durante la guarigione spontanea. Abbiamo studiato questa possibilità, valutando la capacità delle sottoclassi di IgG di riconoscere M. ulcerans componenti. Abbiamo taggato una sottoclasse specifica di Ig, IgG2a, che è nota per diffondersi facilmente nella pelle (23). È stato riportato che questa sottoclasse è altamente efficace nella neutralizzazione delle esotossine batteriche, come la tossina difterica, l'enterotossina B e Bacillus anthracisTossina associata34), è stato prodotto solo nel modello di guarigione spontanea e sembra essere la firma di questo modello in termini di riconoscimento del miocolattone. Abbiamo anche scoperto che le IgG riconoscono M. ulcerans i componenti che sono stati isolati dalla pelle dei topi FVB / N sono stati in grado di neutralizzare l'attività tossica del micolattone. Nessun altro anticorpo neutralizzante il miocolattone è stato identificato in nessun altro modello murino.

La neutralizzazione delle tossine batteriche è una parte importante della risposta immunitaria umorale alle infezioni batteriche (34). I nostri risultati suggeriscono quindi che la neutralizzazione del miocolattone può essere la chiave del processo di guarigione spontanea dell'ulcera di Buruli. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'ambiente tissutale nei topi FVB / N durante la guarigione spontanea ha indotto un passaggio alla riduzione della produzione di micolattone da M. ulcerans, nonostante cariche batteriche simili. Questo interruttore potrebbe probabilmente essere all'origine della capacità degli anticorpi cutanei di neutralizzare il rimanente micolattone, portando al controllo della risposta infiammatoria acuta e al miglioramento della riparazione dei tessuti, come abbiamo precedentemente osservato (8). Infine, il fenomeno della neutralizzazione può bloccare l'attività del miocolattone in vari modi: Probabilmente sarebbe più difficile per il micolattone collegato a un anticorpo accedere o inibire bersagli intracellulari noti, come il translocon Sec61, (i) se il complesso anticorpo-micolattone non può attraversare le membrane o (ii) se l'anticorpo ostacola il legame del micolattone. È quindi ragionevole presumere che (iii) gli anticorpi neutralizzanti possano aiutare ad eliminare la tossina indirizzandoli alle cellule fagocitiche.

L'esistenza di anticorpi anti-micolattone apre nuove entusiasmanti prospettive di innovazioni nella diagnosi, nel trattamento e nello sviluppo di vaccini in risposta alla sfida scientifica lanciata dall'Organizzazione mondiale della sanità. Al momento non esiste un semplice strumento diagnostico adatto all'uso nelle aree rurali dei paesi in via di sviluppo. Questa situazione è particolarmente deplorevole, poiché le prime fasi dell'ulcera di Buruli possono essere trattate localmente, mentre il trattamento delle fasi successive richiede un ampio intervento chirurgico in ospedali più grandi, con periodi di ricovero più lunghi, a spese molto maggiori. Lo sviluppo di un nuovo strumento diagnostico, come un test basato sulla produzione di anticorpi monoclonali, potrebbe essere più appropriato per queste regioni endemiche. Inoltre, estrapolando dall'uso di anticorpi neutralizzanti per ampliare lo spettro di trattamento per veleni tossici, gli anticorpi neutralizzanti il ​​miocolattone potrebbero anche essere potenzialmente utili nelle strategie per il trattamento dell'ulcera di Buruli.

MATERIALI E METODI

Dichiarazione etica per esperimenti su animali e uso di tessuti umani

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti conformemente alle linee guida nazionali (articoli da R214-87 a R214-90 del “codice rurale” francese) e linee guida europee (direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 su la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della regione della Loira, con il protocollo n. APAFIS8904. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni nella casa degli animali dell'Ospedale universitario di Angers, in Francia (accordo A 49 007 002). L'uso di campioni di biopsia di pazienti a scopo di ricerca è stato approvato dal comitato di ricerca del governo del Benin (Ministero della Salute, Repubblica del Benin, accordo numero 2893).

M. ulcerans sforzo e inoculazione

M. ulcerans il ceppo 01G897 è stato originariamente isolato da pazienti della Guyana francese dal team di batteriologia dell'Angers Hospital (35) e conservato nel nostro laboratorio da questo momento. È stata preparata una sospensione batterica, come precedentemente descritto (8, 22) e la sua concentrazione è stata regolata su 2 × 105 bacilli acido-resistenti / ml per un'inoculazione di 1 × 104 bacilli in 50 μl nelle code di topi consanguinei C57BL / 6 e FVB / N di 6 settimane (topi Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) e BALB / c (Charles River Laboratories, Saint-Germain-Nuelles, Francia ).

Mycolactone

Il malese M. ulcerans Il ceppo 1615 era originariamente isolato dalla biopsia della pelle umana dalla Malesia (36) e somministrato da P. Piccolo laboratorio nel 2005. Il ceppo è stato coltivato su terreno solido 7H10 integrato con OADC al 10% (acido oleico, destrosio, catalasi; Difco, Becton-Dickinson) a 30 ° C per 45 giorni. Il micolattone A / B è stato quindi purificato da batteri interi, come precedentemente descritto (37). Il micolattone è stato diluito ad una concentrazione di 3 mg / ml in etanolo assoluto e conservato al buio in provette di vetro ambrato a -20 ° C.

Preparazione del tessuto del topo e campionamento del siero

I campioni di pelle di topi infetti con lesioni visibili (con arrossamento, edema, ulcera, necrosi o guarigione) sono stati eliminati (abbiamo rimosso 1 cm di tessuto cutaneo intorno alla lesione) e frantumati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con EDTA cOmplete -free cocktail (Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN). Le sospensioni risultanti sono state centrifugate a 3500g per 10 minuti a 4 ° C. I surnatanti sono stati conservati a -80 ° C. I campioni di sangue sono stati raccolti mediante puntura retro-orbitale in ogni fase clinica dell'infezione prima dell'escissione della coda. Il sangue è stato centrifugato a 1500g per 10 minuti per isolare il siero, che è stato recuperato e conservato a -80 ° C.

Preparazione di tessuti per biopsia umana

I campioni di biopsia cutanea sono stati forniti dal Centre de Diagnostic et de Traitement de la Lèpre et de l'Ulcère de Buruli (CDTLUB) di Pobé (Benin). I campioni di biopsia sono stati frantumati in PBS integrato con inibitori della proteasi (cocktail senza EDTA completo, Roche), con un TissueRuptor (QIAGEN), come descritto per i tessuti di topo. The resulting suspensions were centrifuged at 3500g for 10 min at 4°C. The resulting supernatants were stored at −80°C.

Quantitative PCR analysis

Tail skins from infected mice were excised and immediately placed into RNAlater (QIAGEN) and stored at −20°C. Skin tissues were crushed and homogenized with a TissueRuptor (QIAGEN), and total RNA was then purified with the RNeasy fibrous tissue midi kit (QIAGEN). The first-strand complementary DNA was synthesized from 750 ng of RNA with the M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative PCR was performed to quantify the levels of IgM, IgA, and IgG mRNA. Specific gene expression was calculated by the relative expression method (using actin as the calibrator). The sequences of the primers and probes used are provided in table S1.

Quantification of proteins and Igs

Total protein levels were determined with a colorimetric assay (Protein Assay Dye Reagent), according to the manufacturer’s instructions, with Dye Reagent Concentrate Refill (5000006, Bio-Rad) and a standard curve (bovine gamma globulin, kit 1, 50000001, Bio-Rad). Mouse tissue samples were normalized to identical protein concentrations before testing. IgA, IgM, and IgG were quantified in crushed tissue samples and mouse sera by ELISA kit from eBioscience, according to the manufacturer’s recommendations (Mouse IgA Ready-SET-Go, 88-50450; Mouse IgM Ready-SET-Go, 88-50470; Mouse IgG Ready-SET-Go, 88-50400).

Ig purification

Tail skins from infected mice were excised and crushed with metallic beads and a TissueRuptor (QIAGEN) in an equal volume of PBS supplemented with proteases inhibitor (cOmplete EDTA-free cocktail, Roche) and protein A/G IgG Binding Buffer (Thermo Fisher Scientific). The resulting suspensions were centrifuged at 8000g for 45 min at 4°C. Ig were then purified with a NAb protein A/G spin column (Thermo Fisher Scientific), followed by a NAb protein L spin column (Thermo Fisher Scientific), according to the manufacturer’s instructions.

Detection of antibodies directed against M. ulcerans lysate by ELISA

M. ulcerans strain 01G897 lysate was prepared as previously described (8). M. ulcerans lysate (0.5 μg), diluted in 100 μl of sodium bicarbonate buffer (50 mM (pH 9.6)), was immobilized in 96-well ELISA plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by overnight incubation at 4°C. The coated plates were washed four times with 0.05% Tween 20 in PBS and were then saturated by incubation with 5% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. The plates were washed a further four times and were then incubated with crushed tissue samples with normalized protein contents in 1% skimmed milk powder in PBS for 2 hours at room temperature. After four washes, antibodies directed against M. ulcerans lysate were detected with horseradish peroxidase (HRP)–conjugated secondary antibodies diluted 1:500 in 1% skimmed milk powder in PBS. The plates were incubated with the secondary antibodies (table S1) for 1 hour at room temperature and were then washed four times. The KPL SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate was used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at λ = 450 nm (with a reference at λ = 570 nm) (Multiskan Ascent, Thermo Fisher Scientific); results are expressed in optical density units.

Detection of mycolactone-binding antibodies

ELISA was performed to detect antibodies directed against mycolactone present in human tissues, mouse cutaneous tissues, and mouse sera. Mycolactone A/B (3 ng) in absolute ethanol was immobilized in 96-well plates (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp 456537, Thermo Fisher Scientific) by evaporating off the ethanol for approximately 2 hours in the dark; coated plates were stored at −20°C in the dark for several weeks. They were incubated overnight at 4°C with 5% skimmed milk powder in PBS. The protein concentrations of mouse tissue samples were normalized, mouse serum samples were diluted 10-fold, and human samples were diluted twofold. The plates were washed three times in 0.05% Tween 20 in PBS and were then incubated with diluted samples for 2 hours at room temperature. The plates were washed four times and incubated with HRP-conjugated secondary antibodies (goat anti-mouse IgG1, goat anti-mouse IgG2a, goat anti-mouse IgG2b, goat anti-mouse IgG3, and goat anti-mouse IgG/IgA/IgM (H + L)) (diluted 1:1000 in 1% skimmed milk in PBS for 2 hours at room temperature) (table S1). Bound antibodies were revealed using the SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL) used for secondary antibody detection, and 1 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm and was expressed in optical density units.

Neutralizing activity assay

CD4+ T cells were isolated from the spleens of C57BL/6 mice by magnetic sorting (MACS technology kit 130-104-454), according to the manufacturer’s instructions (Miltenyi Biotec). The purity of CD4+ T cell preparations was determined by flow cytometry, with phycoerythrin-conjugated anti-CD4 monoclonal antibody (eBioscience) and fluorescein isothiocyanate–conjugated anti-CD3ε monoclonal antibody (eBioscience). CD4+ T cells (200,000 cells per well; 100 μl per well) were used to seed 96-well plates. Purified IgG from infected tissue of five mice was diluted in RPMI 1640 (Lonza) supplemented with 10% fetal calf serum (Eurobio), 2 mM glutamine, streptomycin (10 U/ml), and penicillin (100 U/ml) (Lonza). Under some conditions, these were mixed with mycolactone A/B (8 ng/ml) in a 10:1 ratio in a tube and incubated at 37°C with continuous stirring for 45 min. Fetal calf serum was added to the preparation at a final concentration of 10%, followed by phorbol 12-myristate 13-acetate (10 ng/ml) and 1 nM ionomycin. This preparation (100 μl per well) was then added to CD4+ T cells. Cells were incubated for 6 hours at 37°C under an atmosphere containing 5% CO2, and supernatants were collected and stored at −20°C. IL-2 and IFN-γ were quantified by ELISA (eBioscience), according to the manufacturer’s instructions (mouse IL-2 Ready-SET-Go, 88-7024; mouse IFN-γ Ready-SET-Go, 88-7314).

Immune cell isolation and flow cytometry analysis

Tail skin was excised from three mice. Tissues were digested with the Multi Tissue Dissociation kit 1 from Miltenyi Biotec (reference 130-110-201), according to the manufacturer’s instructions. A four-color staining method was used to identify B cell subsets: CD45+, CD19+, B220+, and CD138+ cells were labeled with APC (allophycocyanin) cyanidine7 anti-CD45 (BD Biosciences), phycoerythrin anti-CD19 (BD Biosciences), (phycoerythrin-cyanidine7) anti-CD45R/B220 (BD Biosciences), and BB515 anti-CD138 (BD Biosciences) antibodies; dead cells were excluded from the analysis by staining with 7AAD (7-amino actinomycin D) (Miltenyi Biotec). Flow cytometry analysis was performed on a MACSQuant analyzer. Results were analyzed with FlowLogic software.

Immunohistology

Tails from infected mice were excised and immediately fixed by incubation in 4% paraformaldehyde for 24 hours. Tissues were then embedded in paraffin and cut into 5-mm-thick sections. Hematoxylin phloxine saffron staining was performed according to the manufacturer’s protocol. Immunohistochemical staining was performed with an anti-CD138 polyclonal antibody (Thermo Fisher Scientific ref. no. 36-2900) diluted 1:250 according to the manufacturer’s protocol.

Statistical analysis

The data, presented as means and SE, were analyzed with GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Soſtware, San Diego, CA, USA). Different pathological stages in each mouse strain were compared in Kruskal-Wallis tests with Dunn’s multiple comparison test. FVB/N and C57BL/6 (as well as BALB/c for the ulcerative stage) mice were compared, at each clinical stage, with Mann-Whitney U tests. Patients with buruli ulcer and controls were analyzed in Mann-Whitney U tests. A Student’s t test was used to compare flow cytometry data.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/9/eaax7781/DC1

Supplementary Materials and Methods

Table S1. HRP-conjugated secondary antibodies used in this study.

Table S2. Primer sequences used in this study.

Fig. S1. Macroscopic appearance of lesions in FVB/N and C57BL/6 mice infected with M. ulcerans.

Fig. S2. Ig gene expression in the cutaneous tissues of mice during the course of M. ulcerans infection.

Fig. S3. Detection of cutaneous IgG binding to M. ulcerans lysate by quantitative ELISA.

Fig. S4. Cutaneous IgG2a and IgG2b binding mycolactone from C57BL/6, FVB/N, and BALB/c mice at the ulcerative stage.

Fig. S5. Quantification of local B1-like subset of B cells in the skin during M. ulcerans infection.

Fig. S6. Markers of murine B cell subsets used for flow cytometry analysis.

References (38, 39)

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is not for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank all members of the SCAHU and PACEM platforms and Lore Dubesset for technical assistance. Funding: This work was supported by INSERM, Atip Avenir program, Fondation Raoul Follereau–France, Agence Nationale de la Recherche (ANR) BU_SPONT_HEAL project (InfectEra project) and MYCOPARADOX ANR project, Angers University (REPAIR project), Société Française de Dermatologie, and the Pays de la Loire region (STARTER project). J.M., L.A., and A.A. acknowledge support from the Laboratoire d’Excellence Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases (grant no. ANR-10-LABX-62-IBEID) and the ANR under the “Investments for the Future” program (grant no. ANR-10-IAHU-01). A.A. acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale (grant no. DMI20091117308). Author contributions: M.F., L.A., A.A., and E.M. conceived and designed the experiments. M.F., A.P., J.M., M.R.-S., A.D., L.E., J.-P.S.-A., A.C., and E.M. performed the experiments. M.F., A.P., J.M., F.K., M.R.-S., Y.D., P.J., J.-P.S.-A., A.C., F.A., L.A., A.A., and E.M. performed data analysis. M.F., J.M., F.K., M.R.-S., F.A., Y.D., P.J., L.A., A.A., and E.M. wrote the paper. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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